Name: Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Lernen Sie die FIONA-Technik zur Lokalisierung einzelner Fluorophore mit Nanometerpräzision. Diese Methode ermöglicht die präzise Messung von Myosin-Schrittgrößen auf Aktin und liefert wertvolle Einblicke in molekulare Motoren.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Grants 068.625, NSF Zuschüsse 1.063.188 und Center der Physik von lebenden Zellen 0822613. Besonderer Dank geht an Dr. Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology für das Geschenk von Kaninchenaugen unterstützt.

Ethik-Erklärung: Die Hornhaut Gewebe von Kaninchen wurde in Übereinstimmung mit der Universität von Illinois Institutional Animal Care und Verwenden Richtlinien gesammelt. 1. TIRFM-Setup HINWEIS: Tragen Laser-Schutzbrille die ganze Zeit. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle in der Liste der Materialien aufgeführt notwendigen optischen Komponenten sind verfügbar und bereit für die Ausrichtung. Falls erforderlich, verwenden Ersatz mit gleichwertigen Funktionen von anderen Unternehmen. Stellen Sie sicher, dass Spiegel und Linsen sollten Antireflexbeschichtungen (AR) passend zum Laser im Einsatz haben. </li><li> Stellen Sie die Höhen aller optischen Komponenten auf die Höhe des Zentrums des Mikroskops zurück Port. </li><li> Montieren Sie den Laser, Laser-Shutter und ND-Filter (n). ND-Filter, um die Laserleistung so gering wie möglich zu dämpfen, nach unten, während die Balken sichtbar. Ziehen Sie die Schrauben mit entsprechenden Sechskantschlüssel. </li><li> Planen Sie ein Strahlengang und markieren Sie es mit Klebeband oder Markierung auf der optischen Tisch (dotTed blauen Linien in Abbildung 1). Der Einfachheit halber halten gerade Wege entlang der Linien von Löchern auf der optischen Tisch. </li><li> Ort Spiegel M1 (Abbildung 1) an der ersten rechten Winkel dran. Legen Sie die beiden Blenden entlang der zweiten geraden Abschnitt der geplanten Strahlengang. Einzustellen sowohl die Position und die Neigung des M1, so dass die Laser geht durch die Iris. </li><li> Ort Spiegel M2 (Abbildung 1) an der zweiten rechten Winkel dran. Legen Sie das 10X Beam Expander (L1 L2 &amp;, Abbildung 1) entlang der dritten geraden Abschnitt des Pfades. Seine Neigung einzustellen, so dass die Strahlaufweitung parallel zu sowohl der optischen Tabelle und der geplanten Strahlengang ist. <ol><li> Einzustellen M1 und M2 iterativ so dass die Laser geht geradlinig durch die Zentren der beiden Linsen der Strahlaufweiter. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Strahlprofil des aufgeweiteten Strahl ist nicht-begrenzten Gauß. </li></ol></li><li> Stellen Sie M1, um den Strahl auf L1 zentrieren (FiGüre 1) und M2, um den Strahl auf L2 (1) iterativ zu zentrieren. Eine schlechte Strahlprofil bedeutet in der Regel der Laser abgeschnitten; verwenden Sie ein Stück weißes Papier, um den Strahl nach der Strahlaufweitung zu blockieren, um die Strahlprofil mit den Augen zu überprüfen. Für hochgenaue Analyse, verwenden Sie einen optischen Strahl Profiler. </li><li> Den Abstand zwischen L1 und L2, so daß der Strahl kollimiert. Wiederholen Sie Schritt 1.8 und 1.9, wenn nötig. HINWEIS: Wenn die Strahlgröße nicht mit der Entfernung ändern, ist der Strahl gebündelten genug für eine TIRFM-Setup. Um die Strahlkollimation weiter zu verbessern, könnte Werkzeuge wie Scheren-Interferometer verwendet werden. Eine typische Strahlgröße nach der Expansion ist ~ 20 mm. </li><li> Shutter des Lasers. Schrauben Sie den Mikroskopobjektiv und schrauben in einer Leuchtstoffausrichtungsziel. Ort Spiegel M3 und M4 (1), um den expandierten Strahl in den Mikroskopöffnung und auf den dichroitischen Spiegel in dem Revolverkopf zu leiten. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl springt ter dichroitische und gegen die Decke. </li><li> Passen M3, um die hellste Teil des Lichtstrahls auf dem Leucht Target Center und M4, um die Strahlneigung einstellen vertikal zu werden. </li><li> Shutter des Lasers und schrauben das Ziel wieder ein. Wenn die Ausrichtung im vorherigen Schritt ist getan und sollte es eine symmetrische Ort Verlassen des Ziel sein. Feinabstimmung der Neigungen von M3 und M4, die Laserleistung und Strahlprofil aus dem Ziel zu optimieren. </li><li> Montieren Sie eine EM-CCD Kamera mit dem Mikroskop und schließen Sie die Kamera an einen Computer. Starten der Software für die Kamera. </li><li> Montieren Sie eine Leuchtstoffprobe (Lösung von Fluorophore) auf dem Mikroskop. Schauen Sie sich die hell fluoreszierende Fleck auf der Kamera. Überprüfen Sie, dass der Spot nicht auf dem Bildschirm verschieben, wenn der Fokus geändert wird. </li><li> Platzieren Sie die TIR-Linse (L3, 1) auf der XYZ-Stufe in einem Abstand von der hinteren Brennebene des Objektivs, die gleich der Brennweite der L3 (~ 30 cm) ist. Stellen Sie die Position der L3so dass die Laser geht durch das Zentrum der Linse. </li><li> Übersetzen L3 entlang des Strahlengangs um die Strahlkollimation einzustellen. Sicherstellen, dass der Strahl immer noch auf dem Bildschirm zentriert und in der Form symmetrisch. HINWEIS: Die Beleuchtungsbereich an den Probenebene steigt mit abnehmender TIR-Linse Brennweite. In der Regel verwenden die kleinste Brennweite, am Set-up passen. </li><li> Übersetzen L3 senkrecht zum Strahlengang, um den Strahl von dem Ziel zu kippen. Halten der Übersetzung des TIR-Linse derart, daß TIR erreicht. Eine Probe von fluoreszierenden Kügelchen beobachten durch die EM-CCD-Kamera, und die Feinabstimmung L3 gute SNR zu erhalten. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500"> Abbildung 1. Optische Konfiguration für Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM). 2. FIONA auf Cy3-DNA <ol><li> Cschlanke Objektträgern und Deckgläsern: Spülen Objektträgern und Deckgläsern mit ddH2O und Isopropanol und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas; Legen Sie die Folien und Deckgläser in der Plasmareiniger für 5 min unter Argon-Plasma. </li><li> Konstrukt Probenkammern (wie in Figur 2 skizziert). <ol><li> Legen Sie ein Gewebe auf der Bank und dann legte ein Stück Papier Linse auf der Oberseite des Gewebes. Legen Sie die Folie auf der Linse Papier. Stellen Sie sicher, dass der sauberen Seite der Folie nach oben zeigt. </li><li> Gelten zwei Streifen von doppelseitigem Klebeband auf die Folie entlang der Längskanten, wobei ein Spalt von 3-5 mm in der Mitte. Legen Sie die gereinigten Deckglas der Folie. Stellen Sie sicher, dass die saubere Seite des Deckglases wird die Folie gegenüber. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze nach unten über das doppelseitige Klebeband drücken. Verwenden Sie einen Rasierer, um überschüssige Band aus der Folie zu entfernen, so dass das Band nur noch unter dem Deckglas. HINWEIS: Die offenen Enden der Kammer offen gelassen und dienen als Einlass und auslassen. Das Kammervolumen beträgt mehrere Mikroliter. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500"> Abbildung 2. Skizze einer typischen Probenkammer (a) Draufsicht. (B) Seitenansicht von rechts; (C) Seitenansicht von vorne. <ol start="3"><li> Immobilisierung von Cy3-DNA auf den inneren Oberflächen der Probenkammern. <ol><li> Bereiten T-50-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Vorbereitung BSA-Biotin in T-50 in einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Vorbereitung T50-BSA-Puffer durch Lösen von BSA in T-50 in einer Endkonzentration von 10 mg / ml. </li><li> Planen 0,5 mg / ml Neutravidin in T50-BSA-Puffer. Vorbereitung biotinylierten Cy3 markierter DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA in einer Endkonzentration von 5-10 pM. </li><li> Je 10 ul BSA-Biotin (1 mg / ml) in die Probenkammer. Warten Sie 5 min. </li><li waschen sie die kammer mit ul t50-bsa. je neutravidin mg ml in probenkammer. inkubation f min.><li> Die Kammer mit 40 ul T50-BSA waschen. Je 20 ul Cy3-DNA in die Probenkammer. Inkubation für 5 min und dann waschen die Kammer mit 80 ul T50-BSA. </li></ol></li><li> Bild Cy3-DNA-Einzelmolekülen unter TIRFM. <ol><li> Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen von 1 ul Protocatechuat 3,4-Dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 ul Protocatechusäure (PCA, 62,5 mM), 50 ul 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbonsäure (Trolox, 2 mM in T-50) und 45 ul T50-BSA. </li><li> Pipette in 30 ul Imaging Puffer und warten 8-10 min. </li><li> Montieren Sie die Probe für die Bildgebung auf einem TIRFM, die mit einem grünen Laser (532 nm) ausgestattet ist, eine 100X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,45) und eine EM-CCD-Kamera. </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 bis 500 ms und EM Gewinn auf 25 bis 100. Erwerben Sie einen Film der Probe für 1,000 Frames. </li></ol></li><li> Führen FIONA die Analyse der Daten der aufgenommenen Bilder von Cy3-DNA. <ol><li> Bestimmen Sie die effektive Pixelgröße (dh Umrechnungsfaktor von Pixel zu Nanometer) durch Division der physikalischen Pixelgröße (gelesen aus dem Datenblatt des EMCCD-Kamera) durch die Gesamtvergrößerung (die Vergrößerung des Mikroskopobjektivs multipliziert mit irgendwelche zusätzlichen Vergrößerung). </li><li> Bestimmung der Umwandlungsfaktor von Pixelintensitäten zu Nummern durch Dividieren CCD-Empfindlichkeit (dh Elektronen pro A / D-Zählung aus dem Datenblatt der CCD-Kamera gelesen) von der Elektronenvervielfacher (EM) Zunahme während der Bildaufnahme verwendet Photon. </li><li> Kompilieren und ausführen FIONA.pro für FIONA-Analyse. Verwenden Sie diese IDL-Programm, das erworbene Bild zu importieren, die Eingabe der effektiven Pixelgröße (aus Schritt 2.5.1) und dem Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) und um Punkte für FIONA Analyse wählen. HINWEIS: Am Ende, das Program mit Ausgabe der Anpassungsergebnisse mit 2D Gauß-Funktionen, sowie Gesamtphotonenzahlen und Lokalisierungsgenauigkeit. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse und 4c-4d gezeigt. </li><li> Kompilieren und ausführen phcount.pro zu Photonenzahl zu charakterisieren. Verwenden Sie diese IDL-Programm, um die durchschnittliche Anzahl der Photonen, die von einem Fluorophor vor Photobleaching emittiert wird, um das erfasste Bild und die Eingabe der Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) zu importieren. HINWEIS: Das Programm wird dann automatisch zu erkennen fluoreszierende Flecken (manuelle Auswahl ist eine Option) berechnen Photonen als Funktion der Rahmennummer und geben die Spuren von Photonen. <ol><li> Verwerfen schlechte Spuren und geben Rahmen Bereiche after photo für Basislinienkorrektur. Am Ende wird das Programm Ausgabe eine Liste der Gesamtphotonenzahlen für alle Flecken nicht verworfen. Dann zeichnen Sie die Verteilung der Photonenzahlen und passen die Verteilungtion mit einem exponentiellen Abfall, um die durchschnittliche Photonenzahl zu erhalten. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse gezeigt und Fakten 4e-4f. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Angewandte FIONA zu Motor (zB Myosin auf Aktin) Dynamik auf der Nanometerskala zu quantifizieren <ol><li> Polymerisieren Aktin (dh vorzubereiten F-Actin) einen Tag vor FIONA Experiment. <ol><li> Rekonstituieren G-Aktin (Monomer) und Biotin G-Aktin (Monomer) bis 10 mg / allgemeiner Actin-Puffer ml. Rühren, um sicherzustellen, dass beide vollständig gelöst und halten sowohl auf Eis. </li><li> Mischungs 10 ul G-Aktin (Monomer) mit 1,7 ul Biotin-G-Aktin in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l eiskaltem Puffer Aktin-Polymerisation. </li><li> Wird die Mischung über Nacht bei 4 ° C (F-Aktin) gebildet und fügen ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 1 ml. </li><li> Speichern der Aktin-Filamente (F-Actin) bei 4 ° C für die spätere Verwendung in den Experimenten. HINWEIS: Filamente zerfallen und über die Zeit zu verkürzen, kann jedoch für mindestens zwei Wochen verwendet werden. </li></ol></li><li> Probe vorbereiten für die Bildgebung. <ol><li> Machen Sie eine Probenkammer (in Protokoll 2.1 und 2.2 beschrieben). Pipette in 20 ul biotinyliertes BSA 1 mg / ml in ddH 2 O. Inkubation für 10 min. Spülen Sie mit 30 ul ddH 2 O. HINWEIS: Dies blockiert die Glasoberfläche und legt Biotin für die Bindung der Aktin-Filamente. Biotinylierten Poly-L-Lysin - Polyethylenglykol (PLL-PEG) konnte die gleiche Funktion erfüllen. </li><li> Pipette in 0,5 mg / ml Neutravidin. Inkubation für 2 min und dann waschen die Kammer mit 30 ul M5 Puffer. </li><li> Pipette in die hergestellte F-Actin-25-fach verdünnt in allgemeiner Actin-Puffer auf eine Endkonzentration ~ 0,004 mg / ml. Warten Sie 10 min, spülen Sie die Kammer mit 30 ul Puffer. </li><li> Verdünnen Myosin Va mit FLAG-Tags 30-fach in M5 Puffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) in einer Endkonzentration of 250 nM. Mischen Sie 1 ul Myosin mit 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 um, von Anti-Flag-Antikörper und Qdot705 konjugiert mit der Qdot705 Antikörperkonjugation Kit nach der Anleitung des Herstellers). Fügen Sie in 8 ul M5 bis zu 10 ul zu füllen. Pipette auf und ab, um gut zu mischen. Inkubation für 10 Minuten auf Eis. ANMERKUNG: Dies ergibt ein Gemisch aus 1 bis 4 Motor Quantenpunkte bei ~ 25 nM Konzentration Myosin. </li></ol></li><li> Bildgebung des Myosin-Aktin zu Fuß auf. <ol><li> Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen 84 ul BSA-M5 (M5 Puffer mit 1 mg / ml BSA), 1 ul ATP (50 uM in ddH 2 O), 2 ul DTT (500 mM in ddH 2 O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul Myosin-qdot nach 2,5 nM Konzentration Myosin, und 1 ul BME verdünnt weitere 10-fache. </li><li> Pipette in 20 ul Imaging-Puffer, um die Kammer zu probieren und Inkubation für 8-10 min. </li><li> Bild der Probe auf TIRF-Mikroskop bei 30 ms Belichtungs. Erwerben mindestens 1.000 Frames. Stellen Sie die Lautstärke von Myosin-qdot in Schritt 3.3.1, wenn nötig. </li></ol></li><li> Führen Sie die Datenanalyse und finden Sie die Schrittgröße von Myosin Walking. <ol><li> Öffnen Sie die Videodatei in ImageJ 17 und schneiden Sie das Video