Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre Einzelaufzeichnungen von kortikalen Interneuronen in Mäusen zu erhalten, die den Kanal Rootin zwei exprimieren. Dies wird erreicht, indem eine hochohmige Aufzeichnungselektrode durch das Gewebe vorgeschoben wird, um Interneuronen aus Spike-Reaktionen auf blaue Lichtimpulse zu identifizieren. Das elektrische Signal wird auf Änderungen überwacht, die auf die angemessene Vorschubgeschwindigkeit und die Wahrscheinlichkeit einer stabilen, gut isolierten Aufzeichnung hinweisen.

Wenn eine gute Isolierung einzelner Einheiten nicht erreicht werden kann oder umgekehrt selten lichtempfindliche Neuronen anzutreffen sind, ersetzen Sie die Aufzeichnungselektrode. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zuverlässigkeit des Lichts Reaktionen von optisch identifizierten Neuronen hervorruft und das typische Signal-Rausch-Verhältnis, das mit dieser Strategie erreicht wird. Der Photostimulationsansatz ist eine zugängliche und kostengünstige Möglichkeit, genetisch identifizierte Zelltypen mit einem extrazellulären Standardverstärker und blauem Licht zu behandeln.

Dies ist unsere Strategie, um bestimmte innere Neuronen in der Anästhesie des auditorischen Kortex zu pimpen, aber die allgemeineren Punkte gelten für andere kortikale Bereiche als spärliche Zelltypen. Um dieses Verfahren zu beginnen. Nachdem das Tier durch intraperitoneale Injektion mit Ketamin meine Cocktail betäubt wurde, legen Sie es in ein stereotaktisches oder anderes Kopfhaltegerät, stellen Sie sicher, dass der Schädel gut gesichert ist. Dies ist für die Aufrechterhaltung stabiler Einzelzellaufzeichnungen unerlässlich.

Tragen Sie anschließend eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern und die Körpertemperatur des Tieres auf 37 Grad Celsius zu halten, um eine CI-Sternumdrainage für zusätzliche Aufnahmestabilität durchzuführen, entfernen Sie mit einer Skalpellklinge Gewebe aus dem hinteren Schädel, um das CI sternum magna freizulegen. Machen Sie dann mit der Spitze der Klinge einen kleinen Kerb in die Dora, um die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit abzulassen. Führen Sie nun mit dem Skalpell eine kleine Kraniotomie über dem kortikalen Bereich von Interesse durch.

Entfernen Sie danach die Dura und bedecken Sie dann die freiliegende Rinde mit der Schicht aus warmem Aros. Halten Sie das Agros mit Kochsalzlösung feucht. Bereiten Sie eine Zungenständerelektrode vor.

Kleben Sie die Elektrode mit Sekundenkleber und Beschleuniger auf ein Glaskapillarrohr. Fügen Sie dann einen Schrumpfschlauch hinzu, um den Halt zu gewährleisten. Montieren Sie anschließend die Elektrode an einem motorisierten oder hydraulischen Mikrom-Manipulator und stellen Sie sie so ein, dass sie orthogonal zur kortikalen Oberfläche verläuft.

Schieben Sie ein Erdungskabel unter der Haut gegen den Schädel. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Muskeln an der Seite des Kopfes und im Nacken, da diese myografische Artefakte erzeugen können. Das elektrische Signal wird unter Verwendung eines extrazellularen Verstärkers verstärkt, der für die Aufzeichnung mit einem einzelnen Gerät geeignet ist und vorzugsweise mit einem Impedanzprüfmodus ausgestattet ist.

Die laufende Spike-Aktivität wird mit zwei Oszilloskopen und einem Satz Aktivlautsprecher überwacht. Schieben Sie nun die Elektrode durch das Agros und testen Sie ihre Impedanz, um sicherzustellen, dass sie innerhalb von sieben bis 14 Megaohm liegt. Wenn die Spitze die Oberfläche des Kortex durchbricht, Null diese Position auf dem Mikrom-Manipulator.

Um die Aufzeichnungstiefe am besten abzuschätzen, bestätigen Sie visuell, dass die Elektrodenspitze die kortikale Oberfläche in einer Tiefe von Null verlässt. Beim Zurückziehen der Elektrode am Ende einer Penetration in den auditorischen Kortex, um sicherzustellen, dass dieser Null-Sollwert dem Niveau des Kortex entspricht, überwacht der Stimulus evozierte Feldpotentiale. Während Sie die Elektrode durch die ersten paar hundert Mikrometer Gewebe schieben, bestätigen Sie, dass sich die Polarität des lokalen Feldpotentials in einer Tiefe von 100 Mikrometern umkehrt.

Montieren Sie als Nächstes eine optische Faser, die mit einer blauen Lichtquelle gekoppelt ist, auf einem manuellen Mikromanipulator. Regulieren Sie die Leistung der Lichtquelle mit der Steuereinheit, die in der Lage ist, eine TTL-Impulsfolge mit einer bestimmten Breite und Dauer zu liefern. Überwachen Sie dann das Signal auf beiden Oszilloskopen.

Messen Sie die gesamte Lichtleistung an der Spitze der optischen Faser mit einem Leistungsmesser. Verwenden Sie diesen Wert, um die Bestrahlungsstärke zu berechnen, indem Sie ihn durch die Querschnittsfläche des Faserkerns dividieren. Beginnen Sie mit dem Wert im Bereich von 10 bis 15 Milliwatt pro Quadratmillimeter.

