Name: Die Züchtung Caenorhabditis elegans In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die axenische Kultivierung von Caenorhabditis elegans in CeHR-Flüssigmedien zur Elimination bakterieller Nebenprodukte in Nährstoffstudien. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen des Wurmstoffwechsels.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of HealthGrants DK85035 und DK074797 (IH) unterstützt.

1. Worm Stämme <ol><li> Erhalten C. elegans Wildtyp N2 Bristol-Sorten von Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) und halten sie auf NGM-Platten ausgesät mit E. coli-Stamm OP50 7. Hinweis: Transgene Wurm Stämme IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) verwendet wurden, wie zuvor beschrieben, erzeugt 11. IQ6011 können aus dem entsprechenden Autor angefordert werden. </li></ol> 2. Herstellung des modifizierten C elegans Wohn-und Reproduktion Medium (mCeHR) Bereiten mCeHR flüssigen Medien wie unten 12 beschrieben. Diese axenischen flüssigen Medien können die Würmer ohne zusätzliche Nahrungsquellen wachsen. Führen Sie alle Manipulationen axenischen flüssigen Medien und axenischen Würmer mit streng sterilen Bedingungen, wie einer Steril. <ol><li> Erhalten Ultra pasteurisierte fettfreie Milch aus einem Lebensmittelgeschäft. Verwenden Sie die Kühl proKanal und nicht die Raumtemperatur Produkt. Vor der in mCeHR Medium, streifen verwenden Sie die Milch auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platten und Inkubation für 3 Tage bei 30 ° C und 37 ° C, um die Sterilität zu überprüfen. Bringen Sie die Milch auf 50 ml sterilen Röhrchen und bei -80 ° C </li><li> Bereiten Sie jede der folgenden Komponenten kombinieren und in der Reihenfolge und Mengen gegeben, um 1 l mCeHR vorbereiten (Tabelle 1A): 10 ml 2 mM Cholin Disäure Citrat, 10 ml Vitamin-und Wachstumsfaktor-Mix (siehe Rezept in Tabelle 1B), 10 ml von 2,4 mM myo-Inositol, 10 ml 2 mM Hämin Chlorid, 250 ml deionisiertes Wasser. Bewerben Absaug-und Filter durch ein 0,22 um Filtereinheit. </li><li> 20 ml der Nukleinsäuremischung (Rezeptur in Tabelle 1C) wurden 100 ml Mineralmischung (Rezeptur in Tabelle 1D), 20 ml 170 mg / ml Lactalbumin-Hydrolysat, 20 ml essentielle Aminosäuren, 10 ml nicht-essentiellen Aminosäuren Säuren mit 20 ml 450 mM KH 2 PO 4,50 ml von 1,45 M D-Glucose, 10 ml 1 M HEPES, Natriumsalz, 250 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Absaugen zu filtern sterilisieren der Komponenten. Entfernen Sie den Filter und 1 ml 5 mg / ml Cholesterin. Sicherzustellen, dass der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6-6,5. Anmerkung: Diese Lösung kann bei -80 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. </li><li> Mit 20% (v / v) organische Ultra pasteurisierte Magermilch auf die mCeHR Medium vor der Verwendung. Verwenden Sie gewissenhaft steriler Technik (zum Beispiel in einer Steril) beim Öffnen und Aliquotierung die Milch. Lagern Sie das Material bei 4 ° C </li></ol> 3. Bereiten C. elegans für die Kultur in Axenic mCeHR Flüssigmedium <ol><li> Wachsen Würmer auf zehn 60 mm NGM-Platten, bis es viele graviden Würmer und eine minimale Menge an OP50 E. coli auf den Platten. </li><li> Entfernen Sie die Würmer von jeder Platte durch Spülen mit 5 ml M9-Puffer (Rezept in Tabelle 1F), und verbinden in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Lassen Sie die Würmer zu sEttle, indem man das Rohr auf 5 bis 10 Minuten stehen dann vorsichtig den Überstand mit dem E. coli. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 2x so viel von den restlichen Bakterien wie möglich vor der Fortsetzung des Verfahrens zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Würmer in 0,1 N NaCl in einem Volumen, das ein Vielfaches von drei ist, beispielsweise 1,5 ml, 3 ml oder 6 ml in denen einzelne Würmer in dem Rohr zu erkennen. </li><li> Bleichen die Würmer durch Zugabe von 5 N NaOH und 5% Natriumhypochlorit (Bleichmittel)-Lösung in einem Verhältnis zum 01.02.06 Wurm Federung. Beispielsweise 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% Natriumhypochlorit: 6 ml des Schnecken Suspension. Mischen Sie die NaOH und Bleichmittel, bevor Sie mit der Schnecken Federung. </li><li> Wirbel die Lösung kräftig, bis graviden Würmer gelöst und nur Eier in der Suspension (etwa 5 bis 10 min) sichtbar sind. Beobachtung des Prozesses unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops mit einem 10X-Objektiv. </li><li> Nachdem die Würmer vollständig gelöst, die sofort zu pelletierenEier bei 800 × g für 45 sec bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und spülen das Pellet zweimal mit 10 ml sterilem Wasser durch Zentrifugieren des Pellets bei 800 × g für 45 sec bei 4 ° C. </li><li> Nach dem Bleichen das Ei übertragen Pellets in ein 25 cm 2-Gewebekulturkolben mit 10 ml mCeHR Medien mit 100 ug / ml Tetracyclin ergänzt. Führen Sie diesen Vorgang mit sterilen Techniken. Wenn gewünscht, fügen Sie zusätzliche Antibiotika, darunter 250 ug / ml Nalidixinsäure, um das Bakterienwachstum in den axenischen Flüssigkulturen zu verhindern. </li><li> Flüssigkulturen bei 20 ° C inkubieren auf einem Schüttelinkubator bei etwa 70 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überprüfen Sie die Würmer täglich zu beachten die Phase der Entwicklung und der Wachstumsrate. Hinweis: Worms wird zunächst langsam wachsen und erfordern 7 bis 10 Tage, um trächtig zu werden. Da die Würmer akklimatisieren zu dem flüssigen Medium der Erzeugungszeit wird auf etwa 4 Tage Wildtyp (N2) Würmer verringern. </li><li> Nachdem die Würmer Entwickelt, um der schwangeren Bühne in flüssigen Medien, übertragen den Wurm Kultur zu einem konischen Rohr und Pellet die Würmer bei 800 g für 5 min bei 4 ° C mit einem Ausschwingrotor. </li><li> Entfernen des Überstandes und vorsichtig resuspendieren Schnecken Pellet in einem gleichen Volumen von 0,1 M NaCl. Verwenden Sie beispielsweise 10 ml 0,1 M NaCl für Würmer in 10 ml mCeHR kultiviert. Lassen Sie die Würmer für 5 min auf Eis zu begleichen. </li><li> Führen Sie die Schritte wie oben in 3.5-3.8 beschriebenen Bleichverfahren und ermöglichen die Würmer, für eine zweite Generation in den axenischen flüssigen Medien wachsen. Falls erforderlich, das Antibiotikum wieder um das Bakterienwachstum zu hemmen. </li><li> Auch hier ermöglichen die Würmer zu gravid werden dann Pellet resuspendieren und die Würmer in 0,1 M NaCl wie in den Schritten 3.12 und 3.13 beschrieben, dann wieder wie in den Schritten bleichen 3.5-3.8 beschrieben, um eine synchronisierte Bevölkerung zu produzieren. Wachsen die L1-Larven Würmer in flüssigen Medien ohne Antibiotika von nun an. </li></ol> 4. Synchronisieren von Worms aus FlüssigKultur <ol><li> Pellet zu resuspendieren und die Würmer in 0,1 M NaCl, wie oben in den Schritten 3.12 und 3.13 beschrieben. Bleach, wie oben beschrieben, in Schritten von 3,5 bis 3,8. </li><li> Resuspendieren Sie das Ei Pellet in 10 ml M9-Puffer und damit die Larven zu O / N bei 20 ° C auf einer rotierenden Plattform Schüttler schlüpfen. Hinweis: Die Eier werden in die L1-Larven schlüpfen, wird aber nicht weiter zu entwickeln, die Synchronisation der Würmer an der L1 Bühne. </li><li> Zur Erhaltung und Subkultur Würmer, Pellet-L1-Larven bei 800 g für 5 min, dann wieder zu suspendieren die Larven in 10 ml mCeHR und in ein 25 cm 2-Kolben. Ermöglichen die Würmer bei 20 ° C auf einer rotierenden Plattform wächst. Aufrechterhaltung einer maximalen Dichte von 3,000 Würmern / ml / cm 2, um eine angemessene Ernährung für die Würmer zu gewährleisten. Anmerkung: In diesem Stadium werden Antibiotika nicht erforderlich axenischen Bedingungen aufrechtzuerhalten, wenn die Verfahren unter Verwendung steriler Techniken in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt. Worms sollte täglich überwacht, um das Wachstum überprüft werden. </li></ol> 5. Freiezing und Auftauen Worms für Axenic Medium Kulturen <ol><li> Frieren axenischen asynchrone Wurm Kulturen oder synchronisiert L1-Larven in flüssigem Stickstoff. Pellet