Name: RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Lernen Sie die RNA-Isolierung aus ribonuklease-reichem Mäusepankreas mit hoher Integrität. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Genexpressionsanalysen für entwicklungsbiologische und krebsbiologische Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo und Satyanarayana Rachagani für ihre hilfreichen Kommentare, Anregungen und Austausch ihrer Protokolle. Diese Arbeit wurde durch Gewährung U01CA111294 und einer Idee Development Award von der Ohio State University Interne Research Program.

1. Vorbereitung Die folgenden Praktiken halten sich an die Richtlinien von Animal Care und Verwenden Ausschuss der Institution (IACUC) eingestellt. <ol><li> Es wird empfohlen, nicht mehr als 6 Maus Pankreas in einem bestimmten Tag zu isolieren. Haben alle chirurgischen Instrumente sauber und autoklaviert, ein Set pro Tier. </li><li> Kennzeichnen Sie alle Mikrozentrifugenröhrchen. Vier 2-ml-Röhrchen pro Tier. </li><li> Platz 8 ml Lyse-Reagenz in 50 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis. Hinweis: Während der Reinigung-Kit kommt mit einem Guanidinthiocyanat Phenol Reagenz, das für Bauchspeicheldrüse Isolation ist, wird Lysereagens wegen der großen Mengen, die notwendig sind pro Isolierung verwendet. </li><li> Dispense etwa 10 ml der folgenden Lösungen in 15 ml Zentrifugenröhrchen für die Reinigung der Homogenisator Klingen. Ethanol, 70% (2 Röhren), HPLC-Wasser (1-Rohr) und HPLC-Wasser, das etwa 200 ul RNase Auswärts oder gleichwertig Ribonuklease Inaktivators. </li></ol&gt; 2. Chirurgie, Bauchspeicheldrüse Dissection und Homogenisierung <ol><li> Zeigen 1-2 ml Isofluran in ein Gefäß mit Baumwolle Gaze oder Papiertücher. Mäuse werden auf einer Plattform, die sie vor dem Erreichen der Quelle des Isofluran verhindert platziert. Add frischen Isofluran in das Gefäß vor der Anästhesie jede Maus. </li><li> Sanft statt mit der Maus in das Glas mit der Isofluran. Verschließen Sie das Glas und die Auswirkungen der Narkose zu überwachen, indem Sie vorsichtig Drehen Sie das Glas hin und her. Das Tier wird anästhesiert, sobald es nicht mehr in seiner eigenen stehen. </li><li> Zur Bestätigung der Anästhesie, entfernen Sie das Tier aus dem Glas und tragen Sie eine Firma Zehe Prise. Wenn die Maus nicht auf die Zehen Prise reagieren, gehen Sie zu Schritt 2.5. </li><li> Wenn die Maus bis zu den Zehen Prise reagiert, wiederholen Sie die Schritte 2,2 bis 2,3. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Tier auf der Werkbank in der Bauchlage. Verrücken der Maus die Zervix durch dicht indem die linke Hand auf der Maus den Gebärmutterhals. Unsten die rechte Hand die Maus am Schwanz und schnell nach oben ziehen ungefähr in einem Winkel von 45 °, um den Muttermund zu verrücken. </li><li> Sichern Sie die Karkasse zu einer Oberfläche (eine Stufe Stück Styropor mit Papiertüchern abgedeckt) durch Einstechen in jedem der vier Pfoten des Tieres in die flache Oberfläche mit 25 Gauge Injektionsnadeln. </li><li> Mit einer sterilen chirurgischen Instrumenten, schneiden Sie den Mittelteil der Maus öffnen und schnell zu entfernen, die Bauchspeicheldrüse von der Maus. Verwenden Sie die Zange, um die Bauchspeicheldrüse zu halten und schneiden Sie es aus der Milz und Dünndarm mit Feder Schere. Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse bei der Entfernung von der Maus zu dehnen. Störung des Gewebes konnte Ribonuklease freizugeben. Hinweis: Die Zeit, die von der Bauchspeicheldrüse der Maus zu entfernen, ist kritisch. Ein Fachmann sollte in der Lage, die Bauchspeicheldrüse in ca. 1 min oder weniger sezieren können. </li><li> Legen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Tube mit 8 ml eiskaltem Lyse-Reagenz. Das Röhrchen und kurz schütteln, um die ti eintauchenusgabe in das Reagenz und fahren Sie mit dem nächsten Schritt ohne Verzögerung. Das Verhältnis von Lysereagenz, um Gewebe ist kritisch. Siehe Abschnitt Ergebnisse zum Vergleich der RNA-Integrität getrennt unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von Lysereagenz. </li><li> Homogenisieren für 5 Sekunden. Es ist wichtig, die Homogenisator Schaufeln zum Boden des Zentrifugenröhrchens drücken, damit das Gewebe in die Messer für die effiziente Homogenisierung gezogen werden. </li></ol> 3. Entfernen von Gewebe Unverdaute Anmerkung: Nach der Homogenisierung werden kleine Stücke von Gewebe in dem Lysereagenz bleiben. Es ist wichtiger, die so dass einige Gewebe und nicht über Homogenisieren und Risiko Abbau von RNA unverdaut Gewebe schnell aufzulösen. <ol><li> 2 ml Lyse-Reagenz, das die Lyse der Bauchspeicheldrüse in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zwei Mikrozentrifugenröhrchen pro Homogenat Isolation. Entsorgen Sie die verbleibenden Homogenat oder bei -80 ° C für zukünftige Studien. </li><li> Centrifuge bei 4 ° C, 12.000 × g für 5 min, um das unverdaute Gewebe zu pelletieren. Dies ist ein kritischer Schritt, da Verschleppung von unverdauten Gewebe in nachfolgenden Lösungen von RNA wahrscheinlich die Probe verunreinigt mit Ribonuclease (Schritt 5.13). </li><li> 1 ml des Überstands in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fahren Sie mit der Isolation sofort und speichern Sie die Wiederholungsrohr bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung. Legen Sie alle Röhrchen mit Homogenat auf nassem Eis, während Sie mit dem nächsten Schritt. </li><li> Entsorgen Sie die verbleibenden Lyse-Reagenz in eine geeignete chemische Abfallbehälter. </li></ol> 4. Reinigung der Homogenisator Blades <ol><li> Bevor Sie mit dem nächsten Isolation, reinigen Sie die Homogenisator Klingen, indem sie in 10 ml 70% Ethanol. Aktivieren Sie den Homogenisator für ca. 20 Sekunden, um alle Stücke von Gewebe, das von den Messern erfasst werden können, zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie ein 200 ul Pipettenspitze, alle Stücke, die in den Homogenisator Klingen bleiben zu entfernen. </li&gt; <li> Wiederholen Sie Schritt 4.1 in Wasser, allgemeine RNase Inaktivators und 70% Ethanol. Trocknen der Homogenisator Welle mit einem sauberen Kim zu wischen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Bauchspeicheldrüse Isolation der verbleibenden Tiere, halten RNA von jedem Tier trennen, anstatt die Bündelung der RNA isoliert. </li></ol> 5. RNA-Isolierung Der folgende Abschnitt ist identisch mit der Reinigungskits Protokoll. Der Vorteil des Reinigungs-Kits ist, dass sie die Gesamt-RNA auch kleine RNAs zu isolieren. <ol><li> Wenn Sie gefrorene Homogenisat Lösung, tauen auf nassem Eis und stehen lassen bei RT für 5 min. </li><li> In 200 ul Chloroform, Röhrchen verschließen und kräftig mit der Hand für 15 Sekunden. Lassen Sie den Schlauch stehen bei RT für 2-3 min. </li><li> Zentrifugieren für 15 min bei 12.000 × g, 4 ° C </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Schicht in einem Mikrozentrifugenröhrchen. In 1,5 Volumen Isopropanol und mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals. </li><li> Übertragen Sie bis zu 700 ul der Probe in eine Spin-Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen angeordnet ist. Schließen Sie den Deckel und Zentrifuge bei 8000 g für 15 sec bei RT. </li><li> Entsorgen Sie die Durchströmung. </li><li> Die Schritte von 5,5 bis 5,6, mit dem Rest der Probe. </li><li> Add 700 ul Puffer RWT auf die Spinsäule. Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie die Durchströmung. </li><li> Pipettieren Sie 500 ul Puffer RPE in die Spin-Säule. