Name: Live-Imaging von Drosophila Larven Neuroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Lernen Sie die Live-Imaging-Methode für Drosophila-Larvenneuroblasten zur Untersuchung asymmetrischer Stammzellteilungen. Diese Technik liefert mechanistische Einblicke in die Entwicklung des ZNS.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung an den National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) und eine Lenfant Biomedizinische Postdoctoral Fellowship an DAL ausgezeichnet unterstützt.

1. Herstellung von Materialien Erforderlich zum dritten Larven Larven Brains Explantation <ol><li> Bereiten Sie Werkzeuge für die Mikrodissektion erforderlich. <ol><li> Forge sezieren zwei Werkzeuge (ein Skalpell und ein Haken), indem zunächst eine einzelne Sektions Stift in jeder Stifthalter. Sichern Sie sich die Stifte fest mit der Hand oder mit einer Zange (Abbildung 1C). </li><li> Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um ein Seziersaal Pin auf einem etwa 120 ° Winkel biegen. Tun Sie dies unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass die obere Hälfte des Stiftes liegt flach, wenn der Stift Halter in der Hand hielt. Dieses Tool wird wie ein Skalpell in der Hand nach unten oder in Scheiben schneiden durch das Gewebe verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um den zweiten Stift in einen Haken, die verwendet werden, um zu halten und abkratzen Gewebe wird zu biegen. </li><li> Cover jede Sezieren Werkzeug mit einer Pipettenspitze, die Werkzeuge vor Beschädigungen zu schützen. Mit Sorgfalt können gut ausgebildete Werkzeuge für die Präparation auf unbestimmte Zeit verwendet werden. Beschädigte oder verformte Pins Bedarf ersetzen. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Bereiten Sie sezieren Medium. <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, verdünnen das Antibiotikum-Antimykotikum in Ergänzung des Schneiders Kulturmedium. Schwenken Sie die Medien, um den Zuschlag zu integrieren. </li><li> Bereiten mehrere 5 ml Aliquots der ergänzten Medium. Speichern Sie alle Medien bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Warm eine 5 ml-Aliquot ergänzt Medium auf Raumtemperatur. Zeichnen Sie das Medium in einer sterilen 5 ml Spritze und Schrauben auf einer sterilen 0,2 um Spritzenfilter. </li></ol></li><li> Wählen Larven für die Präparation. Verwenden Sie ein Sezieren Sonde auf Crawling dritten Larvenstadium auswählen, wie das Gehirn wird am einfachsten sein, sezieren. Optional: Kaution Larven auf einem Wein Agar-Platte. Hinweis: Verwenden Sie keine überfüllten Ampullen oder Flaschen mit &quot;Nassfutter&quot;, wie diese dazu neigen, zweiten oder ersten Larvenstadium zu zwingen, vorzeitig kriechen. Hinweis: Einige genetischen Hintergründen erfordern wird mit jüngeren Larven. Dies betrifft nicht das Protokoll, aber machen die dissection schwieriger. </li></ol> 2. Dissection des Zentralnervensystems <ol><li> An einem einzigen Objektträger aus Glas, erstellen Sie zwei Pools von 50 ml warmem Seziersaal Medien von etwa 3 cm getrennt. Ein Pool wird für grobe Zerlegung und andere für die Fein Dissektion (Abbildung 1C) verwendet werden. </li><li> Transfer mehrere Larven einem der Medientropfen. </li><li> Bewegen Sie das Deckglas mit Larven auf einem Binokular. Zoom in den Pool mit den Larven, so dass die vorderen und hinteren Enden der Larven sind erkennbar. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den mittleren Bereich einer einzigen Larve erfassen. Nehmen Sie eine zweite Zange in der anderen Hand und fassen die Larve in der Nähe der gleichen Region. Ziehen Sie die beiden Pinzetten auseinander reißen, um sanft die Larve in der Hälfte. Wiederholen Sie die obigen beiden Schritte für alle Larven auf dem Deckglas. </li><li> Entsorgen der hinteren Hälften der Larvenkörper durch Übertragung auf ein Gewebe. </li><li> Zoom in eine Larve, so dass the vorderen mouthhooks sind deutlich sichtbar. Mit beiden Zangenpaaren, um einen kleinen Einschnitt oder eine Kerbe, die auf gegenüberliegenden Seiten der Larven mouthhooks zwischen dem dritten und ersten vorderen Brust denticle Bands zu schaffen. </li><li> Fassen Sie die mouthhooks mit der Zange in der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um vorsichtig abziehen Nagelhaut in einer anterior-to-posterior-Richtung. Fahren Sie langsam abziehen Nagelhaut, bis das zentrale Nervensystem ausgesetzt ist. </li><li> Isolieren des zentralen Nervensystems von dem Rest der Larve durch Reißen Gewebe mit der Zange. Seien Sie vorsichtig, nicht auf das zentrale Nervensystem stören. Critical Schritt: auf das zentrale Nervensystem zu zerren Sie nicht! Entsorgen Sie beschädigte Proben mit einem zerrissenen Bauchmark (2A) oder verzerrten optischen Loben (2B und 2B &#39;). </li><li> Wiederholen Sie die obigen beiden Schritte für alle Larven auf dem Deckglas. Übertragen Sie das gesunde Gewebe explantiert, um dieSekunden (clean) Pool von Medium auf dem Deckglas für die Fein Dissektion der Bühne. </li><li> Verwenden Sie die Werkzeuge, um Sezieren Stift aus dem Gehirn beseitigen die peripheren Gewebe (z. B. Augen-, Flügel-und Beinscheiben). Schieben Sie das Skalpell zwischen der wollte (Gehirn) und dem unerwünschtes Gewebe, Pinning das Bindegewebe auf die Deckgläser. Verwenden Sie den Haken, um sanft zu necken entfernt die unerwünschte Gewebe, während Sie gleichzeitig die Tasten Skalpell, um das Deckglas in Säge-ähnlichen Bewegungen. </li><li> Critical Schritt: Arbeiten Sie langsam und bewusst, um alle Scheiben von jedem Gehirn zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, nicht die Morphologie des Gehirns stören. Ein gesundes Gehirn haben eine intakte Bauchmark und symmetrisch, rund optischen Loben (Abbildung 2C). </li></ol> 3. Montage Explantierte Gehirne für Live-Imaging <ol><li> Kehren Sie ein 50 mm gasdurchlässigen Kulturschale mit der Klarsichtfolie nach oben (2D). Drücken Sie die Spritze, um einen kleinen Tropfen (etwa 30 ul) Medium auf t einzahlener Mitte der Schale. </li><li> Übertragen der isolierten Hirn, eine zu einem Zeitpunkt, zu dem Mediumtropfen auf dem Teller. Verwenden Sie den Haken Werkzeug aufnehmen ein Gehirn unter den optischen Loben. Alternativ können Sie Pinzette Axone aus dem Bauchmark vorstehenden erfassen. </li><li> Sammeln 5-10 Gehirne in der Dropdown Medium. Tauchen Sie die Gehirne mit den Seziersaal Stift Tools, um einzelne Gehirne, um den Boden der Tropfen Medium, wie viele von ihnen vorantreiben wird am Meniskus (2E) gefangen werden. </li><li> Richten Sie die Gehirne mit den Seziersaal Stift Werkzeuge, um Gehirn abhängig von der NBS, die abgebildet werden (Abbildung 3A) auszurichten. Um das Bild der dorsale BS, legen Sie das Bauchmark nach unten (entlang der Membran). Um die Bild die anterio-ventralen NBs, legen die Gehirne mit dem Bauchmark nach oben (weg von Membran). Richten Sie die Köpfe, so dass alle die ventralen Nervenstränge in die gleiche Richtung in der xy-Ebene. </li><li> Verwenden Sie eine Spritze oder Kunststoffübertragung pipette bis 4 Halogenkohlenwasserstoff (HC) Öltropfen (30 &amp;mgr; l jeweils) auf der gasdurchlässigen Membran zu platzieren. Das Volumen jeder Tropfen Öl sollte äquivalent zueinander und zu dem Mediumtropfen sein. Raum die Tropfen Öl in den vier Ecken eines Deckglases um den Tropfen Kulturmedium zentriert entsprechen. Wenn Sie fertig sind, werden die fünf Tropfen (vier Tropfen Öl und ein Tropfen des Mediums in der Mitte) die fünf Facetten auf westlichen Stil Würfel (3B) ähneln. </li><li> Senken Sie # 1.5 22 mm Deckglas auf der Versammlung, dass er trifft alle 5 Tropfen in der gleichen Zeit. Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Druck über die Proben reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass sie gestört werden. Warten Sie ca. 3 Minuten, da das Öl-und Mittel unter dem Gewicht des Deckglases zu zerstreuen. Eine kreuzförmige Gestalt Medien bilden (Fig. 3C und 3D). </li><li> Critical Schritt: Senken Sie die Deckglas auf der Oberfläche des Gehirns, indem überschüssiges Medien mit einem Seidenpapier Docht (Figure 3C). Tun Sie dies, während Sie die Probe unter dem Binokular. Als Medium wird entfernt, wird das Deckglas zu senken. Stoppen Sie, wenn die Deck berührt die Gehirne. Nicht über-Docht da diese Gewebe Verzerrung oder Gehirn Explosionen verursachen. </li><li> Wenn Bildgebung Rücken NBs (3E), gehen Sie zu Schritt 3.9. Wenn Abbildungs ​​anterio-ventralen NBs, muss die Deck leicht (durch leichtes Antippen mit Zange) in Richtung der Bauchmark Spitzen verschoben werden. Dies bewirkt, dass das Gehirn zu drehen, die die Hirnlappen bringt in direktem Kontakt mit dem Deckglas zu Bildgebung (Fig. 3F) zu erleichtern. </li><li> Verschließen Sie die Kammer, die durch umlauf das Deckglas mit geringen Mengen an Halogenkohlenwasserstofföl (3D). Überschüssiges Öl sickert aus dem Deckglas sollte minimiert und mit einem Papiertuch abgetupft werden entfernt. </li></ol> 4. Live-Imaging von Central Brain Neuroblasten Hinweis: Für diese Arbeit, eine Nikon Eclipse-Ti Spinnplattenkonfokalen Mikroskop (inverses Mikroskop) wurde für die Bildgebung verwendet werden; Details unserer Einrichtung haben bisher veröffentlichten 31 wurde. Alternativ kann die Probe unter Verwendung eines aufrechten System abgebildet werden. <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas montiert, direkt über den Gehirnen. Dies wird Ihnen helfen zu zentrieren das Ziel direkt über der Probe. </li><li> Kritischer Schritt: Halten Gehirn bei einer konstanten Temperatur von 25 ° C Inkubator mit einer Stufe. Sanft in die Bühne positionieren Sie den Inkubator Probe montiert und decken die Kammer mit dem Deckel. </li><li> Suchen zentrale Gehirn NBs Durchlicht durch die Konzentration auf den großen, runden Zellen, die in den zentralen und medialen Bereiche der optischen Loben befinden, nicht verwenden Auflicht-Fluoreszenz. Dies wird leichter mit der Praxis. Es ist sehr wichtig, um die Probe zu der geringsten Menge an Licht wie möglich freizulegen. Verschwenden Sie keine Zeit Bildgebung Gehirn, die beschädigt sind. </li><li> Einmal im Ort, um schnelle Aufnahmen mit dem konfokalen zuBestimmung der richtigen Lage und Tiefe. Grenztiefe auf den ersten 10-15 um. Passen Sie bei Bedarf, und einen weiteren Testbild. <ol><li> Optionaler Schritt: Sammeln Sie eine Test-Film mit dem Bauchmark, um sicherzustellen, gibt es keine xy Drift. Wenn Drift erkannt wird, warten Sie 15-30 Minuten für die Probe zu begleichen. Wenn die Drift nicht in 30 min absetzen, bereiten eine neue Probe. Wichtige Drift kann in der Regel wieder auf die Zugabe von überschüssigem Öl zurückgeführt werden, oder die ungleiche Größe der Öltropfen während der Montage. </li></ol></li><li> Um eine axiale Drift (z-Drift) zu beseitigen verwenden eine kontinuierliche automatische Fokussierung Gerät, eine Infrarot-LED verwendet. Alternativ manuell die Brennebene zu korrigieren. </li><li> Sobald ein NB von Interesse identifiziert wird, gehen Sie mit bildgebenden Regime. Wie bei allen Live-Cell-Imaging, die Menge von Laserlicht, Belichtungszeit, Kamera Binning, Objektivvergrößerung, Zeit-und / oder z-Intervall Schritt müssen alle empirisch für einen bestimmten Versuch, die Frage zu beantworten, bei der Hand optimiert werden. Das Ziel ist es, Licht Damm minimierenAlter, während immer noch nützliche Daten sammeln. Siehe Diskussion für zusätzliche Hinweise. <ol><li> Bild das gesamte Volumen des NB durch Sammeln von 12-14 Bildern 1 um die z-Achse angeordnet sind. Stellen Sie die Zeitauflösung, einzelne oder mehrere Zellzyklen der gleichen NB zu erfassen. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie 10-30 Sekunden-Intervallen für Einzelzellzyklus-Bildgebung und 1-3 Minuten-Intervallen für mehrere Zellzyklen. </li></ol></li><li> Critical Schritt: Bestätigen Sie, dass die Probe durch die Überwachung der gesunden Dauer der Mitose ist. Wenn Mitose dauert mehr als 15 Minuten, gehen Sie zu einem anderen Gehirn. Ein gesundes Gehirn viele NBs im gleichen Sichtfeld zeigen läuft mehrere Runden von Mitose. Beachten Sie, dass jede Zelle Zyklus ist etwas länger als der vorherige aufgrund von Lichtschäden. </li><li> Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Inkubation Kammer, und entsorgen Sie alles, aber die gasdurchlässige Kultivierung Gerichte. Mit 95% Ethanol spülen Kulturschale Oberfläche und gut wischen mit einem Tuch. Vorgang zweimal wiederholen. </li&gt; </ol> 5. Vorbereitung der Gehirne für Immunfluoreszenz <ol><li> Sammeln 20 oder mehr explantierten Gehirn in ein 1,5 ml Röhrchen, enthaltend etwa 0,2 ml Medium, ergänzt. </li><li> Entfernen Medium aus dem Rohr und spülen Gehirne einmal mit 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS mit 0,3% Triton X-100). Lassen Gehirn setzen sich auf dem Boden der Röhre zwischen allen Austausch von Flüssigkeit. Der Triton X-100-Detergens verwendet wird, um das Gewebe zu permeabilisieren. Spülen typischerweise in weniger als 30 sec; entfernen Sie einfach den PBSTx einmal Gehirne wurden dem Boden der Röhre angesiedelt. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml 9% Elektronenmikroskopie Grad Para in PBSTx verdünnt. Inkubieren mit Nutation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Fixiermittel nach gefährlichen Abfällen Vorschriften. </li><li> Mit 0,5 ml PBSTx 15 min Waschen der Proben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBSTx zwei weitere Male. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml PBT (PBS, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Tween-20). Inkubieren mit Nutation für 1 h bei Raumtemperatur. Dieser Schritt Blöcke die unspezifische Bindung des Antikörpers an das Gewebe. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml primären Antikörper in PBT mit 4% normalem Ziegenserum (NGS) ergänzt verdünnt. Inkubieren mit Nutation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen oder speichern Sie die verdünnten primären Antikörpers. </li><li> Mit 0,5 ml PBT 15 min Waschen der Proben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBT zwei weitere Male. </li><li> Ersetzen der Lösung mit 0,5 ml des modifizierten PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 und 4% NGS). Inkubieren mit Nutation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml sekundären Antikörper in modifizierte PBT verdünnt. Inkubieren mit Nutation für 2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml PBST (PBS mit 0,1% Tween-20). Inkubieren mit Nutation für 15 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBST zwei weitere Male. </li></ol><ol><li> Die Proben vorsichtig wie ein Tropfen auf einen Objektträger übertragen, die Einschränkung der Drop nach links von der Mitte der Folie. </li><li> Hinzufügen eines großen Tropfen (etwa 2 cm im Durchmesser) des Befestigungsträgers (z. B. Aqua-Poly/Mount) zu der Mitte der Folie. Vermeiden Sie den Pool der PBST, die in Richtung der linken Seite ist. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Gehirne aus dem Pool der PBST in den Pool der Montagemedium zu übertragen. Hinzufügen Montagemedium direkt auf die Gehirne können ihre Orientierung zu stören und sollten vermieden werden. </li><li> Unter einem Lichtmikroskop, ordnen Sie die Proben in der Montage Medium mit der Seite, die abgebildet wird nach oben werden. </li><li> Mit dem Objektträger unter dem Lichtmikroskop, langsam senken # 1.5 ein Deckglas auf der Oberseite der Proben. Optionaler Schritt: müssen entfernt werden kleinere Luftblasen durch leichtes Drücken auf dem Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Montagemedium für mehrere Stunden oder über Nacht polymerisieren, durch Lügen Folien flach, leicht-geschützt, bei Raumtemperatur. </li><li> Die Objektträger können abgebildet werden, am nächsten Tag, oder vor der Bildgebung gespeichert. </li></ol>