Würmer bei 800 × g für 5 min, dann in S-Puffer resuspendieren (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCl) unter Verwendung von 0,5 ml pro Ampulle. Gleiches Volumen von S-Puffer mit 30% v / v Glycerin zu jedem Fläschchen und übertragen die Würmer bis -80 ° C, bevor langfristige Lagerung in flüssigem N 2. Einfrieren etwa 1 x 10 &amp;sup6; Würmer pro ml in jeder Flasche. </li><li> Auftauen Würmer durch Inkubation der Röhrchen bei 37 ° C für ca. 2 min, bis fast die gesamte Eis geschmolzen ist. In einer Steril, übertragen Sie die Würmer in einen sterilen Kolben mit mCeHR und legen sie bei 20 ° C </li></ol> 6. Bestimmen Sie die Wirkung von Hämin Konzentration auf Wachstum und Reproduktion mCeHR <ol><li> Verwenden axenischen mCeHR Medien Nährstoff abhängige Wachstum von C. Assay elegans. Zur Bestimmung der Wirkung of Hämin Konzentration auf Wurm Wachstum und Entwicklung, verwenden synchronisiert axenischen N2 Würmer oder andere Stämme von Interesse. Synchronisieren L1-Larven, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Am folgenden Tag, Pellet-und L1-Larven zählen synchronisiert und mit Wasser auf ein Wurm pro ul axenischen Medien. Machen Sie 10 mM Häminchlorid in 0,3 M NH 4 OH und auf pH 8 mit konzentrierter HCl. </li><li> In 800 ul mCeHR Medien zu einem 24-Well-Platte. Mit 100 Würmer in jede Vertiefung in 100 ul Medium. Hinzufügen Häminchlorid zu jeder Vertiefung in Konzentrationen im Bereich von 0 &amp;mgr; M, 1,5 &amp;mgr; M bis 1,000 &amp;mgr; M in dreifacher Ausführung. Sicherzustellen, dass alle Vertiefungen die gleiche Konzentration von 0,3 M NH 4 OH. Vorsichtig resuspendiert die Würmer vor dem Pipettieren, um sicherzustellen, dass 100 L1-Larven werden in jede Vertiefung gegeben. </li><li> Untersuchen Sie die Würmer täglich, und beachten Sie das Wachstum in jeder Konzentration in jede Vertiefung. Zähle die Anzahl der Würmer nach 9 Tagen Inkubation und zeichnen die Anzahl der Würmer / ml, die jedem HämKonzentration (Abbildung 1). </li></ol> 7. Wirkung von Hämin Konzentration auf Häm-Sensor Worms <ol><li> Inkubieren synchronisiert L1 Häm Sensor Würmer (Phrg-1 :: gfp) in mCeHR enthaltend 4 &amp;mgr; M, 8 &amp;mgr; M, 10 &amp;mgr; M und 20 &amp;mgr; M Hämin. </li><li> Bild die Würmer mittels Fluoreszenz der konfokalen Mikroskopie, 48 Stunden nach der Inkubation (Abbildung 2). </li></ol> 8. Verwendung mCeHR transgene C. generieren elegans Mit Mikropartikelbeschuss Hinweis: Das Verfahren zur Erstellung und Durchführung von Mikropartikelbeschuss mit unc-119 (ed3) Würmer in mCeHR gewachsen ist in Abbildung 3 13 skizziert. <ol><li> Worm Vorbereitung <ol><li> Übertragen etwa 1 x 10 6 asynchronen unc-119 (ED3) Würmer in 90 ml mCeHR Medien in einer 175 cm 2-Kolben eine Woche vor der Bombardierung. Lassen Sie die Würmer bei 20 ° C o wachsenna Schüttelplattform bei ~ 70 min (Abbildung 3-1). Hinweis: Eine Woche später, sollte der Wurm Dichte deutlich größer mit vielen Erwachsenen trächtige Würmer sein. Etwa 3 × 10 7 Würmer für Mikroteilchenbeschuß erforderlich. </li><li> Gefühlt JM109 E. coli ausgesät 10 cm NGM-Platten auf Eis. </li><li> Übertragen Sie die axenischen Würmer, zwei 50 ml konische Röhrchen zentrifugiert und die Würmer bei 800 g für 2 min. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Würmer in jedem Röhrchen in 50 ml M9-Puffer (Fig. 3-2). </li><li> Ermöglichen die erwachsenen Würmer durch die Schwerkraft für 10 bis 15 min auf Eis zu pelletieren. Hinweis: Die 2 ml Pellet sollte jetzt&gt; 90% erwachsenen Würmer. Diese 2 ml Pellet sollte etwa 5 x 10 &amp;sup6; Würmer und reicht für eine Mikropartikelbeschuss. </li><li> Bestreichen Sie die gesamte Oberfläche des Kühl JM109 ausgesät NGM Platte mit der 2 ml Pellet von Würmern. Lassen Sie die vollständig absorbiert werden Flüssigkeit verlassen dann die Plattefür 30 min auf Eis, bevor Sie fortfahren (Abbildung 3-3). </li></ol></li><li> Herstellung von Goldpartikeln <ol><li> Wiegen Sie 30 mg Goldpartikel in einem silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml 70% Ethanol und das Röhrchen vortexen für 5 min. </li><li> Ermöglichen die Röhre für 15 Minuten sitzen, dann Zentrifugieren bei 6.000 × g für 10 s, um die Goldpartikel zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze durch vorsichtiges Berühren der Spitze an der Seite der Röhre gegenüber den Goldpartikeln. </li><li> Waschen Sie die Goldpartikel mit 1 ml steriles Wasser, Wirbel für 1 min und kurz zentrifugieren bei 6.000 g für 10 Sekunden. Wiederholen der Waschschritt zweimal, dann Resuspendieren der Goldpartikel in 0,5 ml sterilem 50% Glycerin. Hinweis: Die Endkonzentration der Goldpartikel werden 60 mg / ml und es kann für 1 bis 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden </li></ol></li><li> Bereiten Sie die DNA-Gold-Partikel-Mix <ol><li> Mähdrescher 10 &amp;mgr; g der gewünschten Plasmid-DNA mit 10 und# 956; g des unc-119 Rettungs Plasmid in einem silikonisierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 50 ul DI-Wasser und 100 ul gut resuspendiert Goldpartikellösung dann Wirbel für 1 min. </li><li> In 150 ul 2,5 M CaCl 2 und verwirbeln die Lösung erneut für 1 min. Zu dieser Lösung wurden mit 60 ul 0,1 M Spermidin und Wirbel für 3 bis 5 min. </li><li> Pulszentrifugieren Lösung bei 6.000 g für 10 sec, den Überstand und 300 ul 70% Ethanol. Vortex gut für 1 min, Puls-Zentrifuge bei 6.000 xg, den Überstand und resuspendieren in 170 ul von 100% Ethanol. Kräftig vortexen die Lösung für 5 bis 10 min Puls dann Zentrifuge und den Überstand entfernen. </li></ol></li><li> Bombardierung (Abbildung 3-3) Hinweis: Dieses Protokoll wird mit der in der Tabelle der Materialien / Ausrüstung angegebene Partikelliefersystem durchgeführt. Folgen Sie den Anweisungen für die Partikelliefer Instrument zur Verfügung. <ol> &lt;li&gt; Legen Sie ein Blatt Seidenpapier in einen 15 cm Teller. Mit einer Pinzette, tauchen sieben Makrocarrier einzeln in 100% Ethanol und legen sie auf das Gewebe zu trocknen. </li><li> Gründlich biolistischer Kammer, Macrocarrier Halter und Zieltafel mit 70% Ethanol reinigen. Reinigen und Autoklavieren die Bildschirme vor jedem Anhalten Bombardement Verfahren. </li><li> Laden Sie die macrocarrriers in die Halterung mit einer Pinzette und drücken in die Halterung mit der Sitz Tool. </li><li> Gleichmäßig verteilt 20 ul der DNA-beschichteten Goldpartikel in der Mitte jedes Macrocarrier und die Lösung dann vollständig trocknen. </li><li> Reinigen Sie die beiden Teile des Druckteiler mit Ethanol und montieren mit Ethanol gereinigt Berstscheiben. Schrauben Sie die Druckteiler montiert und Berstscheiben in der Bombardierung Kammer. </li><li> Bauen Sie eine autoklaviert Anhalten Bildschirm mit der Macrocarrier Halter und legen Sie das Gerät auf den Metallboden erforderlich und einrasten. </li><li> Legen Sie die zusammengebauten macrocarrier Vorrichtung in den biolistischer Kammer in der vorgesehenen Schlitz unterhalb des Druckteiler und richten Sie mit der Druckteiler. </li><li> Kleben Sie die offenen NGM-Platte mit den Würmern auf der Zielplatte Regal und schließen Sie die Tür der Kammer. </li><li> Um Würmer zu bombardieren, den Druck auf, was benötigt, um die Berstscheiben brechen. Schalten Sie die Vakuum bis 28 Zoll Hg Druck, und drücken Sie den Feuerknopf, bis die Scheiben bersten. </li><li> Lassen Sie die Vakuum und entfernen Sie die NGM-Platte aus dem Gerät. Waschen Sie die Würmer von der Platte und verteilen in zwanzig 10 cm NGM-Platten mit JM109 E. ausgesät coli (Abbildung 3-4). </li><li> Ermöglichen die Würmer über 10 bis 14 Tage bei 25 ° C wachsen und verhungern die Platten. Worms aus dem unc-119 Defekt gerettet werden normale Bewegung haben und in dieser Zeit identifiziert werden. Wählen Sie mindestens 10 &quot;Wildtyp&quot; Würmer aus getrennten Platten für die weitere Analyse wie diese stellen unabhängigen transgenen Linien (FigurE 3-5). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, gibt es keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikt.

