Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie man Fluoreszenzbildgebung mit einer Genauigkeit von einem Nanometer oder Fiona-Experimenten durchführen kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die erforderliche Ausrüstung eingerichtet und die Optik für Totalreflexion, Fluoreszenz, Mikroskopie oder Rasen ausgerichtet wird. Der nächste Schritt besteht darin, CY 3D NA auf der Innenfläche einer Probenkammer zu immobilisieren und CY 3D NA-Einzelmoleküle mit Nanometergenauigkeit zu lokalisieren.

Anschließend wird Fiona eingesetzt, um die Bewegung eines einzelnen verkürzten Myosins zu untersuchen, das mit einem Quantenpunkt markiert ist. Letztendlich wurde die Schrittweite von Myosin, während es weitergeht, Acton mit 36 Nanometern durch Fiona-Analyse gemessen. Obwohl diese Methode Einblicke in molekulare Motoren geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Verfolgung von Rezeptoren auf der Membran von Zellen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die experimentellen Details schwer zu erlernen sind. Es ist wichtig, während des Setups immer eine Laserschutzbrille zu tragen. Für Totalreflexion, Fluoreszenz, Mikroskopie oder Rasen.

Stellen Sie zunächst die Höhen aller optischen Komponenten auf die Höhe der Mitte des Mikroskops ein, montieren Sie den Laser, den Laser-Shutter und die ND-Filter. Verwenden Sie ND-Filter, um die Laserleistung so gering wie möglich zu halten, während der Strahl sichtbar bleibt. Ziehen Sie die Schrauben mit den entsprechenden Inbusschlüsseln fest.

Planen Sie einen Strahlengang, wie durch die gestrichelten blauen Linien dargestellt. Markieren Sie in diesem Schaltplan den Strahlengang mit Klebeband oder Markierung auf dem optischen Tisch. Platzieren Sie den Spiegel M1 an der ersten rechtwinkligen Drehung, platzieren Sie die beiden Blenden entlang des zweiten geraden Abschnitts des geplanten Strahlengangs.

Stellen Sie sowohl die Position als auch die Neigung von M1 so ein, dass der Laser durch den Blendenspiegel M zwei geht. Platzieren Sie bei der zweiten rechtwinkligen Drehung den 10-fach-Strahlexpander entlang des dritten geraden Abschnitts des Pfades. Stellen Sie die Neigung so ein, dass der Strahlaufweiter sowohl zum optischen Tisch als auch zum geplanten Strahlengang parallel ist.

Der nächste Schritt besteht darin, M1 und M zwei iterativ so einzustellen, dass der Laser gerade durch die Zentren beider Linsen, L eins und L zwei des Strahlaufweiters, geht. Verwenden Sie ein Blatt weißes Papier, um den Strahl nach dem Strahlaufweiter zu blockieren, um das Strahlprofil mit dem Auge zu überprüfen. Anpassen, bis das Balkenprofil des erweiterten Trägers nicht ED ist.

Gauß stellt den Abstand zwischen L eins und L zwei so ein, dass der Strahl wie ein magazinierter Verschluss ist. Der Laser schraubt das Mikroskopobjektiv ab und schraubt eine Fluoreszenzausrichtung ein. Platzieren Sie die Spiegel M drei und M vier, um den expandierten Strahl in die Mikroskopöffnung und auf den dichroitischen Spiegel zu lenken.

Im Inneren des Turms. Stellen Sie M drei ein, um den hellsten Teil des Strahls auf das fluoreszierende Ziel zu zentrieren, und M vier, um den Strahl vertikal zu neigen, schalten Sie den Laser ein und schrauben Sie das Objektiv wieder ein. Fein. Stimmen Sie die Neigungen von M drei und M vier ab, um die Laserleistung und das Strahlprofil aus dem Objektiv heraus zu optimieren.

Montieren Sie eine E-M-C-C-D-Kamera am Mikroskop und schließen Sie die Kamera an einen Computer an. Starten Sie die Software für die Kamera. Montieren Sie eine fluoreszierende Probe am Mikroskop.