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<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li>
<li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+the+model+to+the+test%3A+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity%2C+axon+outgrowth%2C+and+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li>
<li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li>
<li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia%2Fflagella+function%2C+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole%2C+but+is+dispensable+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li>
<li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li>
<li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Live-Cell-Imaging ist eine unschätzbare Ansatz verwendet werden, um die Mechanismen, die ACD von Stammzellen, die Differenzierung von Zelllinien regulieren zu studieren, und die Morphogenese von komplexen Geweben. Obwohl Forschergruppen haben in der Vergangenheit verwendet eine Vielzahl von Techniken, um NB ACD visualisieren können diese Ansätze im Allgemeinen in zwei Kategorien, die in erster Linie mit Bezug darauf, ob das Hirngewebe intakt gelassen oder dissoziiert unterschiedlich gruppiert werden. <p class="jove_...

Stammzellen ein Gleichgewicht der Differenzierung und Selbsterneuerung an zelluläre Vielfalt während der frühen Entwicklung zu generieren und ersetzen beschädigte Zellen in adulten Geweben. Verordnung dieser Homöostase verhindert sowohl den Verlust und die Überdehnung der Stammzellpopulation, die in schädlichen Gewebedegeneration oder Tumorentstehung führen kann. Neuroblasten (NBS) sind die häufigsten untersuchten neuralen Stammzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila (1A), die erste Form während der embryonalen Stufen 1, 2. NBs unterziehen wiederholte Runden der asymmetrischen Zellteilung (ACD), um zwei ungleich seligen Zellen produzieren: eine sich selbst erneuernde Stammzelle und eine differenzierende Zelle. ACD wird von Zentrosomen, die nicht-membranöse Organellen, die als Mikrotubuli-organisierende Zentren der meisten Zellen 3 handeln geführt. Während der Mitose, NB Zentrosomen zu organisieren und orientieren den bipolaren mitotischen Spindel entlang der apikal-basalen Polarkeit Achse. Nach der Spaltung des Teilungs NB, apikal Schicksal Determinanten, die die Stammzell Schicksal angeben und basalen Schicksal Determinanten, die eine Differenzierung angeben, werden in die ungleiche Tochterzellen getrennt. Im Larven zentrale Gehirn, können zwei Arten von NBs durch deren Anzahl, Lage, Transkriptionsfaktor-Expression und Zelllinie (Fig. 1A) 4-6 unterscheiden. Typ-I-BS sind die häufigsten, und etwa 90 von ihnen bevölkern die vorderen und hinteren Seiten jeder Optik Lappen des Gehirns 7. Diese NBs Ausdruck der Transkriptionsfaktor ASENSE (Ase), und sie charakteristisch in eine sich selbst erneuernde NB teilen und eine kleinere Ganglienmutterzelle (GMC; Abbildung 1B). Jeder GMC erfährt ein einziges Terminal Division zu zwei Neuronen oder Gliazellen (Abbildung 1B) zu generieren. Im Gegensatz dazu sind die acht Typ II NBs, die die hintere Seite jeder optischen Loben bevöl fehlt Ase Ausdruck 5. Sie durchlaufen ACDauf eine sich selbst erneuernde NB und eine Zwischen neuralen Vorläufer (INP) zu produzieren. Die INP wiederum teilt asymmetrisch drei-bis fünfmal. Jeder dieser Bereiche ergibt Regeneration des INP und der Herstellung eines einzigen GMC 4. Zusammen die spezifische NB Identität und die zeitliche Reihenfolge der GMC Geburt führt zur neuronalen