In diesem Protokoll präsentieren wir eine modifizierte axenischen flüssigen Medien, die für eine schnelle mCeHR C erlaubt elegans Generation mit der Produktion einer großen Anzahl von Würmern. Dieses Bild zeigt mehrere Vorteile, wie die Würmer ohne Kontamination E. gewachsen coli oder bakteriellen Nebenprodukten und in Ernährungs-und toxikologischen Untersuchungen genutzt werden. Die Verwendung von E. coli oder anderen Bakterien in solchen Studien hat mehrere Nachteile. Zum B...

Der Boden Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus in zahlreichen Studien von der Genetik zur Toxikologie verwendet. Als Ergebnis der 1 mm Größe, Generationszeit von vier Tagen Kultivierung einfache schnelle und große Zahlen Nachkommen haben diese Nematoden in einer Reihe von pharmakologischen und genetischen Bildschirme 1, 2 verwendet wurden. Forscher nutzen diese Wurm-Moleküle und Signalwege in Wirbelsysteme erhalten zu identifizieren. Diese Wege sind Zelltod-Signale, Wege des Alterns und der Stoffwechsel und das Nervensystem 6.3. Zusätzlich wird die Transparenz der C elegans können für die Erzeugung von transgenen Linien mit fluoreszierenden Reporter-Proteins, die direkt sichtbar ist, um die Genexpression und Proteinlokalisation Muster analysieren. In vielen Studien auf einem festen Agar-basierte Oberfläche mit Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten oder in l dieser Nematoden gezüchtetiquid Kulturen ausgesät mit Escherichia coli als Nahrungsquelle 7,8. Diese bakteriellen Nahrungsquellen können biochemischen und toxikologischen Studien mit Störungen von bakteriellen Nebenprodukten, die die Interpretation der Ergebnisse zu verwechseln. Um diese Effekte zu vermeiden Compoundierung, C. elegans kann in einer keimfreien flüssigen Medien, die frei von Bakterien als Nahrungsquelle kultiviert werden. Mit Hilfe dieser Medien, erfolgreich wir Millionen von hochsynchrone Würmer für viele Standard-C kultiviert elegans Protokolle wie Microarray-Analyse von differentiell regulierten Gene in C. elegans ausgesetzt, um verschiedene Häm-Konzentrationen und Herstellung von transgenen Würmer Verwendung von Gen-Bombardement. Dieses Medium ist chemisch definiert und von einem Original-Rezept von Dr. Eric Clegg 9 formuliert modifiziert. Mit dieser mCeHR Medien, haben wir erfolgreich Gene in Häm-Homöostase beteiligt identifiziert, die als Häm-responsive Gene (HRG n) 10, was wärewurden nicht in regulären Wachstumsbedingungen, die NGM-Agar-Platten mit E. ausgesät nutzen möglich coli. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Einführung und Beibehaltung C. elegans auf E. gewachsen coli auf die axenischen mCeHR und nutzen diese Methode, um eine große Anzahl von Würmern zur Herstellung von transgenen C zu erhalten elegans Linien mit Mikropartikelbeschuss. Außerdem präsentieren wir Studien, die den Nutzen der Verwendung axenischen Medien für die Bestimmung der Nährstoffbedarf von C. zeigen elegans mit Häm als Beispiel. Diese Studien zeigen, dass die Verwendung mCeHR Medien ermöglicht schnelle Wachstum von einer großen Anzahl von C elegans für viele Forscher von Wurm genutzt Downstream-Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>MgCl2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcitrat Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226; 4H2O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226; 2H2</td><td>O Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5-monophosphat, Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidin 5-phosphat</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin 2' - und 3' -monophosphat</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridin 5-phosphat, Dinatriumsalz</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymin</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamin</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanin</td><td>Fisher</td><td>S25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoesäure</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamin (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinat (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacin</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamid</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantethein</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenat (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutaminsäure (Folsäure)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5'-phosphat</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamin 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxin HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-PO4(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamin HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Thioctsäure</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Cholindisäurecitrat</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin enzymatisches Hydrolysat</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Häminchlorid</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminosäuren Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixinsäure Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Goldpartikel (Au-Pulver)</td><td>&nbsp; Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>oder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Particles 1,0 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; Tel.: 165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

