Live-Imaging von Drosophila Larven Neuroblasten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dissektion des intakten ZNS von der dritten Instar oph-Larve detailliert zu beschreiben. Um asymmetrische Stammzellteilungen, zelluläre Differenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das ZNS durch grobe Dissektion aus dem Larvenkörper explantiert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, das intakte Gehirn durch feine Mikrodissektion mit speziell angefertigten Werkzeugen von den peripheren Geweben zu isolieren. Als nächstes werden die gesunden Gehirne entweder für die Bildgebung lebender Zellen montiert oder einer chemischen Fixierung und Immunfluoreszenz unterzogen, schließlich wird die konfokale Spinning-Disc-Mikroskopie verwendet, um die Ereignisse zu zeigen, die die Teilung neuraler Stammzellen steuern, und um mechanistische Einblicke in die ZNS-Entwicklung zu erhalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Stammzellkrebs und neuronale Entwicklung zu beantworten.

Indem wir zu unserem Verständnis beitragen, wie die Stammzellproliferation reguliert wird, wissen wir, dass die ABER Stammzellteilung mit Tumorgenese und Mikrozephalie verbunden ist, und unsere bildgebenden Untersuchungen zeigen die Mechanismen, die diese Stammzellteilungen regulieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Mikrodissektion und die Montage des Gehirns schwer zu erlernen sind, da sie ruhige Hände, Geduld und Übung erfordern. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie zwei Tropfen warmes Präpariermedium auf einen einzigen Objektträger geben, einen für die grobe Dissektion und den anderen für die feine Dissektion.

Setzen Sie dann mehrere Larven in einen der Medientropfen um. Danach überführen Sie den Objektträger mit den Larven in ein Präpariermikroskop. Zoomen Sie nun in den Tropfen, der die Larven enthält, so, dass die vorderen und hinteren Enden der Larven sichtbar sind.

Fassen Sie mit einer Pinzette die mittlere Region einer einzelnen Larve und fassen Sie mit einer zweiten Pinzette eine andere Region direkt daneben. Reißen Sie dann die Larven in zwei Hälften. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Larven auf dem Deckel, schlüpfen Sie hinein und entsorgen Sie die hinteren Hälften.

Zoomen Sie in eine Larve hinein, so dass die vorderen Maulhaken deutlich sichtbar sind. Machen Sie danach einen kleinen Schnitt oder eine Kerbe auf der gegenüberliegenden Seite der Mundhaken der Larve zwischen dem dritten thorakalen und dem ersten abdominalen CLE-Band. Fassen Sie dann die Mundhaken mit der Pinzette.

Ziehen Sie die Nagelhaut vorsichtig von vorne nach hinten ab und fahren Sie fort, bis das ZNS freigelegt ist. Reißen Sie dann das Gewebe ab, um das ZNS vom Rest der Larven zu isolieren. Achten Sie darauf, das ZNS nicht zu beschädigen und entsorgen Sie beschädigte Proben mit einem gerissenen ventralen Nervenstrang oder verzerrten Sehlappen.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Larven auf dem Deckglas. Übertragen Sie dann das gesunde explantierte Gewebe auf das andere saubere Medium. Legen Sie es zum feinen Sezieren auf das Deckblatt.

Verwenden Sie die Präpariernadeln, um das periphere Gewebe aus dem Gehirn zu entfernen. Schieben Sie das Skalpell zwischen das Gehirn und das unerwünschte Gewebe und stecken Sie das Bindegewebe an den Objektträger. Ziehen Sie mit dem Haken das unerwünschte Gewebe sanft weg und drücken Sie gleichzeitig das Skalpell in Wippbewegungen auf den Deckglas.

Arbeiten Sie langsam und bewusst, um alle Bandscheiben aus jedem Gehirn zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, um die Morphologie des Gehirns nicht zu stören. Ein gesundes Gehirn hat einen intakten ventralen Nervenstrang und symmetrische runde Sehlappen.

Drehen Sie nun eine 50 Millimeter große, gasdurchlässige Kulturschale mit einer klaren Folie nach oben um und geben Sie einen kleinen Tropfen Medium auf die Mitte der Schale. Als nächstes nimmst du mit einem Haken die Gehirne unter den Sehlappen auf und überträgst sie nacheinander auf den Mediumtropfen auf der Schale. Sammle fünf bis 10 Gehirne im Tropfen Medium.

Schieben Sie sie dann nacheinander nach unten, da viele von ihnen danach am Meniskus eingeklemmt werden. Richten Sie das Gehirn so aus, dass der Neuroblast abgebildet werden kann, um den anterioren ventralen Neuroblasten abzubilden. Platzieren Sie das Gehirn mit dem ventralen Nervenstrang nach oben, richten Sie das Gehirn so aus, dass alle ventralen Nervenstränge innerhalb der XY-Ebene in die gleiche Richtung zeigen.

Verwenden Sie eine Spritze oder eine Kunststoffpipette, um vier Halo-Kohlenstofföltropfen auf die gasdurchlässige Membran zu geben. Das Volumen jedes Öltropfens sollte zueinander und zum Tropfen des Mediums entsprechen. Sobald sie fertig sind, ähneln die fünf Tropfen den fünf Facetten auf Würfeln im westlichen Stil.

Senken Sie dann einen Deckschieber so auf die Baugruppe, dass er auf alle fünf Tropfen gleichzeitig trifft. Die Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Drucks auf die Proben verringert die Wahrscheinlichkeit, dass sie gestört werden. Warten Sie etwa drei Minuten.

