Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung von Lymphknotenstromazellen. Dazu wird zunächst die Lymphknotenkapsel aufgerissen. Im zweiten Schritt werden die Lymphknotenfragmente mit Kollagenase vier und D nase eins verdaut.

Die Enzyme werden dann durch Kollagenase D und D nase eins ersetzt, und die Fragmente werden mit einer automatisierten Mehrkanalpipette mechanisch disaggregiert. Letztendlich kann die Expression der Zelloberflächenmoleküle der isolierten Lymphknotenzellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode besteht darin, dass bei dieser Methode die Lymphknoten-SHR-Zellen mit einem standardisierten enzymatischen Verfahren verdaut werden, das durch eine mechanische Disaggregation ergänzt wird, die die Lebensfähigkeit und Oberflächenmolekülexpression der Zellen bewahrt

Beginnen Sie damit, die präparierten Lymphknoten in eine sterile Petrischale zu legen, die zwei Milliliter eiskaltes Medium enthält. Verwenden Sie dann zwei Ein-Milliliter-Spritzen, die mit 25-Gauge-Nadeln ausgestattet sind, um die Lymphknotenkapseln aufzubrechen. Als nächstes wird das zerstörte Gewebe in ein konisches Fünf-Milliliter-Röhrchen mit 750 Mikrolitern Medium überführt, ergänzt mit Kollagenase vier und DNA eins und einem magnetischen Rühr.

Legen Sie dann das Röhrchen in ein Becherglas mit vorgewärmtem 37 Grad Celsius heißem Wasser auf einen Magnetrührer und rühren Sie die Zellschlämme 30 Minuten lang mit einer Runde pro Sekunde um. Lassen Sie nach dem Rühren das Lymphknotenfragment absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Angereichert mit nicht-stromalen Zellen werden nun 750 Mikroliter frisches Medium, ergänzt mit Kollagenase D und D, auf die Lymphknotenfragmente übertragen und dann das Gewebe weitere fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius gerührt.

Verwenden Sie anschließend eine automatisierte Mehrkanalpipette, um die Lymphknotengewebefragmente in einem Volumen von 700 Mikrolitern für 10 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit zu disaggregieren, und rühren Sie die Gewebefragmente nach 10 Minuten erneut um. Darüber hinaus können Sie die Gewebeklumpen mit der automatisierten Mehrkanalpipette für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit disaggregieren. Geben Sie dann 7,5 Mikroliter 0,5 molare EDTA in das Röhrchen und mischen Sie die Gewebesuspension für weitere 99 Zyklen mit der automatisierten Pipette.

Nach dem letzten Disaggregationszyklus geben Sie 750 Mikroliter Medium in die Zelllösung und filtrieren die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Nylonnetz. Pelletieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 1500 G und vier Grad Celsius. Um Lymphknotenstromazellpopulationen durch Durchflusszytometrie sichtbar zu machen, färben Sie die entsprechenden Zellproben mit einem Lebendtot-Tracker und den Antikörpern von Interesse in 100 Mikrolitern HBSS, die 2 %FCS enthalten, für mindestens 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Anschließend werden die Zellen in 500 Mikrolitern HBSS mit FCS gewaschen und resuspendiert. Die Pellets in 100 Mikrolitern HBSS und FCS lassen die Zellen auf einem Durchflusszytometer laufen, wobei die CD 45-positiven Zellen ausgeschaltet werden, um die hämatopoetischen Zellen auszuschließen, und gehen dann auf die lebende Singulett-Population. Zum Schluss stellen Sie GP 38 im Vergleich zu CD 31 auf, um die retikulären Zellen der T-Zone, die lymphatischen Endothelzellen, die Endothelzellen des Blutes und die doppelt negativen Zellen zu visualisieren.

Zellpopulationen. Die Gesamtzellzahl, die nach der Verdauung der Lymphknotenstromazell-Untergruppen wiedergewonnen wurde, war in dem gerade demonstrierten Protokoll etwas höher als in den Link- und Fletcher-Protokollen, was zeigt, dass die Lebensfähigkeit der Lymphknotenstromazellen nach der Isolierung durch dieses Protokoll ähnlich ist wie bei der Wiederherstellung unter Verwendung veröffentlichter Protokolle. Retikuläre Zellen der T-Zone und lymphatische Endothelzellen, die über diese isoliert wurden, und die Link- und Fletcher-Protokolle wurden für die Expression von IAB, CD eins 40, CD 80, PD L eins und CD 40 verglichen.

Die Expression aller fünf Oberflächenmoleküle war bei der Verdauung mit dem gerade demonstrierten Protokoll und dem Link-Protokoll für beide Stromazell-Untergruppen höher, was darauf hindeutet, dass der Abbau einiger Oberflächenmoleküle durch Kollagenase vier und D weniger robust ist als mit Kollagenase p und DYS-Raum. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die vier Hauptsubpopulationen von Lymphknotenstromazellen erfolgreich isolieren und gleichzeitig die Expression mehrerer Oberflächenmoleküle beibehalten können, die für ihre weitere Charakterisierung und Analyse nützlich sind.