Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen
August 8th, 2014
Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Thymusepithelzellen oder -technologien. Dies wird erreicht, indem der Thymus zunächst enzymatisch verdaut und mechanisch aufgebrochen wird, um die Technologie in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Anschließend kann die Technologie durch Durchflusszytometrie analysiert oder über eine Panning-Strategie angereichert werden.
Letztendlich können Untergruppen des Thymusepithels durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aufgereinigt werden. Diese Methode kann helfen, viele Schlüsselfragen auf dem Gebiet der T-Zell-Entwicklung zu beantworten, wie z.B. wie fördern Thymus-Epithelzellen die Thymusselektion? Was verursacht eine Thymusfunktionsstörung bei alternden Tieren und wie können wir eine T-Zell-Rekonstitution in vitro erreichen?
Die Hauptvorteile dieser Technik sind die hohe Rückgewinnung variabler emmischer Keimzellen, die unvoreingenommene Anreicherung der emmischen Epithelzellen und die hohe Reinheit, die letztendlich durch die Zellsortierung erreicht werden kann. Um Thymusstromazellen zu isolieren, identifizieren Sie zunächst den Thymus, der sich direkt unter den Rippen befindet und wie zwei dünne weiße Lappen aussieht, die über dem Herzen liegen. Trennen Sie dann das Bindegewebe, das den Thymus umgibt, und verwenden Sie eine gebogene gezackte Pinzette, um die Thymuslappen sanft zu ziehen und zu entfernen.
Legen Sie die Lappen in eine Sechs-Well-Platte mit fünf Millilitern Medium und schneiden Sie das umgebende Fett und Bindegewebe ab. Dann werden die abgeschnittenen Lappen in eine neue Vertiefung mit fünf Millilitern frisch zubereiteter Enzymlösung übertragen und mit einer feinen Schere kleine Schnitte in das Gewebe gesetzt. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.
Nach 20 Minuten pipettieren Sie das Gewebe mehrmals vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Pipette auf und ab, um die Aufschlämmung in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Sammeln Sie die Überstandsfraktion in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern kaltem albuminreichem Puffer auf Eis, um die Enzyme zu neutralisieren. Geben Sie dann 2,5 Milliliter Enzymlösung in das restliche Gewebe
.Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang. Rühren Sie danach das Gewebe vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Spritze auf, die mit einer 18-Gen-Nadel ausgestattet ist, um eventuelle Aggregate aufzubrechen. Übertragen Sie es dann in das Auffangröhrchen.
Geben Sie dann 2,5 Milliliter Enzymlösung in das restliche Gewebe. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang. Wiederholen Sie nach der dritten Inkubation das mechanische Rühren mit einer 20 5G-Nadel.
Nachdem Sie das Gewebe für die letzten fünf bis 10 Minuten inkubiert haben, überführen Sie den Überstand zur Zentrifugation in das Sammelröhrchen, um den wiedergewonnenen Tech durch Durchflusszytometrie zu identifizieren. Gemäß den Standardverfahren zur Färbung von Antikörpern führen Sie die Proben auf einem Multiparameter-Durchflusszytometer durch und analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Faxanalysesoftware, um die Technologie durch die Panning-Methode weiter anzureichern. Inkubieren Sie zunächst die Zellen mit dem entsprechenden Antikörper für die Anreicherung. Geben Sie dann die Zellsuspension in eine vorcodierte Panning-Platte, schwenken Sie die Platte und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.
Nach 30 Minuten die Platte kräftig schwenken und dann den Überstand in ein konisches Röhrchen geben. Spülen Sie die Platte zweimal mit frischer, mittlerer Flüssigkeit aus und sammeln Sie die Wäschen im Auffangröhrchen. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem Medium und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine neue Panning-Platte, indem Sie die Zellen nach dem Schwenken und Inkubieren, wie gerade gezeigt, sammeln, um die angereicherte Technologie weiter in ihre Thymuszell-Untergruppen zu reinigen.