Schauen Sie sich den hellen fluoreszierenden Fleck auf der Kamera an. Vergewissern Sie sich, dass sich der Fleck auf dem Bildschirm nicht verschiebt, da sich der Fokus geändert hat. Platzieren Sie die TIR-Linse auf dem XY-, Z-Translationstisch in einem Abstand von der hinteren Brennebene des Objektivs, der der Brennweite L drei, die etwa 30 Zentimeter beträgt.

Stellen Sie die Position von L drei so ein, dass der Laser durch die Mitte der Linse geht. Verschieben Sie L um drei entlang des Strahlengangs, um die Strahlkollatierung anzupassen. Stellen Sie sicher, dass der Strahl noch zentriert auf dem Monitor und symmetrisch geformt ist.

Verschieben Sie L drei senkrecht zum Strahlengang, um den Strahl aus dem Objektiv zu kippen. Übersetzen Sie die TIR-Linse so, dass die TIR erreicht wird, bevor eine Fiona durchgeführt wird. Experiment zur Lokalisierung und Mobilisierung von CY 3D NA. Einzelne Moleküle bilden Probenkammern, wie im Protokolltext beschrieben.

Zwei Streifen doppelseitiges Klebeband werden entlang der langen Kanten auf den Objektträger aufgebracht, wobei in der Mitte ein Spalt von drei bis fünf Millimetern verbleibt, und dann wird ein gereinigter Deckglas auf den Objektträger gelegt. Seitenansichten der Kammer von rechts und von vorne sind zu sehen. Die offenen Enden der Kammer bleiben offen und dienen als Ein- und Auslass zur Immobilisierung von SI 3D NA auf den Innenflächen der Probenkammer. Pipettieren Sie 10 Mikroliter BSA-Biotin in die Kammer.

Warten Sie fünf Minuten. Waschen Sie die Probenkammer, indem Sie 40 Mikroliter T 50 BSA in die Kammer pipettieren. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter Neut-Travain in die Kammer und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Waschen Sie die Kammer erneut mit 40 Mikrolitern T 50 BSA-Pipette und 20 Mikrolitern SI 3D NA in die Probenkammer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Zum Schluss wird die Kammer mit 80 Mikrolitern T 50 BSA gewaschen. Um das Verfahren zur Bildgebung von SI 3D NA einzelnen Molekülen unter dem Rasen M zu beginnen, pipettieren Sie 30 Mikroliter Bildgebungspuffer in die Probenkammer und warten Sie acht bis 10 Minuten.

Montieren Sie die Probe für die Bildgebung auf einem Rasenmikroskop, das mit einem grünen Laser, einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer E-M-C-C-D-Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie die Belichtungszeit und die EM-Verstärkung ein. Erfassen Sie einen Film des Beispiels für 1000 Frames.

Kompilieren Sie Fiona Pro für die Fiona-Analyse und führen Sie es aus. Verwenden Sie dieses IDL-Programm, um das aufgenommene Bild zu importieren, die effektive Pixelgröße und den Umrechnungsfaktor von Intensität in Photonenzahl einzugeben und Spots für die Fiona-Analyse auszuwählen. Am Ende gibt das Programm die Anpassungsergebnisse mit 2D-Gaußschen Funktionen sowie der Gesamtphotonenzahl und der Lokalisierungsgenauigkeit von pH count pro aus und führt

Um die Photonenzahl zu charakterisieren, verwenden Sie dieses DL-Programm, um die durchschnittliche Anzahl der Photonen zu messen, die von einer Flora emittiert werden. Vier vor dem Photobleaching, um das aufgenommene Bild zu importieren und den Umrechnungsfaktor von Intensität in Photonenzahl einzugeben. Das Programm erkennt fluoreszierende Flecken, berechnet automatisch die Photonenzahl in Abhängigkeit von der Bildnummer und gibt die Spuren der Photonenzählung aus.

Bereiten Sie die Probe für dieses Experiment vor, indem Sie 20 Mikroliter biotinyliertes BSA in einer Menge von einem Milligramm pro Milliliter in DD H2O in eine Probenkammer pipettieren. 10 Minuten inkubieren. Spülen Sie mit 30 Mikrolitern D ddh, zwei O-Pipetten in 0,5 Milligramm pro Milliliter Neut Travain und inkubieren Sie zwei Minuten lang.