um einen beweglichen Ort. Ernte eine ausreichend große Fläche, die der Spot nie innerhalb von 20 Pixel der Kante bekommt, und stellen Sie sicher, dass keine anderen Stellen im Video. Sicherzustellen, daß dieser Punkt in einem linearen Weg bewegt. </li><li> Verfolgen Sie die Stelle durch das Video zu x und y-Koordinaten durch die Zeit, in Pixel, durch die Anwendung FIONA Analyse (Schritt 2.5.3), um jede und jeden Frame des Videos. </li><li> Konvertieren Pixel Nanometern, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. </li><li> Berechnen Verschiebung von der ersten Position als eine Funktion der Zeit. </li><li> Laufen t-Test auf die Verschiebung, die Schritte des Myosin Walking erhalten. HINWEIS: Die für t-Test (step_t_test.zip) versehen Programm wird in IDL und con codiertbesteht aus 14 Unterprogramme im Ordner. <ol><li> Öffnen Sie alle Unterprogramme in IDL und alles übersetzen zweimal. Dann führen Sie mtltyanalysis_ttest.pro und wählen Sie eine Textdatei nur die Entfernungsdaten in einer einzigen Spalte enthält. Ein Ausgang Excel-Datei erzeugt, mit dem Rohdaten, die Passform und die Schrittweite. </li></ol></li><li> Löschen Sie alle Null-Werte aus der Schrittweite Spalte. Zeichnen Sie die Verteilung der Schrittweiten mit Origin oder MATLAB. Setzen Sie einen Gaußschen auf das Histogramm. HINWEIS: Schrittweite von Null-Werte müssen gelöscht werden, da ein Schritt von Null bedeutet, dass kein Schritt des vorherigen Rahmens gemacht. Der Beschlag gibt einen Peak bei etwa 36 nm (wie in 5 gezeigt). </li></ol></li></ol> 4. Dick Probenvorbereitung für FIONA <ol><li> Bereiten Quantenpunkte in Sol-Gel verkapselt. <ol><li> Mischungs 4,5 ml TMOS, 1 ml ddH 2 O und 100 ul HCl (120 mM). Beschallen die Mischung auf Eis für 30 min in der Ultraschall-Reiniger spin der Liste der Materialien ecified (Frequenz = 40 kHz, = Heizung aus). Mischen Sie die Lösung alle 10 min. </li><li> 1,5 ul verdünnte Qdot605 in 1,5 ml HEPES (50 mM, pH 7,2). Mischungslösung mit 1,5 ml TMOS aus dem vorherigen Schritt. </li><li> Gießen Sie die Mischung in eine Glasbodenschale. Glas verschließen Bodenschale mit Parafilm und bei 4 ° C für 1. 5 Stunden. </li><li> 2 ml 1% BME in PBS an die Probenschale und bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor der Bilderzeugung. </li></ol></li><li> Bereiten Hornhaut Probe mit Quantenpunkten gefärbt. HINWEIS: Kaninchen-Augen waren Geschenke von Dr. Marina Marjanovic. <ol><li> Trennen Sie die Hornhaut von den Augen und schneiden Sie es in 3 mm x 3 mm große Stücke. </li><li> Verdünnen 1 ul Qdot 605-Streptavidin in 1 ml PBS. Inkubieren Sie die Hornhautgewebe mit 1 nM Qdots Lösung bei 4 ° C für 1 Stunde. Das Gewebe mit PBS waschen. </li><li> Nehmen Sie einen sauberen Glasobjektträger und Deckglas ein # 1.5. Setz 4 Schichten doppelseitigen Klebeband auf dem Glasobjektträger entlang der längeren Seite, einnd Anders 4 Schichten doppelseitiges Klebeband parallel zum vorherigen Band und hinterlassen einen Kanal ca. 1 cm dazwischen. Legen Sie das Gewebe aus dem vorherigen Schritt in der Mitte des Kanals, und decken Sie es mit einem Deckglas. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf den Seiten des Deckglases, um sie auf die Bänder kleben. Befeuchten Sie den Kanal mit 50 ul PBS vor Bildgebung. </li></ol></li><li> Bild Quantenpunkte in Sol-Gel-und Hornhaut. <ol><li> Fiona Bildgebung in dicken Proben, verwenden Sie ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,27 mm, oder ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,28 mm. </li><li> Montieren Sie die Probe auf dem Mikroskop. Einstellen der TIRF-Linse derart, daß sie die Auflicht-Fluoreszenz-Modus erreicht (dh der Laserstrahl tritt aus dem Ziel mit einem Winkel gegenüber dem Deckglas). Legen Sie eine zusätzliche Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X). </li><li> Bewegen der Fokusebene des Objektivs zu einer gewünschten Z-Position (zB&gt; 200 um). Rekord Bilder von immobilenQuantenpunkte in der Probe. </li></ol></li><li> Führen FIONA Analyse, wie in Abschnitt 2.5 dieses Protokolls beschrieben. </li></ol>

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<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

FIONA ist eine Technik, um die Position eines optischen Emitter (organisches Fluorophor oder Quantenpunkt) mit Nanometer-Präzision und zeitlichen Auflösung von bis zu 1 ms 4 bis 8 zu lokalisieren. Wenn genügend Photonen gesammelt werden, ermöglicht diese Technik, um die Position einer fluoreszierenden Emitter viel genauer als die Beugungsgrenze (~ 200 nm) zu bestimmen und somit dieses Verfahren eröffnet eine Möglichkeit, um zu beobachten, was mit herkömmlichen / traditionelle optische Mikroskopie 4...

