Name: Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Echtzeit-Bildgebung von Leukozyten-Transmigration unter physiologischen Flussbedingungen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von Endothel-Junktionsdynamiken mit VE-Cadherin und PECAM-1.

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Die Autoren danken Dr. P.L. Hordijk für die kritische Lektüre des Manuskripts. AED wird durch ein Stipendium der Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) (Grant #1028) unterstützt. JK wird von der Dutch Heart Foundation (2005T3901) unterstützt. JDvB ist ein NHS Dekker Fellow (Grant #2005T039).

Neutrophile wurden von gesunden Freiwilligen, die eine Einverständniserklärung unterzeichnet haben, isoliert. Die Forschung hat in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Leitlinien für die menschliche Wohlfahrt durchgeführt. 1. Auflage und Wartung von menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen <ol><li> Kultur menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) nach den Anweisungen des Herstellers. Wachsen HUVECs auf Fibronektin (FN) beschichteten Medien mit Gerichten (10 pg / ml, in demineralisiertem Wasser gelöst) (Endothelial Basal Medium (EBM-2)-Medium mit Endothelial Growth Medium (EGM-2) SingleQuots ergänzt). Verwenden Zellkultur zwischen 4-8 Durchgänge für Experimente. </li><li> Tag 1: Mantel Strömungskammern mit 100 ul Fibronectin (10 ug / ml in PBS) für mindestens 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Tag 2: Wenn die Zellen 80-90% Konfluenz trypsinize die Zellen nach sorgfältigem Waschen mit RT Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH-Wert 7,4, Zentrifuge bei 800 xg und resuspendieren bei 800.000 Zellen / ml mit Medien. Platte 80000 Zellen in jedem einzelnen Kanal der FN-beschichtete Flusskammern und sanft pipettieren die Zellsuspension auf und ab. Kultur O / N in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Tag 3: Aktualisieren Sie die Medien in der Durchflusskammer-Rutsche durch leichtes Kippen des Schiebe in einem 45 ° Winkel. (Siehe Abbildung 1a). HINWEIS: Es wird empfohlen, die Medien nur in den Behältern und nicht in den Kanal selbst zu entfernen. Entfernen der Medien in den Kanälen kann in Endothelzellen Verlust und Tod aufgrund der Spannkraft der durch Pipettieren verursacht Medien führen. </li><li> Überprüfen durch Phasenkontrastmikroskopie, wenn die Endothelzellen haben eine Monoschicht (dh 100% konfluent) gebildet ist. Wenn die Zellen nicht 100% konfluent, ändern Sie die Medien zwei Mal pro Tag, bis sie 100% Konfluenz erreichen. </li><li> Sobald die Zellen Konfluenz erreicht, stimulieren die Zellen mit den Medien (siehe Schritt1,1), enthaltend Entzündungsmediator (TNF-α (10 ng / ml)). Stimulierung HUVECs O / N (dh 12 Stunden) mit TNF-α zu einer entzündlichen Phänotyp des Endothels, dh. Hochregulierung von Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM-1 und VCAM-1-13. </li></ol> 2. Polymorphkernige Leukozyten Isolierung mithilfe Percoll Gradienten <ol><li> Bereiten N-2-Hydroxyethyl-N&#39;-2-ethansulfonsäure (HEPES) -Puffer (nachfolgend: flow-Puffer), bevor die Isolierung neutrophilen Granulozyten (PMN). Flow-Puffer verwendet wird, um isolierte PMN waschen und als Puffer in der Flow-Assay. Die Bereitstellung Flusspuffer: 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) in 1 l entmineralisiertem Wasser gewaschen und auf pH 7,4 (das Lager kann bei 4 ° C mehrere Wochen lang aufbewahrt werden). </li><li> Frisches 100 ul 1 M CaCl 2 &amp; #160, (1 mM), 2,5 ml Humanalbumin aus einer 200 g / L Stammkonzentration (0,5% v / v) und 0,1 g Glucose in 100 ml (0,1% w / v) der Fließpuffer. Als nächstes filtert die Strömungs Puffer unter Verwendung eines 0,45 um-Filter. HINWEIS: Diese Flusspuffer muss frisch für jeden Versuch vorbereitet werden. </li><li> Vor der Isolierung von PMN, bereiten 10% Trinatriumcitrat (TNC)-Lösung in PBS, pH 7,4. </li><li> Sammle 20 ml Vollblut in Natrium-Heparin vacuettes von einem gesunden Freiwilligen. Verdünnte Gesamtblut 1: 1 mit 10% PBS / TNC in 50 ml-Röhrchen und Pipette 20 ml verdünntem Blut vorsichtig auf 12,5 ml Percoll (ein 23% (w / w) kolloidalen Lösung in Wasser mit einer Dichte von 1,130 g / ml) in einer neuen 50-ml-Tube. Die Rohre in der Zentrifuge vorsichtig und Spin für 20 min bei 