erstaunliche Vielfalt der erwachsenen ZNS. Das Verständnis der Zellbiologie, die NB ACD zugrunde liegt, wurde erheblich durch den Einsatz von Live-Cell-Imaging-Techniken verbessert. Veröffentlicht Protokolle, die von Forschern, Live-Bild verwendet NBs sind sehr unterschiedlich. Insgesamt aber diese Verfahren können in zwei allgemeine Kategorien von, ob die Larven Gehirn intakt gelassen oder mechanisch dissoziiert unterschieden gruppiert werden. Beide Techniken haben unterschiedliche Vor-und Nachteile je nach Anwendung des Forschers. Frühe Berichte enthüllt Live-NB Zellteilunggen beinhalten ein gewisses Maß an Hand Dissoziation des Larven Gehirn. Diese Protokolle Detail Verschmieren 8 oder 9 Hänseleien abgesehen, das Gehirn, um kurzfristige Primärkulturen von der NBS auf Deckgläsern wachsen. Um Bildgebung zu verbessern, werden die runden NBs der Regel auf die Deckgläser entweder mit Glasobjektträger 8 oder 9 Agarose-Pads abgeflacht. Obwohl abgeflachten Zellen Optik verbessert, diese Techniken oft NB mitotischen Defekten führen, einschließlich Regression der Teilungsfurche und die Unfähigkeit, mehr als einmal zu teilen. Daher sind Protokolle, die sowohl manuelle Dissoziation und physische Verzerrung des Larvenhirngewebe beinhalten in der Regel nur geeignet, um sehr kurzfristige (dh., Ein Zellzyklus oder weniger) Anwendungen. Ebenso semi-Quetschen oder vollständig intakten Gehirn Abflachung zwischen Glasobjektträger und Deckgläser begrenzt die Zeit, ein verbringen Abbildung einer gegebenen Probe zu einer etwa 30-minütigen Zeitraum 10. Trotz dieser Einschränkung thiAnsatz erfolgreich 11-14 verwendet. Die jüngsten Bemühungen um Live-Bild dissoziiert NBs Grenze physischen Verzerrung der isolierten Zellen. Diese Techniken sind besonders nützlich für Anwendungen, bei denen es notwendig ist, um die Zellkulturen für mehrere Zellteilungszyklen aufrecht zu erhalten. Beispielsweise kann manuell aus dispergierten Zellen dissoziiert Gehirn teilweise in ein Gerinnsel aus dem Gemisch von Fibrinogen und Thrombin, 15 für die Langzeitabbildungs ​​16 eingebettet werden. Alternativ kann explantierten Gehirne zunächst mit dem Enzym Collagenase, neben manuell durch wiederholte Passage durch eine Pipettenspitze aufgebrochen und anschließend auf Poly-L-Lysin beschichteten Glasbodenschalen 17, 18 plattiert chemisch getrennt werden. Die Beschichtung Glasschalen entweder mit Fibrinogen oder Poly-L-Lysin fördert die Bindung und leichten Verbreitung von Rundzellen, bringen sie so nah an der Deck wie möglich, ohne große körperliche Verzerrung. In additiauf beinhalten diese Verfahren das Kultivieren der NBS in Medium, das leicht für pharmakologische Experimente Störungs 18 ausgetauscht werden können. Insgesamt Plattierung direkt verteilt NBs verbessert Abbildungsoptik, ohne dabei langfristigen Imaging-Funktionen. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die langfristige Kultivierung von dissoziierten NBs wurde 19 beschrieben. Jedoch ist dieser Ansatz nicht ohne Einschränkungen. Es gibt mehrere Einschränkungen live dissoziiert NBs Bildgebung. In einem Feld von dispergierten Zellen, beispielsweise ist es schwierig, bestimmte NB Linien, die räumlich in der intakten 1 organisiert sind, zu identifizieren. Ebenso die Unterscheidung der Typ I gegen Typ-II-NBs in dissoziierten Gewebe ist auch ohne den Ausdruck der Abstammung oder Tracer-Subtyp-spezifischen Transgene, wie worniu-GAL4, asense-GAL80 20 herausfordernde. Obwohl diese Transgene sind sehr nützlich für einige Anwendungen, sie begrenzen Forscher diejenigen Transgene