Rund 1882 Ernst Abbe festgestellt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops sichtbar ist ~ λ / 2NA oder ~ 200 nm (wo λ die Wellenlänge und NA die numerische Apertur) 1,2. Daher würde jedes Objekt kleiner als diese Dimension als beugungsbegrenzten Fleck in einem optischen Mikroskop erscheinen. Jedoch ist es möglich, die Mitte des Flecks, das heißt, die Position des Objekts zu bestimmen, mit einer viel höheren Präzision 3. Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene 4. Die Genauigkeit der Lokalisierung, σ μ (dh die Standardabweichung des Mittelwerts), hängt von der Gesamtzahl der gesammelten Photonen, <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100"> , Wobei N die Photonenzahl, s die Standardabweichung der Leuchtfleck, adie Pixelgröße der Bilddetektor, und b die Standardabweichung der Hintergrund 3,4. Für einen Fluorophor emittiert ~ 10.000 Photonen können FIONA erreichen ~ 1 nm Präzision 4. Fiona verwendet, um die Position eines stationären Emitter oder ein Bewegen eines (vorausgesetzt Bilder schnell genug gemacht werden) exakt zu bestimmen. FIONA können, um den Rahmen des Films angewendet werden sequentiell und damit verfolgen die Bewegung der Einzelmolekül-4-8. Lichtschutz Reagenzien notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Probe nicht photochemisch. Weiterhin können die fluoreszierenden Objekts selbst beliebig groß sein, kleiner oder größer als die Beugungs Begrenzung- zB kann es aus einer Organelle (~ 1 um) mit vielen fluoreszierenden Proteine ​​auf ihrer Membran dispergiert bestehen. Mit FIONA kann immer noch eine sehr genaue (Nanometer) Durchschnitt der durchschnittlichen Mitte-der-Masse ergeben. Die große Verbesserung in Lokalisierungsgenauigkeit von Fiona ermöglicht die Lösung nanometer-Skala Bewegungen über die Zeit. Dies hat die Mikroskopie in die molekularen Längenskala 4 bis 8 geschoben. Seit ihrer Erfindung haben Varianten von FIONA entwickelt. Zum Beispiel Hellfeld-Bildgebung mit einem-Nanometer-Genauigkeit (bFIONA) 9, eine leichte Variante der FIONA, Bilder und lokalisiert dichte Objekte wie Melanosomen in vivo (dunkle Objekte, die das Pigment Melanin) mit Durchlicht. Darüber hinaus FIONA wurde eingesetzt, um mehrere Farbstoffe zu lösen. Zum Beispiel, Einzelmolekül-hochauflösende Bildgebung mit Photobleaching (Garnelen) 10,11 oder Einzelmolekülhochauflösende Kolokalisation (SHREC) 12 entwickelt worden, um zwei Farbstoffe innerhalb von etwa 10 nm zu lösen. (Beachten Sie, dass dies Auflösung, dh wie genau kann man identische Farbstoffe auseinander zu halten.) Vor kurzem hat FIONA Analyse auf die Lokalisierung bestimmter superauflösende Mikroskopie beigetragen wie stochastische optische RECOnstruction Mikroskopie (STORM) 13-15-und Foto-aktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) 16, in dem temporäre dunklen Fluorophore sind aufgeregt, und dann wird die Fluoreszenz lokalisiert. Durch wiederholtes spannende einem relativ niedrigen Dichte von Farbstoffen (weniger als eine pro beugungsbegrenzten Fleck) und dann das Sammeln der Fluoreszenz, die Analyse jeder von ihnen von Fiona, kann man aufbauen eine hochauflösende Karte. Die Auflösung wird dann einfach durch die Anzahl der Photonen jeder Farbstoff setzt heraus, als auch Dinge wie bei der Akquisition halten die Probe stationär (einschließlich zB der Mikroskoptisch) begrenzt. In diesem Papier, eine Zusammenfassung der FIONA Technik und beschreiben Sie kurz Beispiele von Forschung, die unter Verwendung von FIONA wird berichtet haben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie manDurchführung einer einfachen FIONA Experiment auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, veranschaulicht. Danach wird die Verwendung von Fiona 36 nm Schrittweite eines einzelnen abgeschnittenen Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert, um zu messen, ist dargestellt. Myosin Va ist ein wesentlicher Motor prozessive Protein, das zelluläre Fracht trägt, während Translokation entlang Aktin-Filamente. Hier eine Myosin Va konstruieren stumpf wird verwendet, um Bereiche irrelevant für die Schrittgröße zu entfernen, und mit einem Flag-Tag an den C-Terminus angefügt, um eine einfache Markierung mit Quantenpunkten mit Anti-FLAG-Antikörper funktionalisierten ermöglichen. Dieses Experiment wird unter niedrigen ATP getan, um die Myosin verlangsamen und ermöglichen die Verwendung von Belichtungszeiten lang genug, um eine gute Photonenzahl in jedem Rahmen zu bekommen. Jede ausreichend hell fluoreszierende Markierung könnte in dem folgenden Protokoll ersetzt werden. Schließlich jüngsten Anstrengungen der Verlängerung der Anwendung der FIONA zu dicken Proben berichtet. Als Proof-of-Prinzip wurden Quantenpunkte eingeweichtin Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhaut und dann abgebildet und lokalisiert mit FIONA. Für die Bildgebung, ein 60X Wasser Immersionsobjektiv mit NA = 1,2 wurde verwendet, da dieses Ziel hat eine längere Distanz als bisher verwendete 100X Ölimmersionsobjektiv. Um den Verlust in der Vergrößerung in dem Ziel auszugleichen, wurde ein extra-Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X) in der Emissionspfad eingefügt. Darüber hinaus Auflicht-Fluoreszenz (nicht TIR)-Mikroskopie muss verwendet werden, um tiefe Regionen in den dicken Proben zuzugreifen. Es wird gezeigt, dass die Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gels und im Kaninchenauge Hornhäute (Z&gt; 200 um) können mit 2-3 nm Präzision lokalisiert werden.