800 xg mit geringer Beschleunigung und ohne Unterbrechung bei RT gesetzt. HINWEIS: Bei der Zugabe der verdünnten Blut in den Percoll, kippen Sie das Percoll haltige Rohr in einem Winkel von 45 ° und sanft pipettieren Das verdünnte Blut in der Tube Witzh die langsamste Einstellung Pipette Junge. </li><li> Entfernen Sie alle flüssigen und anschließend das Rohr mit eiskaltem Erythrozytenlyse-Puffer (4,15 g NH 4 Cl [0.155 m] 0,5 g KHCO 3 [0.01 M] und 18,5 mg EDTA (Triplex-III) [0,1 mm] 500 ml füllen eiskaltem H 2 O), um Erythrozyten zu lysieren. Lassen Röhrchen auf Eis gelegentlich Umdrehen des Röhrchens, bis die Suspension wird dunkel rot, gefolgt von Zentrifugation 500 g für 5 min bei 4 ° C mit Unterbrechungen aktiviert. HINWEIS: Die Pelletfraktion enthält die PMNs (Neutrophile, Eosinophile, Basophile), zusammen mit den Erythrozyten. </li><li> Überstand entfernen und zweimal waschen Pellet in eiskaltem Lyse-Puffer bei 500 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet mit strömungs Puffer bei RT und bestimmen, PMN-Konzentration entweder mit einer Zählkammer oder automatisierte Zellzähler. Suspendieren die PMN in Fluss Puffer bei 1 x 10 6 Zellen / ml und halten bei RT. </li></ol> 3. Kennzeichnung von Endothelial Junctional VE-Cadherin und PECAM-1 <ol><li> Hinzufügen des PECAM Alexa Fluor 647-Antikörper (Klon WM59) in einer 1: 100 Verdünnung und der calciumunabhängige VE-Cadherin-FITC-Antikörper (Klon 55-7H1) bei einer Verdünnung von 1:50 zu HUVEC-Kulturmedium (siehe Schritt 1.1), und Inkubation für 30 min vor dem Start des Fluss Experiment junctional Dynamik von Endothelzellen während der Neutrophilen-Transmigration unter physiologischen Flussbedingungen zu visualisieren. Hinweis: Vor dem Hinzufügen der direkt markierten Antikörpern zu den Strömungskammern, sicherzustellen, dass das Volumen in jedem Kanal hat 100 ul betragen. Dies hilft, die Antikörper Kosten so niedrig wie möglich. </li></ol> 4. PMN TEM-Assay unter Fluss <ol><li> Platzieren Sie die PMNs in einem Wasserbad für 15 min bei 37 ° C vor der Injektion von ihnen in den Durchflusssystem. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an einem leeren Flusskammer und füllen mit warmem (zB 37 ° C) Durchflusspuffer (siehe Schritt 4.3), um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, bei der Einrichtung the Flusssystem. </li><li> Eine Seite eines leeren Flusskammer in der Spritzenpumpe Strömungssystem durch Verwendung von Silikonschlauch, die einen 20-ml-Spritze, und legte die Strömungskammer in den Mikroskoptisch. </li><li> Die andere Seite eines leeren Flusskammer zu dem Reservoir Kolben mit 37 ° C Vorlauf-Puffer (Abbildung 1B) gefüllt und starten Sie die Spritzenpumpe, um alle Schläuche mit Durchfluss-Puffer zu füllen. Die Pumpe wird die Strömungs-Puffer aus dem Reservoir durch die Durchflusskammer in die Spritze zu ziehen. Hinweis: Dieser Schlauch enthält auch eine in-line Luer Injektionsöffnung, die PMNs mit einer Nadel in einen laufenden Versuch injiziert werden können, ohne den Durchfluss und die Entstehung von Luftblasen. </li><li> Das leere Flusskammer mit dem Strom-Kammer, die TNF-α-behandelten HUVECs ersetzen, schließen Sie das Flusspuffer haltigen Schläuche und legen Sie sie in den Mikroskoptisch (Abbildung 1c). Kneifen Sie die Rohre vor Trennen und Wiederverbinden derm mit den Kammern, welche die HUVECs, als nicht Abquetschen kann bei der Bildung von Luftblasen im Schlauch und / oder Strömungskammern führen. </li><li> Einstellen der Strömungsgeschwindigkeit auf 1 dyn / cm 2 in Übereinstimmung mit physiologischen Strömungsgeschwindigkeit in post Venolen (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Rekorddifferentialinterferenzkontrast (DIC), FITC (488 nm) und Alexa Fluor 647 (647 nm) gleichzeitig mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. </li><li> Spritzen Sie die PMN über die In-Line-Luer Injektionsöffnung (1D) mit 1 ml-Spritzen (Schritt 4.1) langsam in den Flow-System. </li><li> Nach ein paar Minuten, Leukozyten erscheinen, haften und transmigrate. Stoppen Sie das Experiment zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch Abschalten der Schlauch von der Durchflusskammer und Pipettieren Fixierungsmittel (3,7% Formaldehyd in PBS) in die Durchflusskammer. Erlauben Fixierung für 10 min durch Waschen mit PBS. Daten werden mit Imaging-Software (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle) analysiert. HINWEIS: Führen Sie die er-Experiment mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Klimakammer ausgestattet mit einer konstanten Temperatur bei 37 ° C, 5% CO 2 und eine 63X Öl-Ziel. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Aus diesem Protokoll ist es wichtig, die Bildung von Luftblasen in den Strömungskammern zu verhindern, da dies in Zell-Apoptose und eines gestörten Einzelschicht führen. Um dies zu vermeiden, möchten wir betonen, besonderes Interesse auf die Schritte 4.2 und 4.5, in denen die Rohre auf die Strömungskammer angeschlossen bezahlen. Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist das Priming der PMNs, die bei Raumtemperatur durch Inkubation für 15-30 Minuten bei 37 ° C vor dem Einspritzen zu der Strömungskammer (Schritt 4.1) gehalten sind. Dies führt bei der Grundierung von Leukozyten-Integrine, so dass sie auf Adhäsionsmolekülen wie ICAM-1 oder VCAM-1 auf dem Endothel anhaften. Dieses Protokoll ist nicht auf die Transmigration von Neutrophilen zu studieren. Auch andere Leukozyten Typen wie Monozyten oder Lymphozyten verwendet werden. Beachten Sie, dass Schritt 4,1, dh, Grundieren der Leukozyten zwischen Leukozyten-Typen unterscheiden. Es können auch andere Arten von Endothel-Zellen verwendet werden. Für diese kritische bleibtdie Endothelzellen mit geeigneten Entzündungsreize wie TNF-α oder IL-1β stimuliert. Wenn Neutrophile nicht in transmigrating reagiert, kann man überlegen Behandlung der Neutrophilen kurz (5 Minuten) mit N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-phenylalanin (fMLP) Peptid 16. Dadurch werden die Neutrophilen noch weiter zu fördern, insbesondere deren Integrine, was sie anfälliger für am Endothel haften. Typischerweise 1 dyn / cm 2 Fließgeschwindigkeit verwendet wird. Diese Strömungsgeschwindigkeit wird in der Post-Venolen, Websites, auf denen die meisten Leukozyten transendotheliale Migration tritt 17 gemessen. Verwendung der beschriebenen Strömungskammern ist es möglich, Strömungsgeschwindigkeit bis zu 10 dyn / cm 2 zu erhöhen. Es wird jedoch nicht empfohlen, um die Scher weiter zu erhöhen. Es kann zu unerwünschten Leckage von dem Schlauch und Ablösung der Zellen von der Strömungskammer führen. Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieseAntikörper können verwendet werden, zu visualisieren und zu untersuchen, die Dynamik der endothelialen Zell-Zell-Übergänge während der Leukozyten-Diapedese werden. Insbesondere, zusätzlich zu den bestehenden Trans Assays Dieses Protokoll erlaubt es, parazellulären von transzellulären Migration unter physiologischen Flussbedingungen in Echtzeit zu unterscheiden. Da die Antikörper färben die Zell-Zell-Verbindungen, kann man die Anzahl der Leukozyten, die VE-Cadherin / PECAM-1-positiven Kreuzungen überqueren gegen kraft VE-Cadherin / PECAM-1-Stellen punkten. Auf diese Weise transzellulären Migration von parazellulären Migration unterschieden werden. Es ist wichtig zu unterstreichen, dass diese Antikörper nicht mit der Funktion der Proteine ​​zu binden, stören sie: die PECAM-1-Antikörper, die in dieser Studie verwendet wird, gegen die zweite extrazelluläre Domäne gerichtet. Endothelzellen, die in Gegenwart des Antikörpers plattiert wurden keine Defekte in Verstreuen oder Bilden einer Monoschicht zeigen, was darauf hindeutet, dass der Antikörper zumindest nichtstören homotypische Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen. Darüber hinaus, müssen beide Antikörper die Fähigkeit von Neutrophilen an Endothelzellen durch die Monoschicht zu migrieren beeinträchtigen. Zusätzlich wird die Anzahl von Neutrophilen, die durch die endotheliale Monoschicht in der Abwesenheit oder Anwesenheit der Antikörper transmigrieren nicht verändert (Daten nicht gezeigt). Wichtig ist, gibt uns der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die Möglichkeit, verschiedene Fluoreszenzkanäle und DIC gleichzeitig aufnehmen. Somit ermöglicht dieser Test die Untersuchung der Dynamik von VE-Cadherin und PECAM-1 bei der gleichen Zeit, wenn eine neutrophile kreuzt die endothelialen Zell-Zell-Übergang und wird helfen, zu verstehen, warum Leukozyten wählen eine Strecke über die andere, dh gegenüber transpara.