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 8000 × g, um die Säule zu waschen. Entsorgen Sie die Durchströmung. </li><li> Gib 500 ul Puffer RPE auf die Spinsäule. Zentrifugieren für 2 min bei 8.000 × g, um die Säule zu trocknen. </li><li> Übertragung der Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie 80 ul Ribonuklease-freies Wasser direkt auf die Spin-Säule Membran. Zentrifugieren für 1 min bei 8.000 × g, um die RNA zu eluieren. </li><li> 1 ul RNase-Inhibitor auf die RNA-Lösung. Lagern bei -80 ° C oder fahren Sie mit 5.13. </li><li> Um die Unversehrtheit der RNA zu bestätigen, berechnen wir zuerst die RNA concentration und 260/280 Verhältnis mit einem Spektralphotometer. </li><li> Verdünnte einen Teil der RNA-Lösung auf etwa 500 ng / &amp;mgr; l mit Molekularbiologie Wasser. </li><li> Bestimmen Sie die RNA-Integrität (dh RIN) mit Kapillar-Elektrophorese-Analyse. Etwa 5 &amp;mgr; l RNA-Lösung ist für die Analyse ausreicht. </li><li> Aliquot der RNA-Lösung (siehe Abbildung 2) und bei -80 ° C </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Isolierung von RNA aus Gewebe, die Ribonuklease reich sind eine große Herausforderung für die Molekularbiologie Experimenten. Verschiedene Reagenzien und Kits sind kommerziell erhältlich, die in erster Linie von dem Phenol Guanidinthiocyanat-Methode der RNA-Extraktion basieren. Guanidinthiocyanat denaturiert Protein und verringert die Aktivität der Ribonuklease damit. Die schiere Größe der Ribonuklease in der Bauchspeicheldrüse benötigt jedoch zusätzliche Modifikationen Standardprotokollen der RNA-Isolierung. Ein Protok...

Isolierung von RNA mit hoher Integrität ist für die routinemäßige molekularbiologische Experimente wie Northern Blot 9, qRT-PCR 1 oder Genexpressions 5 erforderlich. Die meisten zeitgenössischen Methoden der RNA-Isolierung werden bei Änderungen der Guanidinthiocyanat Protokolle 2, 3 basiert. Guanidinthiocyanat ist eine starke Proteindenaturierungsmittel und effektiv stören die Aktivität der Ribonuklease unter den meisten Bedingungen. Die beliebte Methode der Chomczynski und Sacchi 3 kombiniert Phenol zu dem Guanidinthiocyanat Lyse-Lösung, die Verminderung der Isolation Zeit, über 4 Stunden. Viele im Handel erhältliche RNA-Extraktion Reagenzien werden von der Chomczynski und Sacchi Methode 3 basierend. Ribonuklease reichen Geweben wie Mensch oder Maus Bauchspeicheldrüse stellt eine zusätzliche Herausforderung für die Isolierung von RNA. Maus Bauchspeicheldrüse kann bis zu 75 mg Ribonuklease 6 enthalten von denen einige Durin freigegeben werdeng Störung der nachfolgenden Gewebe Autolyse Pankreasgewebe. Modifikationen der Guanidinthiocyanat-Protokolle wurden erfolgreich verwendet, um RNA aus Pankreas mit hoher Integrität 2, 4, 7, 10. Infusion von RNA-Stabilisierung in Maus-Pankreas-Reagens erleichtert Isolierung von RNA mit hoher Integrität 4, 7, 10, jedoch Infusion isolieren Lösungen in der Bauchspeicheldrüse erfordert viel Geschick, können spezialisierte Instrumente wie einem Binokular und stören Gewebearchitektur während des Verfahrens kann in Zell-Lyse führen müssen. Perfusion Gewebes mit RNA-Stabilisierung Reagenz könnte mit anderen Anwendungen, einschließlich der Proteinisolierung und histologischen Färbung stören. Darüber hinaus ist diese Technik nicht geeignet zur Isolierung von RNA aus menschlichen Pankreas. Andere Protokolle erfordern die Herstellung von spezifischen Lösungen durch den Prüfarzt 2. Wir berichten über ein Protokoll zur RNA mit hoher Integrität von Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. ThE-Protokoll verwendet Elemente der bisher veröffentlichten Methoden und wird weitgehend von den Standard-Phenol / Guanidinthiocyanat-basierte Lyse-Reagenz-Protokollen. Es erfordert nicht die Herstellung von Speziallösungen noch erfordert es Infusion von Reagenzien in die Bauchspeicheldrüse. Kritische Schritte für eine erfolgreiche RNA-Isolierung sind eine hohe Phenol / Guanidin-basierte Lyse-Reagenz, um Gewebe-Verhältnis, die Entfernung von unverdauten Gewebe vor der Trennung und Aufnahme einer Ribonuklease-Hemmstoff, um die resultierende RNA-Lösung