die züchtung caenorhabditis elegans in axenic flüssige medien und erstellung von transgenen worms durch mikropartikelbeschuss

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In diesem Protokoll stellen wir die benötigten Materialien und das Verfahren zur Herstellung von modifizierten C. E legans Gewöhnung und Wiedergabemedien (mCeHR). Darüber hinaus sind die Schritte zum Belichten Akklimatisierung und C. elegans auf E. gewachsen coli, um flüssige Medien axenischen beschrieben. Schließlich abwärts Experimente, die axenischen C nutzen elegans veranschaulichen die Vorteile dieses Verfahrens. Die Fähigkeit, zu analysieren und festzustellen, C. elegans Nährstoffbedarf wurde durch den Anbau von N2 Wildtyp-Würmer in axenischen flüssigen Medien mit unterschiedlichen Häm-Konzentrationen dargestellt. Dieses Verfahren kann mit anderen Nährstoffen repliziert werden, um die optimale Konzentration für Schnecken Wachstum und Entwicklung zu bestimmen, oder, um die toxikologischen Wirkungen von medizinischen Behandlungen zu bestimmen. Die Auswirkungen von verschiedenen Häm-Konzentrationen auf das Wachstum von Wildtyp-Würmer wurden durch qualitative mikroskopische Beobachtung und Quantifizierung von t bestimmter Anzahl der Würmer, die in jedem Häm-Konzentration wuchs. Zusätzlich kann die Wirkung von verschiedenen Nährstoffkonzentrationen durch Verwendung Würmer, Fluoreszenzsensoren, die auf Änderungen in den Nährstoff von Interesse reagieren auszudrücken getestet werden. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Würmern leicht zur Erzeugung von transgenen C. elegans mittels Mikropartikelbeschuss erzeugt.

Kultivierung C. elegans in flüssigem Medium axenic Hilfsmittel bei der Bestimmung von Nährstoffen, die von Würmern erforderlich sind, ohne Störung durch von E. sekundäre Stoffwechselprodukte coli. Wildtyp N2 Würmer zu akklimatisieren mCeHR Medien innerhalb von drei Generationen und zeigen Wachstum vergleichbar Würmer auf NGM Bakterienplatten gewachsen. In der Tat, diese Würmer geworden schwangeren innerhalb von 4 Tagen im Vergleich zu 3,5 Tage für Würmer auf OP50 Bakterien gewachsen. <p cl...

C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.