Effiziente und streng kontrollierten Leukozyten transendotheliale Migration (TEM) ist von zentraler Bedeutung bei physiologischen Prozessen wie der Immunüberwachung und akute Entzündungen. Jedoch unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen, unkontrollierte und übermäßige TEM beobachtet, was zu chronischen entzündlichen Erkrankungen (zB rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, Asthma). Auch während der Tumorzellmetastasierung, ist der Prozess der transendothelialen Migration Instrumental für Tumorzellen, um die Zirkulation zu metastasieren 1-3 zu verlassen. Um speziell mit übermäßiger Leukozyten oder Tumorzell TEM stören, ist ein detailliertes Verständnis der Regulation dieses Prozesses erforderlich. Es wird angenommen, daß die TEM-Prozess durch verschiedene Schritte auftritt. Samen Studien, die von Butcher und Springer überprüft vor zwei Jahrzehnten, führte zu dem mehrstufigen Modell den Prozess der TEM 4,5 beschreibt. Dieses Modell gilt immer noch, auch wenn einige adliche Schritte wurden aufgenommen, 6. Alon et al. Die Notwendigkeit für das Vorhandensein immobilisierten Chemokinen auf der Oberfläche des Endothels 7. Kürzlich zeigten sie, dass das Endothel selbst erzeugt Chemokine, die an der endothelialen apikalen Oberfläche 8 dargestellt sind. Darüber hinaus setzen die gleiche Gruppe nach vorne die Bedeutung der Strömungsverhältnisse während der TEM-7. Kürzlich, können mehrere Publikationen zu den zwei verschiedenen Wegen Leukozyten konzentriert in der letzten Phase der TEM Diapedesis nehmen. Sie können entweder über die Zell-Zell-Verbindungen gehen, dh der parazellulären Migrationsroute, oder quer durch die endotheliale Zellkörper, wie der transzellulären Migration Route 9 bekannt. Carman und Kollegen untersuchten diese Wege im Detail und folgerte, dass Leukozyten bevorzugt wählen Sie die parazellulären Migrationsroute (90%) über den transzellulären Weg (10%) beim Überschreiten einer Nabelvenen-Endothelzellen Monolage 10.Wenn jedoch Endothelzellen aus anderen Ursprungs verwendet wurden, zB Gehirn oder Mikrogefäß, verwendet mehr Leukozyten den transzellulären Weg (30%) 11. Die Vestweber Gruppe kürzlich gezeigt, dass, wenn die Zell-Zell-Übergänge konnten voneinander durch Verwendung eines Knock-in-Tiermodell ersetzt endogenen dissoziieren VE-Cadherin für ein VE-Cadherin-Catenin alpha-Chimäre wurde Leukozyten TEM vollständig blockiert 12 . Überraschenderweise stellten die Autoren fest, dass TEM wurde in mehreren blockiert, aber nicht allen, Geweben. Insgesamt zeigen diese Experimente, dass Leukozyten elegant bevorzugt den parazellulären Weg über den transzellulären Weg, auch wenn die regulatorischen Signale, die diese Entscheidung auslösen, sind noch unbekannt. Auch wenn die Mehrheit der Leukozyten bevorzugen den parazellulären Migrationsroute, ist es immer noch schwierig ist, zwischen beiden Wegen zu unterscheiden. Hinzu kommt, dass, obwohl mehrere Studien, die die Rolle der endothelialen Zell-Zell junctIonen, die Dynamik dieser Kreuzungen, insbesondere die Junction-Proteine ​​VE-Cadherin und PECAM-1, während Leukozyten-Überfahrt ist noch immer umstritten. Wir entwickelten einen relativ einfachen Test, bei dem diese Verbindungsstelle Moleküle können in Echtzeit während der Leukozyten-Diapedese unter physiologischen Flussbedingungen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern überwacht werden. Diese Antikörper nicht stören oder blockieren junktionale Integrität oder Mobilität der Zielproteine. Dieser Test ermöglicht es uns, die Dynamik von Proteinen junctional während des Prozesses der parazellulären TEM folgen. Darüber hinaus ermöglicht dieser Test auch Unterscheidung zwischen den para und transzellulären Migrationsrouten.