auslaufen. Mit diesen und anderen Modifikationen, die wir in der Regel isolieren RNA mit RIN größer als 7 um Routine Genexpressionsanalyse verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Leistung Gen 500&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>Homogenisator</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Gekühlte Mikrozentrifuge</td></tr><tr><td>Trizol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Lysis Reagenz</td></tr><tr><td>Student Vannas Federschere</td><td>Fisher</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>Zum Schneiden der Bauchspeicheldrüse aus anhaftendem Gewebe</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere, 6 Zoll</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Zum Schneiden von Zangen mit</td></tr><tr><td>stumpfem Ende</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Zum Halten der Bauchspeicheldrüse beim Präparieren</td></tr><tr><td>von Isofluran USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Rnase out (40 U/&micro; l)</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase Inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>Allgemein Rnase Inaktivator</td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Zum Waschen von Homogenisatorklingen</td></tr><tr><td>Wasser in molekularbiologischer Qualität</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Elution von RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>2 ml Mikrozentrifugenröhrchen, zertifiziert Rnase Dnase frei</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100</td>% <td>Ethanol Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>Zur Reinigung von Homogenisatorklingen</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Bioanalysator</td><td>Agilent</td><td></td><td>Kapillarelektrophorese-Analysator zur Messung der RNA-Integrität</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA-Stabilisierungsreagenz</td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp; Spalten drehen&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Spin Kolumnen&nbsp; als Teil des miRNeasy Mini Kits</td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>Chales River</td><td>Stamm C57BL/6</td><td>Ihr Alter reichte von 4 bis 12 Monaten.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>Stamm 129</td><td>Ihr Alter lag zwischen 4 und 12 Monaten. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

rna-isolierung aus maus pankreas: eine ribonuklease-reichen gewebe

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Die Isolierung von hochwertiger RNA aus ribonukleasereichem Gewebe wie der Bauchspeicheldrüse der Maus stellt eine Herausforderung dar. Da eine Hauptfunktion der Bauchspeicheldrüse darin besteht, die Verdauung zu unterstützen, kann die Bauchspeicheldrüse der Maus bis zu 75 mg Ribonuklease enthalten. Wir berichten über Modifikationen von Standardprotokollen für die Phenol/Guanidin-Thiocyanat-Lysereagenzien zur Isolierung von RNA aus der Bauchspeicheldrüse der Maus. Guanidinthiocyanat ist ein starkes Proteindenaturierungsmittel und stört die Aktivität der Ribonuklease unter den meisten Bedingungen effektiv. Es sind jedoch kritische Modifikationen an Standardprotokollen erforderlich, um RNA erfolgreich aus ribonukleasereichen Geweben zu isolieren. Zu den wichtigsten Schritten gehören ein hohes Verhältnis von Reagenz zu Gewebe bei der Lyse, die Entfernung von unverdauter Gewebe vor der Phasentrennung und die Aufnahme eines Ribonuklease-Inhibitors in die RNA-Lösung. Mit diesen und anderen Modifikationen isolieren wir routinemäßig RNA mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) von mehr als 7. Die isolierte RNA ist von geeigneter Qualität für die routinemäßige Genexpressionsanalyse. Die Anpassung dieses Protokolls an die Isolierung von RNA aus Ribonuklease-reichen Geweben neben der Bauchspeicheldrüse sollte leicht erreichbar sein.