exunter der Kontrolle von UAS-Enhancer-Element 21 gedrückt und erfordern komplexe genetische Systeme. Studien, die die räumliche und zeitliche Entwicklung des NBs betreffen, erfordern daher in vivo-Bildgebung im Kontext eines intakten Gewebes. Außerdem haben Studien dissoziierter embryonaler NBs anzuzeigen, dass der physische Kontakt benachbarter Zellen ist für die Zwischen Lokalisierung von Schlüsselfaktoren Polarität 22, 23. Diese Studien zeigen, völlig isoliert NBs die invariante mitotischen Spindelachse nicht mehr aufrecht zu erhalten. Stattdessen werden diese Zellen zeigen eine weitere randomisierte Spindelachse und großen Winkeln der Trennung zwischen aufeinander GMC Knospen, vielleicht aufgrund des Verlustes der apikalen Zentrosom Positionierungs 22. Obwohl die Beziehung zwischen den Larven NBs und ihre Nachbarzellen nicht ausführlich untersucht worden, ist es eine Überlegung wert, dass die Larvenstammzellmikroumgebung kann von Zellpolarität oder andere treffenVerhaltensweisen. Um die physiologischen Kontext der Larven NBs halten wir Bild ACD aus ganzen Gehirne. Angesichts der inhärenten Einschränkungen mit bildgebenden dissoziiert NBs verbunden sind, haben unser Labor und andere Protokolle für Bild in aufeinanderfolgenden Runden der NB ACD aus ganzen Larven Gehirn etabliert. Techniken zur Bild intakten Gehirn ersetzen häufig die starre Oberfläche aus Glas auf der einen Seite der Kulturkammer mit einer flexiblen Membran, um Gewebe Verformung oder Beschädigung zu verhindern und eine für den Gasaustausch. Einige Verfahren beinhalten Montage explantierten Gehirne in einem Gemisch von Insektenkulturmedium, Serum und Ascorbinsäure mit den Fettkörpern von zehn Larven 24 isoliert. Die isolierten Fettkörper hinzugefügt werden, weil sie eine Mitogen bekannt, NB Zellteilung stimulieren 25 absondern. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität des Gewebes über 3 Stunden und ist daher offen für Langzeitabbildungs ​​24, 26-28. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die long fristigen Abbildung des Larven intakten Gehirn in Gegenwart von Ascorbinsäure, Serum und Fettkörper wurde 29 detailliert. Wichtig ist, da das Gewebe nicht ausgesetzt oder immobilisiert ist dieser Ansatz weniger nützlich für Anwendungen, in denen Kulturmedium ausgetauscht wird (z. B. Arzneimittelstudien Immunodepletion usw.). Unser Labor hat die ganze Vorbereitung der Live-Halterung Larven Gehirne für langfristige Bildgebung 30, 31 vereinfacht. Der Hauptvorteil unseres Protokolls über andere ist seine Einfachheit: Unsere Beobachtungen zeigen, weder Serum, Ascorbinsäure, Insulin, noch Fettkörper sind notwendig, Zusatzstoffe Bild aufeinanderfolgende Runden NB ACD. Obwohl Additive, wie Insulin, wurden für die verlängerte Bildgebungs der Stammzellen Abteilungen 32 und kollektive Zellmigration in Drosophila Ovarien 33 nützlich erscheinen sie entbehrlich für NB ACD sein, wie unsere Abbildungsmedium besteht aus einer einfachen Mischung von STAndard Insektenzellkulturmedium mit Antibiotika-Antimykotikum ergänzt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Durch die Verwendung von wiederverwendbaren gasdurchlässige oder Glasboden Kulturschalen, haben wir in der Lage, mehrere Runden von aufeinanderfolgenden NB ACD zu erhalten. Die gleichen explantiert Proben können leicht für Immunfluoreszenz-und andere Verfahren mit festen Gewebe verwendet werden. In diesem Protokoll, die wir ausführlich die Präparation von intakten Larven Gehirn, sowie die Vorbereitung der Gehirne sowohl für Live-und Festanalyse.

