In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.

Ziel dieses Verfahrens ist die Mikroinjektion genetischer Konstrukte in den Hoden der Maus, gefolgt von einer InVivo-Elektroporation. Dies ermöglicht die Durchführung einer umfassenden Genanalyse mit dem Fokus auf Spermatogenese und Hodenfunktion. Dies wird erreicht, indem man zunächst über einen Bauchschnitt direkt über die PrepU-Drüsen Zugang zum Hoden erhält.

Der zweite Schritt besteht darin, den am Hoden befestigten efferentialen Kanal für die Mikroinjektion vorzubereiten, indem das Gefäß aus seinem Fettgewebe gelöst wird. Als nächstes wird der HNO-Kanal mit einer geladenen Mikroinjektionspipette punktiert und die Lösung des genetischen Fleckenkonstrukts wird den ferösen Hodentubuli verabreicht. Der letzte Schritt ist die multilaterale Elektroporationstransfektion des Hodens.

Abschließend wird der transfizierte Hoden nach drei Tagen extrahiert, um die Transfektion durch Fluoreszenzmikroskopie oder durch Luminometermessungen in Abhängigkeit von den verwendeten berichteten Genkonstrukten zu bewerten. Diese Kombination von Mikroinjektions-Intellekt-Operationstechnik für Maushoden als transiente Transfektionsmethode wird sicherlich viele Vorteile gegenüber bestehenden Ansätzen wie transgenen Tieren oder Knockout-Mäusen bieten. Es gewährleistet eine schnelle Leistung, niedrige Kosten und die Notwendigkeit nur mäßiger technischer Fähigkeiten.

Dieser methodische Ansatz könnte hoffentlich die verfügbare Technik im Bereich der männlichen Fertilitätsforschung nutzen. Es könnte wesentlich hilfreich sein, um ein breites Spektrum von Fragen im Zusammenhang mit experimentellen Generika und Fertilitätsprozessen zu beantworten. Dies wäre insbesondere möglich, wenn diese Methode für die genetische Analyse in Form von Experimenten mit Gewinn aller Funktionsverluste verwendet wird.

Vermutlich wird es auch sehr nützlich sein, um regulatorische Elemente von z.B. spermatogenesespezifischen Genen zu untersuchen. Um den Eingriff zu beginnen, betäuben Sie eine sechs bis acht Wochen alte männliche Maus mit einer Eins-zu-Eins-Mischung aus 10 % Ketamin und 2 % Xylazin subkutan. Stellen Sie dann sicher, dass die Maus unter tiefer Narkose steht, indem Sie die Zehen kneifen.

Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Anschließend entfernen Sie die Bauchhaare mit einem Elektrorasierer und desinfizieren anschließend das Operationsgebiet. Machen Sie einen ventralen Schnitt direkt über den PrepU-Drüsen in der Mitte des Bauchbereichs.

Ziehen Sie dazu an der Haut und führen Sie einen kleinen quer verlaufenden Hautschnitt durch. Fahren Sie dann entlang der Bauchmuskelschicht fort. Ziehen Sie die Bauchfettpolster vorsichtig hoch, um den angesetzten Hoden freizulegen, und legen Sie ihn auf ein steriles Papier auf den Bauch.

Sie anschließend ein Stereomikroskop, um den HNO-Kanal für die Mikroinjektion zu finden. Es ist die feine Gefäßverbindung zwischen Hoden und Nebenhoden und befindet sich neben der Hodenarterie. Entfernen Sie das Fettgewebe, das den HNO-Kanal bedeckt, mit einer feinen Pinzette.

Legen Sie danach den Trennduktus auf einen sterilen Papierstreifen, so dass der Duktus gut sichtbar ist, ohne die Umgebung zu beeinträchtigen. Verbinden Sie anschließend die Mikroinjektionspipette, die zuvor mit der farbigen Plasmidlösung beladen wurde, mit der Injektoreinheit des Mikromanipulators. Platzieren Sie danach die Mikroinjektionsnadel parallel zum EENT-Kanal, wobei die Spitze in Richtung REIT-Hoden zeigt.

