Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verteilung von endogenem junktionalem, Terin und pcam während der transendothelialen Migration von Leukozyten unter physiologischen Strömungsbedingungen zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst polymorphkernige Leukozyten oder PMNs aus dem Vollblut gesunder Probanden mit Hilfe eines Proco-Gradienten isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, fluoreszenzmarkierte Antikörper zu einer mit TNF alpha stimulierten Endothelzell-Monoschicht der menschlichen Nabelvene hinzuzufügen, die 30 Minuten vor Beginn des Flow-Experiments in Flow-Objektträgern kultiviert wurde.

Dies wird es ermöglichen, die Konjunktionsdynamik von Endothelzellen während der Transmigration von Neutrophilen unter physiologischen Strömungsbedingungen sichtbar zu machen. Als nächstes wird der Objektträger, der die fluoreszenzmarkierten TNF alpha-stimulierten menschlichen Endothelzellen der Nabelschnurvene enthält, mit dem Flusssystem verbunden und auf dem Mikroskoptisch platziert. Die Pumpe zieht den Strömungspuffer aus dem Behälter durch die Durchflusskammer in die Spritze.

Der letzte Schritt besteht darin, die PMNs langsam über die Injektionsöffnung in das Durchflusssystem zu injizieren. Abschließend werden die PMNs mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop visualisiert. Nach einigen Minuten erscheinen Leukozyten, adhäsieren und transmigrieren.

Das Experiment kann jederzeit gestoppt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden wie statischen Transmigrationsassays besteht darin, dass Sie mit dieser Technik Adhäsion und Transmigration im wirklichen Leben unter physiologischen Strömungsbedingungen untersuchen können. Dies wird uns helfen zu verstehen, warum Leukozyten eine Wurzel der anderen vorziehen, also PGA versus transzelluläre Migration.

Dazu machen wir die Zellverbindungen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern sichtbar. Die Endothelzellen der menschlichen Nabelvene oder HU X für dieses Experiment werden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf mit Fibronektin beschichteten Schalen unter Verwendung von Medien kultiviert, die mit Endothelwachstum ergänzt sind. Mittel. Die Zellkultur wird zwischen vier und acht Durchgängen verwendet, wenn die Zellen 80 bis 90 % erreichenConfluence waschen Sie sie vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur bei pH 7,4 und dann ist Trypsin die Zellen nach Trypsin und Zentrifugation.

Wir suspendieren bei 800.000 Zellen pro Milliliter mit Medien. Für das Experiment werden Strömungskammern verwendet, die auf der Platte des Vortages mit Fibronektin beschichtet wurden. 80.000 Zellen in jeden einzelnen Kanal der Fibronektin-kodierten Flusskammern und pipettieren die Zellsuspension am nächsten Tag vorsichtig über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf und ab.

Frischen Sie das Medium im Schieber der Durchflusskammer auf, indem Sie den Schieber vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad neigen. Es wird empfohlen, das Medium nur in den Behältern und nicht im Kanal selbst zu entfernen. Die Entfernung des Mediums in den Kanälen kann aufgrund der durch das Pipettieren verursachten Zugkraft des Mediums zum Verlust und Tod der Endothelzellen führen.

Prüfen Sie mit der Phasenkontrastmikroskopie, ob die Endothelzellen eine Monoschicht gebildet haben. Wenn die Zellen nicht zu 100 % kofluent sind, wechseln Sie das Medium zweimal täglich, bis sie 100 % Konfluenz erreichen. Sobald die Zellen eine Flüssigkeit von 100 % erreicht haben, stimulieren sie die Zellen mit Medien, die den Entzündungsmediator enthalten.

Die Stimulierung von UIX durch TNF alpha durch TNF alpha über Nacht führt zu einem entzündlichen Phänotyp des Endothels IE und einer Hochregulierung von Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM one und VA M1. Vor der Isolierung von polymorphkernigen Leukozyten oder PMNs: Bereiten Sie einen Flow-Puffer zum Waschen isolierter PMNs und zur Verwendung im Flow-Assay auf 100 Milliliter einer zuvor vorbereiteten Stammlösung vor. Bei 100 Mikrolitern frischem einmolaren Calciumchlorid, 2,5 Millilitern Humanalbumin aus einer Stammkonzentration von 200 Gramm pro Liter und 0,1 Gramm Glukose.

Filtrieren Sie den Strömungspuffer mit einem 0,45-Mikron-Filter. Eine 10%ige Trinatriumcitrat- oder TNC-Lösung in PBS bei pH 7,4 wird ebenfalls vor der Isolierung von PMNs hergestellt. PMNs werden aus 20 Millilitern Vollblut isoliert, das in einer Natriumheparinette von einem gesunden Freiwilligen entnommen wurde.

Verdünnen Sie zunächst das Vollblut eins zu eins mit 10%PBST NNC in einem 15 Milliliter Röhrchen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette auf der langsamsten Einstellung, um vorsichtig 20 Milliliter verdünntes Blut auf 12,5 Milliliter kolloidale Lösung pro Co in Wasser mit einer Dichte von 1,130 Gramm pro Milliliter in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen zu pipettieren. Das Röhrchen, das pro Coll enthält, sollte während der Zugabe des Blutes in einem Winkel von 45 Grad gekippt werden.

Legen Sie die Röhrchen vorsichtig in die Zentrifuge und drehen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800 G mit geringer Beschleunigung und bei deaktivierten Bremsen, wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und füllen Sie jedes Röhrchen mit eiskaltem Erythrozyten-Lysepuffer, um die Erythrozyten zu verlyten. Lassen Sie die Schläuche auf Eis und drehen Sie sie gelegentlich um, bis die Federung bei 500 GS fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei aktivierten Bremsen dunkelrot zentrifugiert.