<table><tbody><tr><td>Lumox Gewebekulturschale 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>Eine wiederverwendbare Kulturschale mit gasdurchlässiger und optisch klarer Folienbasis.</td></tr><tr><td>Schneider's S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotikum-Antimykotikum (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Ein Nahrungsergänzungsmittel mit Penicillin (10.000 U/ml), Streptomycin (10.000 &#956; g/ml) und Amphotericin B (25 &#956; g/ml), das den S2-Medien von Schneider zugesetzt wird, um eine bakterielle und pilzliche Kontamination zu verhindern.</td></tr><tr><td>Abdeckgläser aus Glas, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Ein inertes Öl mit hoher Viskosität, das klar und farblos ist.</td></tr><tr><td>Paar vernickelte Stifthalter, 17 cm lang</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Paar Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel/Sonde mit Kunststoffgriff</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, 0,22 &#956; m Porengröße</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette aus Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 32 % EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15714</td><td>ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Befolgen Sie die MSDS-Richtlinien für eine sichere Handhabung.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorid)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Ein Farbstoff, der DNA markiert und durch UV-Licht angeregt wird.</td></tr></tbody></table>

live-imaging von<em&gt; drosophila</em&gt; larven neuroblasten

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stammzellen teilen sich asymmetrisch zu zwei Nachkommen Zellen mit ungleichen Schicksal Potenzial generieren: eine sich selbst erneuernde Stammzellen und differenzier Zelle. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und Krankheit, das Verständnis der Mechanismen, die regeln, asymmetrische Zellteilung Stamm hat eine robuste Bereich der Studie. Weil sie genetisch manipulierbaren und laufen aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung etwa einmal pro Stunde, die Stammzellen des Drosophila zentralen Nervensystems, Neuroblasten oder unverzichtbar sind Modelle für die Untersuchung von Stammzellteilung. 100 neurale Stammzellen sind in der Nähe der Oberfläche jedes der beiden Larvenhirnlappen angeordnet, so dass diese Modellsystem insbesondere für die Bildgebung mikroskopische Untersuchungen. In dieser Arbeit untersuchen wir einige Ansätze weit verbreitet, um Stammzell Divisionen zu visualisieren, und wir richten die relativen Vor-und Nachteile dieser Techniken, die im Vergleich zu intakten Hirngewebe dissoziiert beschäftigen. Wir haben auch unsere Detail simplifIED-Protokoll verwendet, um ganze Gehirn aus Drittlarvenstadium für Live-Cell-Imaging-und Festanalyseanwendungen Explantation.

Live-Bildgebung hat eine Reihe von Mechanismen, die NB ACD regeln aufgeklärt. Vor der Bildaufnahme ist es erforderlich, die optimalen Bilderzeugungsbedingungen zu bestimmen. Es ist notwendig, um den Rahmen Erfassungsrate mit der Dauer der Live Cell Imaging auszugleichen. Für feine Zellanalyse, zum Beispiel erhöhte zeitliche und optische Auflösung kann erforderlich sein. Bei der Visualisierung einer einzelnen NB Zellzyklus (Fig. 4A) kann die Geschwindigkeit, mit der Bilder aufgenommen werden, ohne dabei ...

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Dissektion des intakten ZNS aus den Larven der dritten Instar von oph detailliert darzustellen, um asymmetrische Stammzellteilungen, die zelluläre Differenzierung und die Morphogenese zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem das ZNS zunächst durch eine grobe Dissektion aus dem Larvenkörper explantiert wird.Der zweite Schritt besteht darin, das intakte Gehirn mithilfe einer feinen Mikrodissektion unter Verwendung speziell angefertigter Werkzeuge von den umgebenden Geweben zu isolieren. Anschließend werden die gesunden Gehirne entweder für die Live-Zell-Bildgebung präpariert oder einer chemischen Fixierung und Immunfluoreszenz unterzogen; abschließend wird die Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie eingesetzt, um die Vorgänge sichtbar zu machen, die die Teilungen neuraler Stammzellen steuern, und um Einblicke in die Mechanismen der zentralnervösen Entwicklung zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Forschungsbereichen Stammzellkrebs und neuronale Entwicklung zu beantworten.Indem wir zum Verständnis beitragen, wie die Proliferation von Stammzellen reguliert wird, wissen wir, dass die ABER-Stammzellteilung mit

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Drosophila Auge mit Live-mikroskopische Analyse mit GFP markierten Gliazellen gepaart untersuchen.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für...

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Quelle: Hellerman, M. B.B.. , et al. Live-Imaging des Drosophila J. Vis. Exp. (2015){TAG_ 28}}Das Video zeigt eine Live-Imaging-Technik zur Untersuchung der Augenmusterung bei einer Drosophila melanogaster-Puppe. Grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierte Marker ermöglichen die Visualisierung der zellulären Organisation und Differenzierung während der Bildung der sich entwickelnden Augenstruktur.

Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenauges mittels Fluoreszenzmikroskopie

Hier beschreiben wir eine effektive Methode zur Untersuchung der Dynamik apoptotischen...

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Hier beschreiben wir die Methode, die wir angewendet haben, um hochmotile dendritische Filopodia in einer Live-Vorbereitung des Drosophila-Larvenhirns abzubilden, und das Protokoll, das wir entwickelt haben, um Zeitraffer-3D-Bildgebungsdatensätze für quantitative Bewertungen von Dendriten zu quantifizieren. Dynamik bei der Entwicklung von Neuronen.

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Lernen Sie die Live-Imaging-Methode für Drosophila-Larvenneuroblasten zur Untersuchung asymmetrischer Stammzellteilungen. Diese Technik liefert mechanistische Einblicke in die Entwicklung des ZNS.

Live-Imaging von

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