<table><tbody><tr><td>&mu;-Objektträger VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Strömungskammer</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filter&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze&nbsp;</td><td>BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 g Nadel&nbsp;</td><td>BD Mikrolanze</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albumin&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basalmedium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Wachstumsfaktoren</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>Medien</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhren&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Luer-Injektionsanschluss</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4&bull; 7H2O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>Klon WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fresenius Kabi&nbsp; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisches Trihydrat (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Tygon 3350 Schlauch</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>Schlauch</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe&nbsp;</td><td>Harvard Apparat</td><td>Modellnummer 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>Tumornekrosefaktor</td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Deutschland</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>Klon 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-bildgebung von zell-zell-endothelial junctions während neutrophile transmigration unter physiologischen fluss

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Während der Entzündung, lassen Leukozyten den Kreislauf und über die Endothel zu kämpfen eindringende Krankheitserreger in das darunter liegende Gewebe. Dieser Prozess wird als Leukozyten transendotheliale Migration bekannt. Zwei Wege zur Leukozyten an das Endothel-Monoschicht durchqueren wurden beschrieben: die parazelluläre Route, dh durch die Zell-Zell-Übergänge und dem transzellulären Weg, dh durch die endotheliale Zellkörper. Jedoch ist es technisch schwierig, zwischen dem Parameter und transzelluläre Route unterscheiden. Wir entwickelten eine einfache in vitro-Test, um zu studieren die Verteilung der endogenen VE-Cadherin und PECAM-1 während der Neutrophilen transendotheliale Migration unter physiologischen Flussbedingungen. Vor der Perfusion Neutrophilen wurden Endothelzellen kurz mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen VE-Cadherin und PECAM-1 behandelt. Diese Antikörper nicht mit der Funktion beider Proteine ​​stören, wie durch elektrische Zell Substra bestimmtte Impedanz-Mess und FRAP-Messungen. Unter Verwendung dieses Tests konnten wir folgen die Verteilung der endogenen VE-Cadherin und PECAM-1 während transendotheliale Migration unter Flussbedingungen und zu unterscheiden zwischen den para und transzellulären Migrationsrouten der Leukozyten durch das Endothel.

Zunächst überprüft, wenn die Antikörper nicht mit der Barrierefunktion des Endothels stören. Wir messen den Widerstand der endothelialen Monoschichten mit Hilfe elektrischen Zell-Substrat-Impedanz-Mess (ECIS). Details siehe Van Buul et al. Keine 13 Widerstandsänderung beobachtet wurde, wenn die Anti-VE-Cadherin-fluoreszenzmarkierten Antikörper wurde zu den Zellen (2A) aufgenommen. Ein Anti-VE-Cadherin-Antikörper, gut erkannt zu Block VE-Cadherin-Funktion reduziert den Widerstand drastisch (Abbildung 2A). Auch die für die Bildgebung verwendet werden, nicht die Dynamik zu ändern VE-Cadherin-Antikörper, wie durch Messung der Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) der bewerteten VE-Cadherin-GFP (2B). Nach 1-2 min, Neutrophilen an aktivierten endothelialen Monoschicht anhaftet als könnte im DIC Kanal (3A) dargestellt werden. Nach kriechen 5-30 sec, die große Mehrheit der Neutrophilen transmigrierten durch die endothelialen Monoschicht durch die Zell-Zell-Verbindungen, die mit den gegen PECAM-1 gerichteten Antikörper markiert waren und VE-Cadherin. Während des Prozesses der Diapedese, die Verteilung der VE-Cadherin und PECAM-1 wurde in Echtzeit (3B) folgt. An den Standorten der Neutrophilen-Diapedese, VE-Cadherin wurde lokal gestört und PECAM-1 zeigte eine ringartige Struktur. Nach Beendigung der Diapedese, die Verbindungsstellen nahe und VE-Cadherin und PECAM-1 deutlich an den Stellen der Diapedese (3C) verlagert. Man beachte, dass Teile des Anti-PECAM-1-Antikörper wurden an der Oberfläche der Neutrophilen nachgewiesen, wenn