Waschen Sie die Kammer mit 30 Mikrolitern M fünf PSA. Das Acton für dieses Experiment muss am Vortag vorbereitet werden, wie im Protokolltext beschrieben. Verdünnen Sie das zubereitete f Aktin in der Regel 25-mal Aktinpuffer auf eine Endkonzentration von etwa 0,004 Milligramm pro Milliliter.

Pipettieren Sie die Aktinlösung in die Kammer und warten Sie 10 Minuten. Spülen Sie die Kammer mit 30 Mikrolitern Puffer und verdünnen Sie Myosin fünf A mit Flaggenetiketten um 30. Falten Sie einen M Fünf-Puffer auf eine Endkonzentration von 250 Nanomolaren.

Mischen Sie einen Mikroliter des verdünnten Myosins mit einem Mikroliter Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Fügen Sie acht Mikroliter M five hinzu, um es auf 10 Mikroliter zu füllen, und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Gut 10 Minuten auf Eis inkubieren.

Pipettieren Sie 20 Mikroliter Imaging-Puffer, der Myosin Q dot enthält, in die Probenkammer. Acht bis 10 Minuten inkubieren. Bilden Sie die Probe am Rasenmikroskop bei einer Belichtungszeit von 30 Millisekunden ab.

Erfassen Sie mindestens 1000 Frames, um mit der Datenanalyse zu beginnen. Öffnen Sie die Videodatei in Bild J und schneiden Sie das Video um einen sich bewegenden Punkt herum zu. Verfolgen Sie den Spot durch das Video, um X- und Y-Koordinaten im Laufe der Zeit in Pixeln zu generieren, indem Sie die Fiona-Analyse auf jedes einzelne Bild des Videos anwenden.

Konvertieren Sie Pixel in Nanometer, wie im Protokolltext beschrieben. Berechnen Sie die Verschiebung von der Anfangsposition als Funktion der Zeit. Führen Sie einen T-Test der Verschiebung durch, um die Schritte des Myosin-Gehens zu erhalten.

Löschen Sie alle Nullwerte aus der Spalte Schrittweite. Plotten Sie die Verteilung der Schrittgrößen mit origin oder matlab. Passen Sie einen Gaußschen Stein an das Histogramm an.

In diesem typischen Bild der Oberfläche immobilisieren Sie SI 3D NA. Der gelbe Pfeil zeigt auf ein einzelnes SI 3D NA-Molekül, dessen Punktspreizfunktion oder PSF hier dargestellt ist. Die PSF ist mit einer zweidimensionalen Gaußschen Funktion ausgestattet, und es werden auch passende Residuen angezeigt. Dieses Diagramm ist eine typische Spur der Photonenzahl im Vergleich zur Frame-Zahl, und die exponentielle Anpassung ergibt die durchschnittliche Photonenzahl von etwa 1,4 mal 10 bis zur sechsten zur Messung der Myosin-Schrittgröße, einer Videodatei mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis eines einzelnen Myosins.

Während es weitergeht, wird ein Aktinfilament eingefangen. Es werden drei Beispielrahmen gezeigt. Die Anwendung von Fiona auf jedes Bild ergibt eine rot dargestellte Abstands-Zeit-Kurve.

Ein auf dem T-Test basierender Schrittfindungsalgorithmus wird verwendet, um einzelne Schritte zu extrahieren und die Ausgabe wird weiß überlagert. Schrittgrößen und Nanometer werden weiß markiert. Wenn Schritte aus mehreren Kurven in einem Histogramm kombiniert werden, sind die gemessenen Schrittgrößen Gauß verteilt um etwa 35,8 plus oder minus 0,4 Nanometer. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fiona-Experimente durchführt, einschließlich der Einrichtung eines Rasenmikroskops Um die besten Ergebnisse zu erzielen Bei diesen Verfahren ist es wichtig, den Lichtschaden beim Einsatz von Bodenkraft und bei Experimenten zu minimieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Rasenmikroskopie und Fiona äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie eine Schutzbrille bei der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden sollten.