Die Züchtung Caenorhabditis elegans In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die maritime Eleganz in CENIC-Flüssigmedien für zahlreiche nachgelagerte Anwendungen einzuführen und zu steigern. Dies wird erreicht, indem zuerst Grabwürmer aus ausgehungerten Agarplatten gebleicht werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die freigesetzten Eizellen mit Antibiotika auf M-C-E-H-R zu übertragen und sie bis zum Stadium der Grabung entwickeln zu lassen, was sieben bis 10 Tage dauern kann.Der dritte Schritt besteht darin, die Gräber zu bleichen und sie ohne zusätzliche Antibiotika ein zweites Mal bis zum Grabstadium entwickeln zu lassen. Der letzte Schritt besteht darin, die Axtwürmer zu synchronisieren und sie für Ernährungsstudien zu verwenden, die das Wachstum und die Entwicklung von Würmern untersuchen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Wildtyp C elegance gut in Axe Flüssigmedien wächst und M-C-E-H-R-Medien verwendet werden können, um die Ernährungsbedürfnisse der Würmer ohne bakterielle Nebenprodukte zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Züchtung von Würmern auf Agarplatten oder in flüssigen Medien mit Bakterien besteht darin, dass die Auswirkungen von Nährstoffen oder Toxinen getestet werden können, ohne bakterielle Nebenprodukte zu verwirren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Medienvorbereitung und der anfänglichen Anpassung der Würmer an die flüssigen EMIC-Medien Schwierigkeiten haben. Dieses Verfahren beschreibt die Herstellung von M-C-E-H-R-A-Flüssigmedien, die es C elegance ermöglichen, ohne eine bakterielle Nahrungsquelle zu wachsen.Mischen Sie die Komponenten des M-C-E-H-R in streng steriler Technik unter einer Haube in der folgenden Reihenfolge. Beginnen Sie mit Cholin, Diacsäurecitrat und folgen Sie mit dem Vitamin- und Wachstumsfaktor. Mischen Sie das Myoacetol, das menschliche Chlorid, und fügen Sie zuletzt DI-Wasser hinzu Filtern Sie das M-C-E-H-R-Gemisch durch einen 0,22-Mikron-Filter mit Absaugung.Fügen Sie als nächstes in der folgenden Reihenfolge die Nukleinsäure hinzu, mischen Sie die Mineralmischung, Milch, Albumin, Hydrolysat, essentielle Aminosäuren, nicht essentielle Aminosäuren, Kaliumphosphat, Deg, Glukosehaufen, Natriumsalz und DI-Wasser. Nun filtrieren Sie das Gemisch erneut mit Absaugung. Geben Sie nach der Filterung Cholesterin in das Medium und überprüfen Sie dann den pH-Wert eines Aliquots des Mediums.Der pH-Wert sollte zwischen sechs und 6,5 liegen. Wenn die Lösung korrekt hergestellt wurde, fügen Sie dem M-C-E-H-R-Medium eine 20%ige Menge der pasteurisierten Milch mit einer gewissenhaften sterilen Technik hinzu. Lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius.Halten Sie 10 60-Millimeter-NGM-Platten voller GR-Würmer bereit, die den größten Teil der verfügbaren OP 50 E coli verzehrt haben. Spülen Sie diese Würmer in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Würmer mit fünf Millilitern M neun Puffer pro Platte absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.Wiederholen Sie dies, spülen Sie noch zwei Mal durch Zugabe von M neun Puffer, lassen Sie die Würmer sich absetzen und entfernen Sie den Überstand, dann fügen Sie dem Wurmaggregat jetzt im Vergleich zur Wurmsuspension sechs Volumen 0,1 normales Natriumchlorid hinzu, bereiten Sie eine Mischung aus einem Volumen von fünf normalen Natriumhydroxid und zwei Volumen frischem Bleichmittel vor. Lösung: Bleichen Sie die Würmer, indem Sie diese Mischung in die Suspension geben. Nächster Vortex, die Mischung so lange, bis sich die Grabwürmer aufgelöst haben und nur noch Eier in der Suspension übrig bleiben.Dies dauert zwischen fünf und 10 Minuten. Verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fach-Objektiv, um diese Reaktion im Röhrchen zu überwachen. Sobald die Eier isoliert sind, pelletieren Sie sie bei 800 g für 45 Sekunden und bei vier Grad Celsius, saugen Sie den Überstand an und spülen Sie das Pellet zweimal in 10 Millilitern sterilem Wasser in der Haube, wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration für diese Spülungen.Anschließend wird das Eipellet mit M-C-E-H-R-Medien resuspendiert und die freigesetzten Eizellen in einen Gewebekulturkolben überführt. Geben Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin zu den Eiern im Kolben. Dieser Schritt sollte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.Mit streng sterilen Techniken werden die Flüssigkulturen in einen 20 Grad Celsius heißen Inkubator überführt und auf einer orbitalen Plattform kultiviert. Schüttler mit 70 U/min überwachen täglich die Entwicklung der Würmer. Nach sieben bis 10 Tagen sollte sich der Wurm zum Ravi-Stadium entwickeln, die Würmer in ein konisches Rohr überführen und bei 800 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor pelletieren.Nach dem Ansaugen des Überstands wird das Wurmpellet in einem Volumen von 0,1 molaren Natriumchlorid resuspendiert und die Würmer fünf Minuten lang auf dem Eis ruhen gelassen. Wiederholen Sie nun den oben erwähnten Bleichvorgang und kultivieren Sie die Eier in den flüssigen Flüssigkeiten. Nach wie vor ist es wichtig, dass bei der Kultivierung der Würmer Verbündete sterile Techniken verwendet werden.Der Verzicht auf den Einsatz von Antibiotika stellt sicher, dass die Sea Elegance-Kulturen tatsächlich frei von kontaminierenden Bakterien sind. Wenn der Kultivierungsprozess nach der Vergangenheit wiederholt wird, gibt die zweite Generation das Tetracyclin aus dem Medium ab. An diesem Punkt können synchronisierte Kulturen für die Synchronisierung vorbereitet werden.Geben Sie 10 Milliliter M nine Puffer zu den Eiern, die nach der Bleiche der GR-Würmer freigesetzt werden, und lassen Sie sie über Nacht bei 20 Grad Celsius auf einer orbitalen Plattform schlüpfen. Schütteln Sie die Larven am nächsten Tag, pelletieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 g und resuspendieren Sie die L 1-Larven. In 10 Millilitern M-C-E-H-R wird die Suspension in einen 25 Quadratzentimeter großen Kolben überführt und auf ihre maximale Dichte gezüchtet.Es ist notwendig, das Wachstum der Würmer alle paar Tage zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Würmer nicht zu überfüllt werden und die verfügbaren Nährstoffe im Medium erschöpft sind. Zur Lagerung einer Axtwurmkultur wird ein Pellet mit Würmern in 0,5 Millilitern S-Puffer in Vorratsfläschchen aufgehängt, ein Volumen S-Puffer mit 30 % Glycerin hinzugefügt. Dann werden die Fläschchen auf minus 80 Grad Celsius gebracht, gefolgt von einer Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff zum Auftauen. Die Würmer inkubieren das Fläschchen bei 37 Grad Celsius, bis fast das gesamte Eis geschmolzen ist, was etwa zwei Minuten dauert.Übertragen Sie sie dann unter sterilen Bedingungen wieder auf M-C-E-H-R-Medien. Ein Vorteil der Verwendung von M-C-E-H-R wurde in Studien gesehen, die den genauen Nährstoffbedarf für die Wurmentwicklung untersuchten. Würmer wurden in M-C-E-H-R gezüchtet, die mit zunehmenden Mengen an Häm ergänzt wurden, um niedrige optimale und toxische Häm-Konzentrationen zu bestimmen.Darüber hinaus wurde ein invers Häm-responsiver Reporterstamm verwendet, um den Häm-Status der Würmer in einem kleineren Konzentrationsbereich indirekt zu beurteilen. Diese Würmer, die an vier mikromolaren Hämen gezüchtet wurden, zeigten eine hohe Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass sich die Würmer in einer Umgebung mit niedrigem Häm-Gehalt befanden. Wenn die Häm-Konzentration auf acht Mikromolaren erhöht wurde, nahm die GFP-Expression ab.Wenn die Häm-Konzentration auf 10 Mikromolar erhöht wurde, zeigten die Würmer eine sehr geringe GFP-Expression und bei 20 Mikromolar Häm zeigten sie keine GFP-Expression. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gewissenhaft sterile Techniken zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Kulturen emisch sind und um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, M-C-E-H-R dazu zu bringen, eine Xenex-Meereseleganzkultur zu etablieren und zu pflegen, die für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann, die eine große Anzahl von Meereseleganz erfordern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