Die resultierende Pelletfraktion enthält die PMNs Zusammen mit den Erythrozyten entfernen Sie den Überstand und waschen das Pellet zweimal in Eis. Kaltlysepuffer bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Entfernen des Überstands aus der zweiten Wäsche wird das Pellet mit einem Strömungspuffer bei Raumtemperatur wieder suspendiert und die PMN-Konzentration mit einem automatischen Zellzähler bestimmt.

Zum Schluss werden die PMNs in einem Flusspuffer von eins mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter suspendiert und bei Raumtemperatur aufbewahrt, um endotheliales junktionales VA-Cadherin und pcam eins zu markieren. Den pcam LOR 6 47 Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 100 und den Calcium-unabhängigen FE-Cadherin-ZI-Antikörper in einer Verdünnung von 1 bis 50 in eine VE-Kultur, Medium in die Durchflusskammer geben und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die PMNs für den Assay vorzubereiten, legen Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad, bevor Sie sie in das Durchflusssystem injizieren.

Schließen Sie den Schlauch an eine leere Durchflusskammer an und füllen Sie ihn mit einem Warmströmungspuffer, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Beim Einrichten des Durchflusssystems. Verbinden Sie mit einem Silikonschlauch eine Seite der leeren Durchflusskammer mit dem Durchflusssystem der Spritzenpumpe, das eine 20-Milliliter-Spritze enthält.

Stellen Sie die Durchflusskammer auf den Mikroskoptisch. Der Assay wird mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt, das mit dem 63-fach-Ölobjektiv und einer Klimakammer ausgestattet ist, die auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Verbinden Sie die andere Seite der leeren Durchflusskammer mit dem mit 37 Grad Celsius gefüllten Vorratskolben und starten Sie die Spritzenpumpe, um alle Schläuche mit dem Durchflusspuffer zu füllen, die Pumpe zieht den Durchflusspuffer aus dem Behälter durch die Durchflusskammer in die Spritze.

Dieser Schlauch enthält auch einen Inline-Köder-Injektionsanschluss, der es ermöglicht, PMNs mit einer Nadel in ein laufendes Experiment zu injizieren, ohne den Fluss zu stoppen und Luftblasen zu erzeugen. Ersetzen Sie anschließend die leere Durchflusskammer durch die Durchflusskammer mit TNF alpha-behandeltem VE Klemmen Sie die Schläuche ab, bevor Sie sie trennen und wieder mit der Kammer verbinden, in der sich die VE.To Luftblasen im System zu vermeiden, ist es wichtig, die Schläuche einzuklemmen und abzuklemmen. Beim Verbinden der Folie, die die Zellen enthält.

Platzieren Sie die Strömungskammer auf dem Mikroskoptisch, stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf einen Cent im Quadrat entsprechend der physiologischen Strömungsgeschwindigkeit in Nachkapillaren ein, die ein bis fünf Dines pro Quadratzentimeter beträgt, Rekord differentieller Interferenzkontrast oder DIC fite LOR 6 47. Injizieren Sie das PMN gleichzeitig mit einer Ein-Milliliter-Spritze langsam über den Inline-Köder-Injektionsanschluss in das Flow-System. Nach einigen Minuten erscheinen Leukozyten, adhäsieren und transmigrieren und stoppen das Experiment zu jedem gewünschten Zeitpunkt.

Durch Trennen des Schlauches von der Durchflusskammer und Pipettieren des Fixiermittels in die Durchflusskammer wurde der Widerstand der endothelialen Monoschichten gemessen, um zu testen, ob die Antikörper die Barrierefunktion des Endothels beeinträchtigen. Es wurde keine Veränderung der Resistenz beobachtet, wenn entweder der VE einen Antikörperklon 55, 7 H hören konnte oder die Isotypkontrolle den Zellen hinzugefügt wurde. Im Gegensatz dazu reduzierte der VE-Kabeljau-Hear-Blocking-Antikörper CL 75 die Resistenz drastisch.

Die RAP-Analyse ergab keine Veränderung der Fluoreszenzerholung in Gegenwart oder Abwesenheit des VE CADHERIN 55 7 H 1-Antikörpers, was darauf hindeutet, dass der Antikörper die Dynamik der Verteilung von VE Cadherin, VE Cadherin und pcam 1 während der transendothelialen Migration oder TEM der Neutrophilen nicht in Echtzeit veränderte. Das obere Bild zeigt ein weiß umrandetes Neutrophil, das am Endothel haftet und die Zell-Zell-Verbindung durchquert, ohne die Verteilung von VE kohärent und pcam eins zu beeinträchtigen. Während der Diapedese kann eine lokale Dispersion von VE kohärent und P chem eins beobachtet werden, wenn ein Neutrophiler durch die Zelle zu den weiß umrandeten Zellübergängen herausragt.

Der gelbe Umriss zeigt die neutrophile Membran, die sich bereits unter dem Endothel befindet. Nach Abschluss der Diapedese schließen sich die Übergänge und ve kohärent und pcam one werden an die Stellen der Diapedese verlegt. Die Grenzen der transmigrierten Neutrophilen sind gelb umrandet.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine transendotheliale Migration von Leukozyten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob Leukozyten das Endothel mit Hilfe des Bagga oder der transzellulären Wurzel durchqueren.