<table><tbody><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &#181; m dick</td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter-Set</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>Aktin-Polymerisationspuffer&nbsp;</td><td>Zytoskelett&nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>Biotin G-Aktin-Zytoskelett</td><td>&nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-Aktin&nbsp;</td><td>Zytoskelett&nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>Allgemeiner Aktinpuffer</td><td>Zytoskelett&nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Shutter (mit Treiber)</td><td>Electro-Optical Products Corp.&nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22X30-1,5</td><td>0,16-0,19 mm dicker</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Gold Seal Microslides&nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0,93-1,05 mm dicker</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA-Oligos</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Kügelchen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-Streptavidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Antikörper-Konjugationskit</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optischer Tisch</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Serie</td></tr><tr><td>60X Objektiv</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X Objektiv</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Öl &infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Herkunft</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>Kreatin Phosphokinase aus Kaninchenmuskel</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>Phosphokreatin di(tris) salz</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime; -Tetraessigsäure</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>Protocatechusäure&nbsp;</td></tr><tr><td>PKD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>Protocatechuat-3,4-dioxygenase&nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>Tetramethylorthosilikat</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure</td></tr><tr><td>Breitband-dielektrische Spiegel mit 1" Durchmesser und Halterungen</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>Menge: 2</td></tr><tr><td>&frac12; &rdquo; Durchmesser Pfosten</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR4</td><td>Menge > 6</td></tr><tr><td>10X Strahlaufweiter</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2" Durchmesser f = 300 mm Objektiv mit Halterung</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LA1256-A, LMR2</td><td>TIR-Linse</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Ausrichtungsziel&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td></td>VRC2SM1</tr><tr><td>Laserschutzbrille</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>ND-Filter/FilternThorlabs</td><td>&nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Strahlprofilmessgerät</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BP209-VIS Pfostenmontierte</td><td></td></tr><tr><td>Irisblende</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ID25</td><td>Menge: 2</td></tr><tr><td>Scherinterferometer</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ-Translationstisch, &frac12; &rdquo; Reisen&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>World Star Technologies&nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm, 30 mW</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-imaging mit one-nanometer-genauigkeit (fiona)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene. Hier eine Zusammenfassung der FIONA Technik wird berichtet, und Beispiele der Forschung, die durchgeführt wurde unter Verwendung Fiona kurz beschrieben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie man auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, gefolgt von der Nutzung von FIONA um die 36 nm Schrittweite von einer einzigen abgeschnitten Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert messen Durchführung einer einfachen FIONA Experiment veranschaulicht. Schließlich jüngsten Bemühungen um die Anwendung FIONA zu dicken Proben erstrecken wird berichtet. Es wird gezeigt, dass mit einem Wasserimmersionsobjektiv und Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhäute (&gt;200 um) Lokalisierungsgenauigkeit von 2-3 nm erreicht werden.

Ein typisches Ziel-Typ TIRFM Aufbau ist in Abbildung 3 dargestellt. Zuerst wurde auf der Oberfläche immobilisierten Cy3-DNA Probe abgebildet. Ein typisches Bild ist in 4a gezeigt. Das Bild wurde mit 0,5 Sekunden Belichtungszeit aufgenommen, mit EM Verstärkung = 50 und CCD-Empfindlichkeit = 12.13 für die Kamera. Die Punktbild-Funktion (PSF) eines Cy3-DNA-Molekül ist in 4b dargestellt (von der durch den Pfeil in Figur 4a angedeutet Stelle), wo die Farbbal...

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie man Fluoreszenzbildgebung mit einer Genauigkeit von einem Nanometer oder Fiona-Experimenten durchführen kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die erforderliche Ausrüstung eingerichtet und die Optik für Totalreflexion, Fluoreszenz, Mikroskopie oder Rasen ausgerichtet wird. Der nächste Schritt besteht darin, CY 3D NA auf der Innenfläche einer Probenkammer zu immobilisieren und CY 3D NA-Einzelmoleküle mit Nanometergenauigkeit zu lokalisieren.Anschließend wird Fiona eingesetzt, um die Bewegung eines einzelnen verkürzten Myosins zu untersuchen, das mit einem Quantenpunkt markiert ist. Letztendlich wurde die Schrittweite von Myosin, während es weitergeht, Acton mit 36 Nanometern durch Fiona-Analyse gemessen. Obwohl diese Methode Einblicke in molekulare Motoren geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Verfolgung von Rezeptoren auf der Membran von