die Neutrophilenzahl erreichte die basolaterale Seite des Endothels. Dies führte jedoch nicht verhindern, dass Neutrophile aus der Überquerung des Endothels. Die beobachtete Dynamik der VE-Cadherin in Echtzeit während der Neutrophilen transendotheliale Migration waren in Übereinstimmung mit der Arbeit von Shaw und Kollegen, diezeigte, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und VE-Cadherin-GFP-transfizierten Endothelzellen, die VE-Cadherin-GFP seitlich diffus, wenn Leukozyten querte die endotheliale Zell-Zell-Verbindungsstellen 14. Arbeiten auch von Su und Mitarbeiter unterstrich unsere Beobachtungen von PECAM-1. Sie zeigten, dass neben lateralen VE-Cadherin Diffusion auf Leukozyten Passage wurde PECAM-1 lokal in einem Ring um die transmigrating neutrophilen 15 verteilt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> Abbildung 1. In-vitro-Flusskammer. (A) Der Pfeil zeigt das Reservoir, aus dem das Medium muss aktualisiert werden. (B) Silikonschlauch, der die Strömungskammer mit dem in-line Luer Einspritzöffnung zum Einspritzen von PMNs ohne Lösen der Rohrleitung (Pfeilspitze) verwendet verbindet. (C) ConnReflexion eines leeren Flusskammer zu dem Reservoir Kolben mit 37 ° C Vorlaufpuffer (Pfeilspitze) gefüllt. (D) Verbindung der Strömungskammer mit dem TNF-α-behandelten HUVECs zur Strömungs-Puffer enthaltenden Schlauch und in dem Mikroskoptisch (Pfeilkopf) angeordnet ist. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> Abbildung 2. VE-Cadherin Antikörper nicht mit Junction-Dynamik oder die Funktion stören. (A) Endothelial Zellschicht Impedanz wird mit ECIS gemessen. Y-Achse drückt Impedanz in Ohm und x-Achse die Zeit in Stunden. VE-Cadherin-Antikörper Klon 55-7H1, mit Alexa647 (blaue Linie) markiert oder Isotyp IgG-Alexa647 Kontrolle (rote Linie) nicht endothelialen Zellschicht Impedanz nicht verändern, während die VE-Cadherin-blockierenden Antikörper CL75 (schwarze Linie) haben reduzieren die Impedanz . (B <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> Figur 3 VE-Cadherin und PECAM-1-Verteilung während Neutrophilen TEM in Echtzeit. (A) Neutrophile (mit weißer Linie gekennzeichnet) auf dem Endothel anhaften und über den Zell-Zell-Übergang, ohne die Verteilung der VE-Cadherin und PECAM -1. (B) über den Neutrophilen-Endothel-Monoschicht durch die Zell-Zell-Verbindungen. Eine lokale Dispersion der VE-Cadherin und PECAM-1 kann beobachtet werden, wenn eine Neutrophilen durch Zell-Zell-Junctions vorsteht. Weiße Linie zeigt Neutrophilen Gegenwart noch an der Spitze des Endothels. Gelbe Linie zeigt Neutrophilen Membran that ist bereits unter Endothel. (C) Neutrophile vollständig überquerte die endothelialen Monolayer. VE-Cadherin und PECAM-1 werden an den Standorten der Diapedese verlegt. Gelbe Linie zeigt Grenzen der transmigrierten Neutrophilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verteilung von endogenem junktionalem, Terin und pcam während der transendothelialen Migration von Leukozyten unter physiologischen Strömungsbedingungen zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst polymorphkernige Leukozyten oder PMNs aus dem Vollblut gesunder Probanden mit Hilfe eines Proco-Gradienten isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, fluoreszenzmarkierte Antikörper zu einer mit TNF alpha stimulierten Endothelzell-Monoschicht der menschlichen Nabelvene hinzuzufügen, die 30 Minuten vor Beginn des Flow-Experiments in Flow-Objektträgern kultiviert wurde.Dies wird es ermöglichen, die Konjunktionsdynamik von Endothelzellen während der Transmigration von Neutrophilen unter physiologischen Strömungsbedingungen sichtbar zu machen. Als nächstes wird der Objektträger, der die fluoreszenzmarkierten TNF alpha-stimulierten menschlichen Endothelzellen der Nabelschnurvene enthält, mit dem Flusssystem verbunden und auf dem Mikroskoptisch platziert. Die Pumpe zieht den Strömungspuffer aus dem Behälter durch die Durchflusskammer in die Spritze.Der letzte Schritt besteht darin, die PMNs langsam über die Injektionsöffnung in das Durchflusssystem zu injizieren. Abschließend werden die PMNs mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop visualisiert. Nach einigen Minuten erscheinen Leukozyten, adhäsieren und transmigrieren.Das Experiment kann jederzeit gestoppt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden wie statischen Transmigrationsassays besteht darin, dass Sie mit dieser Technik Adhäsion und Transmigration im wirklichen Leben unter physiologischen Strömungsbedingungen untersuchen können. Dies