Wenn sich das Öl und das Medium unter dem Gewicht der Abdeckung verteilen, schieben Sie sie unter ein Präparierzielfernrohr. Senken Sie den Deckglas weiter auf die Oberfläche des Gehirns, indem Sie überschüssiges Medium mit einem Seidenpapierdocht entfernen, bis sich der Deckglas berührt, das Gehirn nicht zu stark docht, da dies zu einer Gewebeverzerrung oder Gehirnexplosion führt, um den anterialen ventralen Neuroblasten abzubilden. Der Deckglas muss leicht in Richtung der ventralen Nervenstrangspitzen verschoben werden.

Dies bewirkt, dass sich das Gehirn dreht, wodurch die Hirnlappen in direkten Kontakt mit dem Deckglas kommen, um die Bildgebung zu erleichtern, und die Kammer anschließend durch enc versiegelt wird. Der Deckslip mit einer kleinen Menge Halo Carbon Oil. Überschüssiges Öl, das aus dem Deckglas austritt, sollte minimiert und mit einem Taschentuch abgetupft werden.

Vor der Bildgebung. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf den Deckschirm direkt über dem montierten Gehirn, um das Objektiv direkt über der Probe zu zentrieren. Positionieren Sie die montierte Probe vorsichtig in den 25 Grad Celsius warmen Tischinkubator und decken Sie die Kammer mit ihrem Deckel ab.

Lokalisieren Sie als Nächstes den Neuroblasten des Zentralhirns mit Hilfe von Durchlicht, indem Sie sich auf die großen runden Zellen konzentrieren, die sich in den zentralen und medialen Bereichen der Sehlappen befinden. Sobald sie an Ort und Stelle sind, nehmen Sie mit dem Konfokalen eine schnelle Belichtung vor, um die richtige Position und Tiefe des Neuroblasten zu bestimmen. Begrenzen Sie die Tiefe auf die ersten 10 bis 15 Mikrometer.

Passen Sie es nach Bedarf an und nehmen Sie ein weiteres Testbild auf. Um axiale Drift zu vermeiden, verwenden Sie ein kontinuierliches automatisches Fokussiergerät, das eine Infrarot-LED verwendet, oder korrigieren Sie die Fokusebene manuell. Sobald ein Neuroblast von Interesse identifiziert ist, optimieren Sie alle Parameter vor der Bildgebung.

Bilden Sie nun den gesamten Neuroblasten ab, indem Sie 12 bis 14 Bilder im Abstand von einem Mikrometer auf der Z-Achse sammeln. Passen Sie die Zeitauflösung an, um einzelne oder mehrere Zellzyklen desselben Neuroblasten zu erfassen. Verwenden Sie Intervalle von 10 bis 32 für die Bildgebung mit einzelnen Zellzyklen und Intervalle von ein bis drei Minuten für mehrere Zellzyklen.

Bestätigen Sie als nächstes, dass die Probe gesund ist, indem Sie die Dauer der Mitose überwachen. Wenn die Mitose länger als 15 Minuten dauert, gehen Sie zu einem anderen Gehirn über. Ein gesundes Gehirn zeigt viele Neuroblasten im selben Sichtfeld, die mehrere Runden der Mitose durchlaufen.

Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Inkubationskammer und entsorgen Sie alles außer den gasdurchlässigen Kultivierungsschalen. Spülen Sie die Oberfläche der Kulturschale mit 95%igem Ethanol ab und wischen Sie das Öl mit einem Tuch ab. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male.

Hier ist die Live-Bildgebung von Neuroblasten-Stammzellteilungen in ganzen Präparaten zu sehen. Dies sind die Zeitrafferbilder eines einzelnen Zellzyklus von einem Neuroblasten, der GFP Mosin exprimiert, für die feine zelluläre Analyse, ein einzelner Neuroblasten-Zellzyklus wird in weniger als 32. Zeitintervallen abgebildet. Und das sind die Zeitrafferbilder von aufeinanderfolgenden Zellteilungszyklen von einem Neuroblasten, der sowohl G-F-P-M-O als auch A GFP-markierte Zentrosommarker exprimiert.

Zur Abbildung mehrerer Neuroblasten-Zellzyklen. Gehirne werden in der Regel in Zeitintervallen von ein bis drei Minuten über einen Zeitraum von zwei bis drei Stunden abgebildet. Die konfokalen Projektionen von fixierten Stammzellen aus Heimpräparaten sind hier dargestellt.

Um alle Neuroblasten abzubilden, die sich auf beiden Sehlappen befinden, wird eine 20-fache Vergrößerung verwendet. Diese Analyse ist besonders nützlich, um die gesamte Gehirnmorphologie zu untersuchen und die Anzahl der Neuroblasten zu quantifizieren. Der Großteil der Neuroblasten aus einem einzelnen Sehlappen kann mit 40-facher Vergrößerung sichtbar gemacht werden.

Für eine detaillierte zelluläre Analyse einiger Neuroblasten muss eine 100-fache Vergrößerung verwendet werden. Dieser mutierte Neuroblast zeigt mehrere Zentrosomen an jedem Spindelpol. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Lichtschäden zu vermeiden, indem Sie die Lichtmenge begrenzen, die auf die Probe trifft.

Diese Technik zur Abbildung der Teilung lebender Neuroblasten in ganzen Präparaten hat Forschern auf dem Gebiet der Stammzellbiologie den Weg geebnet, die asymmetrische Zellteilung im lebenden nativen Kontext des sich entwickelnden Drosophila-Gehirns zu erforschen.