Zellen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die experimentellen Details schwer zu erlernen sind. Es ist wichtig, während des Setups immer eine Laserschutzbrille zu tragen. Für Totalreflexion, Fluoreszenz, Mikroskopie oder Rasen.Stellen Sie zunächst die Höhen aller optischen Komponenten auf die Höhe der Mitte des Mikroskops ein, montieren Sie den Laser, den Laser-Shutter und die ND-Filter. Verwenden Sie ND-Filter, um die Laserleistung so gering wie möglich zu halten, während der Strahl sichtbar bleibt. Ziehen Sie die Schrauben mit den entsprechenden Inbusschlüsseln fest.Planen Sie einen Strahlengang, wie durch die gestrichelten blauen Linien dargestellt. Markieren Sie in diesem Schaltplan den Strahlengang mit Klebeband oder Markierung auf dem optischen Tisch. Platzieren Sie den Spiegel M1 an der ersten rechtwinkligen Drehung, platzieren Sie die beiden Blenden entlang des zweiten geraden Abschnitts des geplanten Strahlengangs.Stellen Sie sowohl die Position als auch die Neigung von M1 so ein, dass der Laser durch den Blendenspiegel M zwei geht. Platzieren Sie bei der zweiten rechtwinkligen Drehung den 10-fach-Strahlexpander entlang des dritten geraden Abschnitts des Pfades. Stellen Sie die Neigung so ein, dass der Strahlaufweiter sowohl zum optischen Tisch als auch zum geplanten Strahlengang parallel ist.Der nächste Schritt besteht darin, M1 und M zwei iterativ so einzustellen, dass der Laser gerade durch die Zentren beider Linsen, L eins und L zwei des Strahlaufweiters, geht. Verwenden Sie ein Blatt weißes Papier, um den Strahl nach dem Strahlaufweiter zu blockieren, um das Strahlprofil mit dem Auge zu überprüfen. Anpassen, bis das Balkenprofil des erweiterten Trägers nicht ED ist.Gauß stellt den Abstand zwischen L eins und L zwei so ein, dass der Strahl wie ein magazinierter Verschluss ist. Der Laser schraubt das Mikroskopobjektiv ab und schraubt eine Fluoreszenzausrichtung ein. Platzieren Sie die Spiegel M drei und M vier, um den expandierten Strahl in die Mikroskopöffnung und auf den dichroitischen Spiegel zu lenken.Im Inneren des Turms. Stellen Sie M drei ein, um den hellsten Teil des Strahls auf das fluoreszierende Ziel zu zentrieren, und M vier, um den Strahl vertikal zu neigen, schalten Sie den Laser ein und schrauben Sie das Objektiv wieder ein. Fein. Stimmen Sie die Neigungen von M drei und M vier ab, um die Laserleistung und das Strahlprofil aus dem Objektiv heraus zu optimieren.Montieren Sie eine E-M-C-C-D-Kamera am Mikroskop und schließen Sie die Kamera an einen Computer an. Starten Sie die Software für die Kamera. Montieren Sie eine fluoreszierende Probe am Mikroskop.Schauen Sie sich den hellen fluoreszierenden Fleck auf der Kamera an. Vergewissern Sie sich, dass sich der Fleck auf dem Bildschirm nicht verschiebt, da sich der Fokus geändert hat. Platzieren Sie die TIR-Linse auf dem XY-, Z-Translationstisch in einem Abstand von der hinteren Brennebene des Objektivs, der der Brennweite L drei, die etwa 30 Zentimeter beträgt.Stellen Sie die Position von L drei so ein, dass der Laser durch die Mitte der Linse geht. Verschieben Sie L um drei entlang des Strahlengangs, um die Strahlkollatierung anzupassen. Stellen Sie sicher, dass der Strahl noch zentriert auf dem Monitor und symmetrisch geformt ist.Verschieben Sie L drei senkrecht zum Strahlengang, um den Strahl aus dem Objektiv zu kippen. Übersetzen Sie die TIR-Linse so, dass die TIR erreicht wird, bevor eine Fiona durchgeführt wird. Experiment zur Lokalisierung und Mobilisierung von CY 3D NA. Einzelne Moleküle bilden Probenkammern, wie im Protokolltext beschrieben.Zwei Streifen doppelseitiges Klebeband werden entlang der langen Kanten auf den Objektträger aufgebracht, wobei in der Mitte ein Spalt von drei bis fünf Millimetern verbleibt, und dann wird ein gereinigter Deckglas auf den Objektträger gelegt. Seitenansichten der Kammer von rechts und von vorne sind zu sehen. Die offenen Enden der Kammer bleiben offen und dienen als Ein- und Auslass zur Immobilisierung von SI 3D NA auf den Innenflächen der Probenkammer. Pipettieren Sie 10 Mikroliter BSA-Biotin in die Kammer.Warten Sie fünf Minuten. Waschen Sie die Probenkammer, indem Sie 40 Mikroliter T 50 BSA in die Kammer pipettieren. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter Neut-Travain in die Kammer und inkubieren Sie fünf Minuten lang.Waschen Sie die Kammer erneut mit 40 Mikrolitern T 50 BSA-Pipette und 20 Mikrolitern SI 3D NA in die Probenkammer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Zum Schluss wird die Kammer mit 80 Mikrolitern T 50 BSA gewaschen. Um das Verfahren zur Bildgebung von SI 3D NA einzelnen Molekülen unter dem Rasen M zu beginnen, pipettieren Sie 30 Mikroliter Bildgebungspuffer in die Probenkammer und warten Sie acht bis 10 Minuten.Montieren Sie die Probe für die Bildgebung auf einem Rasenmikroskop, das mit einem grünen Laser, einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer E-M-C-C-D-Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie die Belichtungszeit und die EM-Verstärkung ein. Erfassen Sie einen Film des Beispiels für 1000 Frames.Kompilieren Sie Fiona Pro für die Fiona-Analyse und führen Sie es aus. Verwenden Sie dieses IDL-Programm, um das aufgenommene Bild zu importieren, die effektive Pixelgröße und den Umrechnungsfaktor von Intensität in Photonenzahl einzugeben und Spots für die Fiona-Analyse auszuwählen. Am Ende gibt das Programm die Anpassungsergebnisse mit 2D-Gaußschen Funktionen sowie der Gesamtphotonenzahl und der Lokalisierungsgenauigkeit von pH count pro aus und führt sie aus.Um die Photonenzahl zu charakterisieren, verwenden Sie dieses DL-Programm, um die durchschnittliche Anzahl der Photonen zu messen, die von einer Flora emittiert werden. Vier vor dem Photobleaching, um das aufgenommene Bild zu importieren und den Umrechnungsfaktor von Intensität in Photonenzahl einzugeben. Das Programm erkennt fluoreszierende Flecken, berechnet automatisch die Photonenzahl in Abhängigkeit von der Bildnummer und gibt die Spuren der Photonenzählung aus.Bereiten Sie die Probe für dieses Experiment vor, indem Sie 20 Mikroliter biotinyliertes BSA in einer Menge von einem Milligramm pro Milliliter in DD H2O in eine Probenkammer pipettieren. 