wird uns helfen zu verstehen, warum Leukozyten eine Wurzel der anderen vorziehen, also PGA versus transzelluläre Migration.Dazu machen wir die Zellverbindungen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern sichtbar. Die Endothelzellen der menschlichen Nabelvene oder HU X für dieses Experiment werden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf mit Fibronektin beschichteten Schalen unter Verwendung von Medien kultiviert, die mit Endothelwachstum ergänzt sind. Mittel. Die Zellkultur wird zwischen vier und acht Durchgängen verwendet, wenn die Zellen 80 bis 90 % erreichenConfluence waschen Sie sie vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur bei pH 7,4 und dann ist Trypsin die Zellen nach Trypsin und Zentrifugation.Wir suspendieren bei 800.000 Zellen pro Milliliter mit Medien. Für das Experiment werden Strömungskammern verwendet, die auf der Platte des Vortages mit Fibronektin beschichtet wurden. 80.000 Zellen in jeden einzelnen Kanal der Fibronektin-kodierten Flusskammern und pipettieren die Zellsuspension am nächsten Tag vorsichtig über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf und ab.Frischen Sie das Medium im Schieber der Durchflusskammer auf, indem Sie den Schieber vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad neigen. Es wird empfohlen, das Medium nur in den Behältern und nicht im Kanal selbst zu entfernen. Die Entfernung des Mediums in den Kanälen kann aufgrund der durch das Pipettieren verursachten Zugkraft des Mediums zum Verlust und Tod der Endothelzellen führen.Prüfen Sie mit der Phasenkontrastmikroskopie, ob die Endothelzellen eine Monoschicht gebildet haben. Wenn die Zellen nicht zu 100 % kofluent sind, wechseln Sie das Medium zweimal täglich, bis sie 100 % Konfluenz erreichen. Sobald die Zellen eine Flüssigkeit von 100 % erreicht haben, stimulieren sie die Zellen mit Medien, die den Entzündungsmediator enthalten.Die Stimulierung von UIX durch TNF alpha durch TNF alpha über Nacht führt zu einem entzündlichen Phänotyp des Endothels IE und einer Hochregulierung von Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM one und VA M1. Vor der Isolierung von polymorphkernigen Leukozyten oder PMNs: Bereiten Sie einen Flow-Puffer zum Waschen isolierter PMNs und zur Verwendung im Flow-Assay auf 100 Milliliter einer zuvor vorbereiteten Stammlösung vor. Bei 100 Mikrolitern frischem einmolaren Calciumchlorid, 2,5 Millilitern Humanalbumin aus einer Stammkonzentration von 200 Gramm pro Liter und 0,1 Gramm Glukose.Filtrieren Sie den Strömungspuffer mit einem 0,45-Mikron-Filter. Eine 10%ige Trinatriumcitrat- oder TNC-Lösung in PBS bei pH 7,4 wird ebenfalls vor der Isolierung von PMNs hergestellt. PMNs werden aus 20 Millilitern Vollblut isoliert, das in einer Natriumheparinette von einem gesunden Freiwilligen entnommen wurde.Verdünnen Sie zunächst das Vollblut eins zu eins mit 10%PBST NNC in einem 15 Milliliter Röhrchen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette auf der langsamsten Einstellung, um vorsichtig 20 Milliliter verdünntes Blut auf 12,5 Milliliter kolloidale Lösung pro Co in Wasser mit einer Dichte von 1,130 Gramm pro Milliliter in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen zu pipettieren. Das Röhrchen, das pro Coll enthält, sollte während der Zugabe des Blutes in einem Winkel von 45 Grad gekippt werden.Legen Sie die Röhrchen vorsichtig in die Zentrifuge und drehen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800 G mit geringer Beschleunigung und bei deaktivierten Bremsen, wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und füllen Sie jedes Röhrchen mit eiskaltem Erythrozyten-Lysepuffer, um die Erythrozyten zu verlyten. Lassen Sie die Schläuche auf Eis und drehen Sie sie gelegentlich um, bis die Federung bei 500 GS fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei aktivierten Bremsen dunkelrot zentrifugiert.Die resultierende Pelletfraktion enthält die PMNs Zusammen mit den Erythrozyten entfernen Sie den Überstand und waschen das Pellet zweimal in Eis. Kaltlysepuffer bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Entfernen des Überstands aus der zweiten Wäsche wird das Pellet mit einem Strömungspuffer bei Raumtemperatur wieder suspendiert und die PMN-Konzentration mit einem automatischen Zellzähler bestimmt.Zum Schluss werden die PMNs in einem Flusspuffer von eins mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter suspendiert und bei Raumtemperatur aufbewahrt, um endotheliales junktionales VA-Cadherin und pcam eins zu markieren. Den