Die Gesamt-RNA-Ausbeute aus 1 ml Lyse-Homogenat ist 20-40 ug. OD 260/280 Verhältnisse sind in der Regel rund 2,0 und die RIN sind durchweg größer als 7,0. Wenn das RIN ≤ 6, wird die Isolation müssen wiederholt werden. Gelegentlich wird ein RIN, die höher als 8,0 ist erreicht. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden der euthanizing Mäuse vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse sind CO 2-Erstickung oder Inhalation von Isofluran. Beide Techniken werden durch zervikale Disloka...

Wir berichten über ein Verfahren zur Isolierung von RNA mit hoher Integrität aus der Ribonuklease-reichen Bauchspeicheldrüse der Maus.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, RNA mit hoher Integrität aus der Bauchspeicheldrüse der Ribonuklease-Kammmaus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem die Bauchspeicheldrüse schnell aus dem Kadaver einer euthanasierten Maus entfernt wird. Als nächstes wird die Bauchspeicheldrüse in ein Lysereagenz getaucht und das Gewebe wird homogenisiert.Nach der Zentrifugation wird die RNA unter Verwendung von Standardprotokollen aus dem Überstand isoliert und die RNA-Inhibitorlösung wird der endgültigen RNA-Lösung zugesetzt. Der letzte Schritt besteht darin, die Homogenisatorklingen sorgfältig zu reinigen, indem Sie alle in den Klingen gefangenen Gewebestücke entfernen und dann eine Reihe von Ethanol- und Wasserwäschen durchführen. Letztendlich ermöglicht dieses Verfahren die Isolierung von RNA für die Bauchspeicheldrüse der Maus mit einer RNA-Integritätszahl von mehr als sieben, die für die routinemäßige Genexpressionsanalyse verwendet werden kann.Mein Name ist Tom Schmid und ich arbeite seit über 20 Jahren mit RNA, und in all dieser Zeit habe ich nichts so Schwieriges erlebt wie die Isolierung von RNA mit hoher Integrität für die Bauchspeicheldrüse der Maus. Die Technik, die wir Ihnen zeigen werden, wurde für die Bauchspeicheldrüse von Mäusen entwickelt, aber es gibt wirklich keinen Grund, warum sie nicht für eine Vielzahl anderer Gewebe verwendet werden könnte, einschließlich Gewebe aus menschlichen Zellen, Zelllinien oder anderen Geweben von Mäusen, einschließlich Rippennuklease-reichem Gewebe wie der Milz. Die Verwendung der Vorschläge in diesem Protokoll ermöglicht es Ihnen, RNA mit hoher Integrität aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu isolieren.Dies könnte für viele nachgelagerte Anwendungen wie QPCR, Genexpressions-Arrays oder RNA-Seq verwendet werden. Ola Elgamal. Ein älterer Doktorand in meinem Labor wird diese Technik demonstrieren, nachdem er die Maus eingeschläfert hat, wie im Textprotokoll beschrieben.Sichern Sie den Kadaver, indem Sie mit sterilen chirurgischen Instrumenten die vier Pfoten jedes der Tiere mit 25-Gauge-Injektionsnadeln in eine ebene Fläche stechen. Schneiden Sie den Mittelteil der Maus auf und entfernen Sie schnell die Bauchspeicheldrüse von der Maus. Halten Sie die Bauchspeicheldrüse mit der Pinzette fest und schneiden Sie sie mit einer Federschere von Milz und Dünndarm ab.Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse während der Entnahme aus der Maus nicht zu dehnen. Eine Störung des Gewebes kann die Ribonuklease auslösen. Legen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse in ein 50 Kubikzentimeter großes Röhrchen mit acht Millilitern eiskaltem Lysereagenz.Verschließen Sie das Röhrchen und schütteln Sie es kurz, um das Gewebe in das Reagenz einzutauchen, und fahren Sie sofort und ohne Verzögerung mit dem nächsten Schritt fort. Als nächstes homogenisieren Sie die Bauchspeicheldrüse für fünf Sekunden. Es ist wichtig, die Homogenisatorschaufeln an den Boden des Zentrifugenröhrchens zu drücken, damit das Gewebe für eine effiziente Homogenisierung in die Klingen gezogen werden kann.Um unverdautes Gewebe zu entfernen, geben Sie zwei Milliliter Lysereagenz, das die lysierte Bauchspeicheldrüse enthält, in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zwei Mikrozentrifugenröhrchen mit Homogenat pro Isolationszentrifuge bei vier Grad Celsius, 12.000 G für fünf Minuten, um das unverdaute Gewebe zu pelletieren. Dies ist ein kritischer Schritt, da die Verschleppung von unverdauter Gewebe in nachfolgende RNA-Lösungen die Probe wahrscheinlich mit Ribonuklease kontaminiert.Reinigen Sie die Homogenisatorklingen, indem Sie sie in 10 Milliliter 70%iges Ethanol legen. Aktivieren Sie den Homogenisator für etwa 20 Sekunden, um alle Gewebestücke zu entfernen, die sich in den Klingen verfangen haben könnten. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um alle Stücke zu entfernen, die in den Homogenisatorklingen verbleiben.Reinigen Sie die Homogenisatorklingen erneut mit Wasser, allgemeinem RNA-Syn-Aktivator und 70 % Ethanol. Trocknen Sie abschließend die Homogenisatorwelle mit einem sauberen Kim-Tuch. Übertragen Sie einen Milliliter des SNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern.Legen Sie alle Röhrchen mit dem Homogenat auf nasses Eis, während Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fahren Sie sofort mit der RNA-Isolierung fort und lagern Sie das Replikationsröhrchen bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Entsorgen Sie das restliche Lysereagenz in einem geeigneten Behälter für chemische Abfälle.Im folgenden Abschnitt wird ein RNA-Aufreinigungskit verwendet. Der Vorteil des Aufreinigungskits besteht darin, dass es die gesamte RNA, einschließlich kleiner RNAs, isoliert. Beginnen Sie die Isolierung, indem Sie der Homogenatlösung 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen.Verschließen Sie das Röhrchen und schütteln Sie es 15 Sekunden lang kräftig mit der Hand. Lassen Sie das Röhrchen dann zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur stehen, nachdem es 15 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius zentrifugiert wurde. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie 1,5 Volumen Isopropanol hinzu und mischen Sie es gründlich, indem Sie es mehrmals auf und ab pipettieren. Übertragen Sie bis zu 700 Mikroliter der Probe in eine Spin-Säule, die in ein zwei Milliliter fassendes Sammelröhrchen gegeben wird. Schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie ihn 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 8.000 μg und verwerfen Sie dann den Durchfluss.Geben Sie anschließend 700 Mikroliter Puffer RWT in die Spin-Säule und zentrifugieren Sie. Verwerfen Sie wie zuvor den Durchfluss durch die Pipette von 500 Mikrolitern Puffer RPE in die Spin-Säule und zentrifugieren Sie erneut, um die Säule zu waschen. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, geben Sie weitere 500 Mikroliter Puffer RPE für zwei Minuten bei 8.000 Mal in die Spin-Säulenzentrifuge, geben Sie G.To trocknen Sie die Säule, übertragen Sie die Spin-Säule in eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugen-Rohrpipette, 100 Mikroliter rippenkernfreies Wasser direkt auf die Spin-Säulen-Membranzentrifuge für eine Minute bei 8, 000 mal G zur Eluierung, die RNA.Fügen Sie dann der RNA-Lösung einen Mikroliter RNA-Inhibitor hinzu und fahren Sie mit der Bestimmung der RNA-Integrität unter Verwendung einer Kapillarelektrophoreseanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben: Der Vergleich der RNA-Integritätszahl oder RIN von RNA, die aus der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert wurde, zeigt eine direkte Korrelation zwischen dem Volumen des bei der Homogenisierung verwendeten Lysereagenzes und der RNA-Integrität. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass acht Milliliter Lysereagenz verwendet werden sollten. In diesem Protokoll wurde der wässrigen RNA-Lösung ein Ribonuklease-Inhibitor zugesetzt und die RNA-Integrität beim Auftauen im Gefrieren verglichen. Die RIN für die Lösung von RNA mit Inhibitor betrug 7,3 plus oder minus 0,15 im Vergleich zu 2,9 plus oder minus 0,65 für die Lösung, die keinen Inhibitor enthielt, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass wiederholtes Einfrieren den Ribonuklease-Inhibitor denaturiert und ihn unwirksam macht.Es wurde eine RNA-Lösung getestet, die einen Ribonuklease-Inhibitor enthält. Die RNA-Lösungen, die bis zu fünfmal eingefroren und aufgetaut wurden, ergaben immer noch eine RIN von sieben oder mehr. Während die Lösungen, die sechsmal oder länger eingefroren und aufgetaut wurden, eine RIN von weniger als sieben zufälligen Primzahlen erzeugten, wurde CDNA aus der RNA synthetisiert und die Expression von drei Housekeeping-Genen mittels QPCR gemessen.Unter Verwendung von Standardtechniken validieren die Daten den erfolgreichen Einsatz von Pankreas-RNA der Maus in einer molekularbiologischen Standardtechnik. Einmal richtig ausgebildet, sollten Doktoranden und Postdocs in der Lage sein, diese Technik in etwa 30 Minuten durchzuführen. Und ich möchte Ihnen nur ein wenig darüber erzählen, wie wir es verwenden.Wir untersuchen transgene Mausmodelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs und verwenden diese Technik, um RNA zu isolieren. Und wenn wir dann die RNA bekommen, werden wir die Genexpression von Mikro-RNA in diesen Tieren untersuchen.

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Hier beschreiben wir die Immunpräzipitation von Ribosomen und zugehöriger RNA aus ausgewählten Populationen erwachsener männlicher Mauskeimzellen mit dem RiboTag-System. Strategische Züchtung und sorgfältige Immunpräzipitation führen zu sauberen, reproduzierbaren Ergebnissen, die über das Keimzelltranslatom informieren und Einblicke in die Mechanismen mutierter Phänotypen geben.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Die Reinheit und Integrität der isolierten RNA ist ein wichtiger Schritt in RNA-abhängigen Assays. Hier präsentieren wir eine praktische, schnelle und kostengünstige Methode, um RNA aus einer kleinen Menge unbeschädigtem Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren.

Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Lernen Sie die RNA-Isolierung aus ribonuklease-reichem Mäusepankreas mit hoher Integrität. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Genexpressionsanalysen für entwicklungsbiologische und krebsbiologische Studien.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Weitere Videos entdecken