Verwenden Sie dann eine feine Pinzette, um den Kanal über der Mikroinjektionspipette zu entfernen. Achten Sie darauf, dass die Pipette parallel zum Kanal gehalten wird, während Sie sie überziehen. Richten Sie die Nadel vorsichtig auf den Hoden und stoppen Sie genau in dem Moment, in dem sie in den REIT-Hoden direkt unter der Tunica albuginea eindringt.

Stellen Sie als Nächstes die Parameter des Mikroinjektors ein. Beginnen Sie anschließend mit der Injektion der Genkonstruktlösung. Überwachen Sie den gesamten Injektionsprozess, indem Sie den Füllstatus des Hodens beobachten.

Mit Hilfe der farbigen Plasmidlösung bauen Sie den Hoden nur bis zu zwei Drittel seines Volumens auf. Um eine effektive Elektroporation zu ermöglichen. Tränken Sie die Pinzettenelektroden einmal in PBS, um einen ausreichenden Leitwert zu gewährleisten.

Drücken Sie dann den Test leicht zwischen die nassen Elektroden und messen Sie den elektrischen Widerstand mit dem Elektroparata. Stellen Sie als nächstes den Elektro entsprechend ein, um sicherzustellen, dass Strom mit einer Gesamtzahl von acht Quadratimpulsen an den Hoden angelegt werden kann. Führen Sie die Elektroporation an vier verschiedenen Hodenstellen umfassend um den gesamten Hoden durch.

Nachdem die Elektroporation abgeschlossen ist, legen Sie den Hoden so nah wie möglich an seiner ursprünglichen Position wieder in den Bauch. Die innere Muskelschicht war also ein resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial. Dann verschließen Sie die Haut mit Nahtklammern.

Lassen Sie die Maus sich von der Narkose erholen. In einer sterilen Box, die auf einem 37 Grad Celsius warmen Wärmekissen erwärmt und mit einigen Papiertüchern vorbereitet wurde. Das Pad sollte sicherstellen, dass nur eine Hälfte des Käfigs erwärmt wird, wodurch ein Wärmegradient entsteht.

Decken Sie die Maus zusätzlich mit einem weiteren Blatt Papiertuch ab, um den Stress weiter zu reduzieren. Nachdem das Tier vollständig aufgewacht ist, setzen Sie es in einen neuen, sauberen, komplett ausgestatteten Käfig um. Aber weitere Genesung, überwachen Sie den Wiederherstellungsprozess, bis Sie die Maus schließlich an die Tiereinrichtung zurückgeben.

Diese Abbildung zeigt die gesamten Mount-Hoden drei Tage nach in vivo Elektroporation durch Fluoreszenzdetektion, die transfizierten Hoden einer C 57 schwarzen sechs Mausen zeigen ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein oder ein rot fluoreszierendes Protein. Hier sind die histologischen Schnitte eines Hodens. Drei Tage nach der einseitigen Elektroporation mit PE eeg, FPC one sind die transfizierten Samenröhrenzellen mit ihrer typischen kugelförmig organisierten Struktur durch grüne Fluoreszenz dargestellt.

Ihre Kerne wurden mit zwei pro drei in Blau gegengefärbt. Bei der Durchführung dieses Eingriffs ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Prozesse zur Identifizierung des HNO-Kanals und zur Freisetzung seines Fettgewebes sehr anspruchsvoll sind. Daher können Sie zuerst an toten Tieren üben, bevor Sie echte in vivo-Erfahrungen machen.

Nach dem Anti-Procing der Mikroinjektions-Elektroporation und der abschließenden Testernte können viele Techniken wie Q-R-T-P-C-R ship und Western Blotting durchgeführt werden. Daher ist die Xinierung von Tester-Genen sowohl bei Proteinexpressionsmustern als auch bei posttranslationalen Modifikationen selbstverständlich. Mit Hilfe dieser Werkzeuge kann also eine Vielzahl von Themen angegriffen werden, wie zum Beispiel die Spermatogenese mit ihren zugrunde liegenden komplexen Mechanismen und Regulationsmechanismen.