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Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Der genetisch traktierbare Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann als einfaches und kostengünstiges Modell für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von Krebsmedikamenten beschrieben, die die nachgeschaltete Signalübertragung von RAS- und EGFR-Proteinen hemmen.

Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

Entomopathogene Nematoden leben in Symbiose mit Bakterien und zusammen infizieren sie erfolgreich Insekten, indem sie ihr angeborenes Immunsystem untergraben. Um die Erforschung der genetischen Grundlagen der Nematodeninfektion zu fördern, werden Methoden zur Erhaltung und genetischen Manipulation entomopathogener Nematoden beschrieben.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um isolierte einzelne Nematoden auf festen Medien zu kultivieren, um eine lebenslange Verfolgung physiologischer Parameter und eine Fluoreszenzquantifizierung zu ermöglichen. Dieses Kultursystem umfasst eine Palmitinsäurebarriere um einzelne Wurmbrunnen, um die Flucht der Tiere zu verhindern, was den Einsatz aversiver Interventionen, einschließlich pathogener Bakterien und chemischer Stressoren, ermöglicht.

Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen

Erfahren Sie die axenische Kultivierung von Caenorhabditis elegans in CeHR-Flüssigmedien zur Elimination bakterieller Nebenprodukte in Nährstoffstudien. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen des Wurmstoffwechsels.

Die Züchtung Caenorhabditis elegans In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

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