Positionieren Sie die Spitze der Faser mit dem Mikroskop so nah wie möglich an der Oberfläche des Aros. Zentrieren Sie den Strahl dort, wo die Elektrode in das Gewebe eintritt. Prüfen Sie nun mit der Elektrode im Aros auf Lichtartefakte.

Geben Sie eine Impulsdehnung ab. Beseitigen Sie alle transienten Lichtartefakte, indem Sie die optische Faser relativ zur Elektrode neu positionieren, um den Winkel des einfallenden Lichts zu ändern. Wenn Artefakte bestehen bleiben, versuchen Sie, die Lichtleistung zu verringern.

Schieben Sie dann die Elektrode langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Mikrometer pro Sekunde durch das Gehirn. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die laufende Aktivität der Elektrode zu überwachen. Verwenden Sie den anderen zum Auslösen der Laserpulse.

Achten Sie auf den schwachen Hash der lichtevozierten Spitzen auf dem Audiomonitor, der anzeigt, dass sich die Elektrode einer Opsin-positiven Kanalzelle nähert. Verlangsamen Sie dann die Vorschubgeschwindigkeit, sobald das Licht hervorruft. Die Spikes sind groß genug, um einzeln am Oszilloskop ausgelöst zu werden.

Fangen Sie damit an. Passen Sie eine Skala auf der horizontalen Achse an, um die genaue Form der Spike-Wellenform zu beobachten. Hören Sie zu diesem Zeitpunkt auf, die Elektrode vorzuschieben, und warten Sie, bis sie sich im Gewebe abgesetzt hat.

Dies ist entscheidend für eine stabile Aufnahme. Wenn sich das Signal-Rausch-Verhältnis nach einigen Minuten nicht verbessert hat, gehen Sie fünf Mikrometer weiter und warten Sie. Wiederholen Sie diesen Vorgang erneut, bis entweder der Spitzenwert oder der Talpunkt eines Aktionspotentials zuverlässig mit einer Spannungsschwelle erfasst werden kann.

Während der Aufnahme weit über dem Grundrauschen ansetzen. Überwachen Sie die laufende Aktivität auf dem ersten Oszilloskop. Achten Sie gleichzeitig auf die Größe und Form der Spikes mit dem zweiten Oszilloskop und notieren Sie sich die Klangqualität auf dem Lautsprecher.

Hören Sie aufmerksam auf abrupte Veränderungen, die darauf hindeuten, dass die Zelle entweder zu nahe an die Elektrode heranrückt oder wegdriftet. Wenn die Spikes groß und verformt werden, ziehen Sie die Elektrode zurück. Wenn sie kleiner werden, schieben Sie die Elektrode vor.

Bewegen Sie sich langsam in zwei Mikrometerschritten, um die Qualität der Spikes zu bestätigen. Überlagern Sie die gesamte Spike-Wellenform über einen breiten Bereich von Schwellenwerten. Es sollte nur eine konsistente Stachelform mit einheitlicher Höhe zu sehen sein.

Die meisten PV-positiven Zellen können eine volle Sekunde lang brennen. Wenn das Signal mit Spikes von einem benachbarten Neuron verunreinigt wird, schieben Sie die Elektrode vor und suchen Sie bei jeder Penetration nach einer neuen Zelle, senken Sie die Elektrode durch die gesamte Tiefe des Kortex. Wenn nach vielen Penetrationen keine lichtempfindlichen Neuronen auftreten oder umgekehrt die Aufzeichnungen routinemäßig mit Spikes aus Opsin-negativen Zellen des Nachbarkanals kontaminiert werden, versuchen Sie es mit einer neuen Elektrode.

Diese Abbildung zeigt Beispielaufnahmen von drei Arten von optisch identifizierten Interneuronen. Die Zellen reagieren auf die Suchimpulsfolge mit einem zuverlässigen Ausbruch von Spikes. Hier sind 100 tr-Leitungsspitzen und die durchschnittliche interpolierte Wellenform dargestellt.

Diese Dienstplandiagramme zeigen das konsistente Timing von lichtevozierten Spitzen. Die ersten Spitzenlatenzen für eine Stichprobe der Trennschärfe. Volin-positive Interneuronen werden hier vorgestellt.

Der Ansatz der Photostimulation ist konzeptionell sehr einfach, kann aber überraschend herausfordernd und ertragsarm sein. Praktisch. Glaspflasterelektroden sind stark gegenüber Parametall-Neuronen vorgespannt, so dass man nicht sehr oft innere Neuronen bekommt.

Auf der anderen Seite erhält man mit Tetros viele lichtempfindliche Interneuronen, aber die Spitzen sind klein und es gibt viele überlappende Wellenformen, so dass es sehr schwierig ist, zuverlässig in einzelne Einheiten zu sortieren. Wir versuchen, dies auf viele verschiedene Arten zu erreichen, und für die inneren Neuronen fanden wir heraus, dass diese scharfen 10 bis 14 Mega-Elektroden die richtige Balance in Bezug auf den Hörradius fanden, der groß genug sein muss, um das Licht von Eichenähren aus der Ferne zu erkennen, aber begrenzt genug, um eine gute Isolierung einer einzelnen Einheit zu erreichen. Es steckt aber auch etwas Voodoo dahinter.

Wenn Sie das nicht erreichen können, sparen Sie sich viel Zeit, indem Sie diese Elektrode einfach wegwerfen und zur nächsten übergehen, bis Sie eine finden, die funktioniert.