10 Minuten inkubieren. Spülen Sie mit 30 Mikrolitern D ddh, zwei O-Pipetten in 0,5 Milligramm pro Milliliter Neut Travain und inkubieren Sie zwei Minuten lang.Waschen Sie die Kammer mit 30 Mikrolitern M fünf PSA. Das Acton für dieses Experiment muss am Vortag vorbereitet werden, wie im Protokolltext beschrieben. Verdünnen Sie das zubereitete f Aktin in der Regel 25-mal Aktinpuffer auf eine Endkonzentration von etwa 0,004 Milligramm pro Milliliter.Pipettieren Sie die Aktinlösung in die Kammer und warten Sie 10 Minuten. Spülen Sie die Kammer mit 30 Mikrolitern Puffer und verdünnen Sie Myosin fünf A mit Flaggenetiketten um 30. Falten Sie einen M Fünf-Puffer auf eine Endkonzentration von 250 Nanomolaren.Mischen Sie einen Mikroliter des verdünnten Myosins mit einem Mikroliter Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Fügen Sie acht Mikroliter M five hinzu, um es auf 10 Mikroliter zu füllen, und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Gut 10 Minuten auf Eis inkubieren.Pipettieren Sie 20 Mikroliter Imaging-Puffer, der Myosin Q dot enthält, in die Probenkammer. Acht bis 10 Minuten inkubieren. Bilden Sie die Probe am Rasenmikroskop bei einer Belichtungszeit von 30 Millisekunden ab.Erfassen Sie mindestens 1000 Frames, um mit der Datenanalyse zu beginnen. Öffnen Sie die Videodatei in Bild J und schneiden Sie das Video um einen sich bewegenden Punkt herum zu. Verfolgen Sie den Spot durch das Video, um X- und Y-Koordinaten im Laufe der Zeit in Pixeln zu generieren, indem Sie die Fiona-Analyse auf jedes einzelne Bild des Videos anwenden.Konvertieren Sie Pixel in Nanometer, wie im Protokolltext beschrieben. Berechnen Sie die Verschiebung von der Anfangsposition als Funktion der Zeit. Führen Sie einen T-Test der Verschiebung durch, um die Schritte des Myosin-Gehens zu erhalten.Löschen Sie alle Nullwerte aus der Spalte Schrittweite. Plotten Sie die Verteilung der Schrittgrößen mit origin oder matlab. Passen Sie einen Gaußschen Stein an das Histogramm an.In diesem typischen Bild der Oberfläche immobilisieren Sie SI 3D NA. Der gelbe Pfeil zeigt auf ein einzelnes SI 3D NA-Molekül, dessen Punktspreizfunktion oder PSF hier dargestellt ist. Die PSF ist mit einer zweidimensionalen Gaußschen Funktion ausgestattet, und es werden auch passende Residuen angezeigt. Dieses Diagramm ist eine typische Spur der Photonenzahl im Vergleich zur Frame-Zahl, und die exponentielle Anpassung ergibt die durchschnittliche Photonenzahl von etwa 1,4 mal 10 bis zur sechsten zur Messung der Myosin-Schrittgröße, einer Videodatei mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis eines einzelnen Myosins.Während es weitergeht, wird ein Aktinfilament eingefangen. Es werden drei Beispielrahmen gezeigt. Die Anwendung von Fiona auf jedes Bild ergibt eine rot dargestellte Abstands-Zeit-Kurve.Ein auf dem T-Test basierender Schrittfindungsalgorithmus wird verwendet, um einzelne Schritte zu extrahieren und die Ausgabe wird weiß überlagert. Schrittgrößen und Nanometer werden weiß markiert. Wenn Schritte aus mehreren Kurven in einem Histogramm kombiniert werden, sind die gemessenen Schrittgrößen Gauß verteilt um etwa 35,8 plus oder minus 0,4 Nanometer. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fiona-Experimente durchführt, einschließlich der Einrichtung eines Rasenmikroskops Um die besten Ergebnisse zu erzielen Bei diesen Verfahren ist es wichtig, den Lichtschaden beim Einsatz von Bodenkraft und bei Experimenten zu minimieren.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Rasenmikroskopie und Fiona äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie eine Schutzbrille bei der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Verfahren zur Lokalisierung fluoreszent markierte Proteine ​​in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Fluoreszenz wird zuerst lokalisiert durch Foto-activated localization microscopy auf ultradünne Schnitte. Diese Bilder werden dann an elektronenmikroskopischen Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt ausgerichtet ist.

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

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Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

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Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

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Dieser Workflow ermöglicht die Lamellenproduktion für fluoreszenzmarkierte biologische Strukturen, die klein (&lt;1 μm axiale Ausdehnung) und selten (1 Kopie pro Zelle) sind, unter Verwendung einer kryogenen trikoinzidenten Bildgebungsplattform. Diese Plattform integriert Fluoreszenzmikroskopie, fokussiertes Ionenstrahlfräsen und Rasterelektronenmikroskopie in einer einzigen Fokusposition und ermöglicht die gleichzeitige Fluoreszenzmikroskopie während des Fräsens.

Arbeitsablauf mit einem kryogenen Koinzidenz-Fluoreszenz-, Elektronen- und Ionenstrahlmikroskop zur gezielten Fräsung von Zellen

Lernen Sie die FIONA-Technik zur Lokalisierung einzelner Fluorophore mit Nanometerpräzision. Diese Methode ermöglicht die präzise Messung von Myosin-Schrittgrößen auf Aktin und liefert wertvolle Einblicke in molekulare Motoren.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

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