Nach der Markierung mit den entsprechenden Antikörpern sortieren Sie den Tech durch eine 100-Mikrometer-Düse durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, wobei die Zellen in 30 % Volumen pro Volumen FBS im Medium gesammelt werden. In dieser repräsentativen Gating-Strategie zur Identifizierung von Tech mittels Durchflusszytometrie kann die Expression von epca, nicht aber von CD 45 durch die Tech beobachtet werden. So kann die Tech entsprechend ihrer ep-, cam- und CD 45-Expressions-Tech aus kortikalen oder CEC- und medullären oder mtech-thymusepithelialen Untergruppen gebildet werden.
Diese Untergruppen können durch den lebenden 51-Antikörper unterschieden werden, der die von ctec exprimierte G-Glutamylaminopeptidase erkennt, und das Lektin UEA, das sowohl ctech als auch Mtech exprimieren MHC Klasse zwei auf ihren Oberflächen bindet. Obwohl mtech weiter in mtech niedrige und mtech hohe Populationen eingeteilt werden kann, kann je nach ihrem Grad der MHC-2-Expression mit dem gerade demonstrierten Liase-Enzym-basierten Protokoll etwa achtmal mehr tech gewonnen werden, verglichen mit einem Protokoll mit Kollagenase und Discspace mit etwa neunmal 10 bis fünft, das aus nur einem Mausthymus gewonnen werden kann, um die Sortierzeit zu verkürzen und die Lebensfähigkeit des wiederhergestellte Stromazellen. Panning kann, wie gerade gezeigt, verwendet werden, um die Thymozytenstellen im Vergleich zu ganzen präparierten Thymuszellen zu erschöpfen.
Der Anteil der Technologie steigt von weniger als 0,5 % auf über 15 % in der postangereicherten Zellpopulation. Nach dem Panning werden die Anteile der Tech-Teilmengen nicht geändert, was darauf hindeutet, dass keine der beiden Teilmengen beim Panning selektiv verloren geht. Im Vergleich zur Preen-Anreicherungsprobe beträgt die Wiederfindungsrate der Technologie etwa 85 %Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie themische Keimzellen aus mehr als Panik anreichern und wie Sie mehr themische Epithelabfälle durch Durchflusszytometrie identifizieren und reinigen können.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Dieser Artikel präsentiert eine Methode zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von epithelialen Thymuszellen (TECs) der Maus. Das Protokoll ist so konzipiert, dass es Studien zur Thymusfunktion, T-Zell-Entwicklung und thymischen Dysfunktion erleichtert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Thymusfunktion
Hintergrund
- Epitheliale Thymuszellen spielen eine entscheidende Rolle in der T-Zell-Entwicklung.
- Das Verständnis von TECs kann Einblicke in thymische Selektionsprozesse liefern.
- Thymische Dysfunktion wird mit Alterung und verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht.
- Die Rekonstitution von T-Zellen ist für therapeutische Strategien von entscheidender Bedeutung.
Zweck der Studie
- TECs zu isolieren und zu reinigen für eine detaillierte Analyse.
- Die Mechanismen der thymischen Selektion zu untersuchen.
- Ursachen der thymischen Dysfunktion im Alter zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung und mechanische Zerstörung des Thymus.
- Durchflusszytometrie zur Analyse von TECs.
- Panning-Strategie zur Anreicherung von TECs.
- Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von TEC-Subgruppen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung und Reinigung von TECs.
- Identifizierung wichtiger TEC-Subgruppen, die an der T-Zell-Entwicklung beteiligt sind.
- Einblicke in die Mechanismen der thymischen Selektion.
- Potenzielle Auswirkungen auf T-Zell-Rekonstitutionstherapien.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist effektiv für die Untersuchung von TECs.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der thymischen Funktion und Dysfunktion bei.
- Zukünftige Forschung kann auf diesem Protokoll aufbauen, um die T-Zell-Entwicklung zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