pcam LOR 6 47 Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 100 und den Calcium-unabhängigen FE-Cadherin-ZI-Antikörper in einer Verdünnung von 1 bis 50 in eine VE-Kultur, Medium in die Durchflusskammer geben und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die PMNs für den Assay vorzubereiten, legen Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad, bevor Sie sie in das Durchflusssystem injizieren.Schließen Sie den Schlauch an eine leere Durchflusskammer an und füllen Sie ihn mit einem Warmströmungspuffer, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Beim Einrichten des Durchflusssystems. Verbinden Sie mit einem Silikonschlauch eine Seite der leeren Durchflusskammer mit dem Durchflusssystem der Spritzenpumpe, das eine 20-Milliliter-Spritze enthält.Stellen Sie die Durchflusskammer auf den Mikroskoptisch. Der Assay wird mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt, das mit dem 63-fach-Ölobjektiv und einer Klimakammer ausgestattet ist, die auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Verbinden Sie die andere Seite der leeren Durchflusskammer mit dem mit 37 Grad Celsius gefüllten Vorratskolben und starten Sie die Spritzenpumpe, um alle Schläuche mit dem Durchflusspuffer zu füllen, die Pumpe zieht den Durchflusspuffer aus dem Behälter durch die Durchflusskammer in die Spritze.Dieser Schlauch enthält auch einen Inline-Köder-Injektionsanschluss, der es ermöglicht, PMNs mit einer Nadel in ein laufendes Experiment zu injizieren, ohne den Fluss zu stoppen und Luftblasen zu erzeugen. Ersetzen Sie anschließend die leere Durchflusskammer durch die Durchflusskammer mit TNF alpha-behandeltem VE Klemmen Sie die Schläuche ab, bevor Sie sie trennen und wieder mit der Kammer verbinden, in der sich die VE.To Luftblasen im System zu vermeiden, ist es wichtig, die Schläuche einzuklemmen und abzuklemmen. Beim Verbinden der Folie, die die Zellen enthält.Platzieren Sie die Strömungskammer auf dem Mikroskoptisch, stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf einen Cent im Quadrat entsprechend der physiologischen Strömungsgeschwindigkeit in Nachkapillaren ein, die ein bis fünf Dines pro Quadratzentimeter beträgt, Rekord differentieller Interferenzkontrast oder DIC fite LOR 6 47. Injizieren Sie das PMN gleichzeitig mit einer Ein-Milliliter-Spritze langsam über den Inline-Köder-Injektionsanschluss in das Flow-System. Nach einigen Minuten erscheinen Leukozyten, adhäsieren und transmigrieren und stoppen das Experiment zu jedem gewünschten Zeitpunkt.Durch Trennen des Schlauches von der Durchflusskammer und Pipettieren des Fixiermittels in die Durchflusskammer wurde der Widerstand der endothelialen Monoschichten gemessen, um zu testen, ob die Antikörper die Barrierefunktion des Endothels beeinträchtigen. Es wurde keine Veränderung der Resistenz beobachtet, wenn entweder der VE einen Antikörperklon 55, 7 H hören konnte oder die Isotypkontrolle den Zellen hinzugefügt wurde. Im Gegensatz dazu reduzierte der VE-Kabeljau-Hear-Blocking-Antikörper CL 75 die Resistenz drastisch.Die RAP-Analyse ergab keine Veränderung der Fluoreszenzerholung in Gegenwart oder Abwesenheit des VE CADHERIN 55 7 H 1-Antikörpers, was darauf hindeutet, dass der Antikörper die Dynamik der Verteilung von VE Cadherin, VE Cadherin und pcam 1 während der transendothelialen Migration oder TEM der Neutrophilen nicht in Echtzeit veränderte. Das obere Bild zeigt ein weiß umrandetes Neutrophil, das am Endothel haftet und die Zell-Zell-Verbindung durchquert, ohne die Verteilung von VE kohärent und pcam eins zu beeinträchtigen. Während der Diapedese kann eine lokale Dispersion von VE kohärent und P chem eins beobachtet werden, wenn ein Neutrophiler durch die Zelle zu den weiß umrandeten Zellübergängen herausragt.Der gelbe Umriss zeigt die neutrophile Membran, die sich bereits unter dem Endothel befindet. Nach Abschluss der Diapedese schließen sich die Übergänge und ve kohärent und pcam one werden an die Stellen der Diapedese verlegt. Die Grenzen der transmigrierten Neutrophilen sind gelb umrandet.Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine transendotheliale Migration von Leukozyten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob Leukozyten das Endothel mit Hilfe des Bagga oder der transzellulären Wurzel durchqueren.

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Research

Forschung

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Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

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