Name: Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung muriner Lymphknoten-Stromazellen durch enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation. Diese Methode bewahrt Zellviabilität und Oberflächenmarker für immunologische Studien.

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Die Autoren danken Sanjiv Luther und Kollegen für hilfreiche Diskussionen bei der Erstellung des aktuellen Lymphknotenverdauungsprotokolls. Diese Arbeit wurde durch SNF-Zuschüsse PPOOA-_119204 und PPOOP3_144918 an S.W.R. unterstützt.

In diesem Video-Veröffentlichung und Protokoll wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit der von der kantonalen Behörde Basel-Stadt, Schweiz zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt. 1. Lymphknoten Vorbereitung und Verdauung <ol><li> Pre-Wärme-Wasser in einem Becher auf 37 ° C auf einem Magnetrührer mit Heizplatte. </li><li> Bereiten Basis Medium wie folgt: DMEM-Medium (ohne Pyruvat) mit 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 und Pen / Strep (100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin). </li><li> Sterilisieren alle Dissektionsinstrumente vor dem Gebrauch. </li><li> Einschläfern Lymphknoten Spendermäusen pro CO 2 Ersticken und aseptisch sezieren die Lymphknoten. Sezieren nicht die umgebende Fett. HINWEIS: Dieses Protokoll wird für periphere Haut-Lymphknoten (Leisten, brachial, Achsel) optimiert. </li><li> Platzieren Lymphknoten in einer sterilen Petrischale mit 2 ml eiskaltem basischen Medium. </li><li> Stören den Lymphknoten capsule mit zwei 25-G-Nadeln von 1-ml-Spritze befestigt. </li><li> Übertragen des unterbrochenen Lymphknotengewebe in einem 5 ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen mit 750 ul basischen Medium mit 1 mg / ml Collagenase IV und 40 ug / ml DNAse I ergänzt </li><li> Fügen Sie einen sterilen Magnetrührer in jeder Röhre. </li><li> Das Röhrchen in das Becherglas mit 37 ° C vorgewärmt Wasser und rühren die Rohre mit einer langsamen Geschwindigkeit (1 Runde / sec) für 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch vom Magnetrührer mit Heizplatte und lassen Lymphknotenfragmente zu begleichen. </li><li> Den Überstand in &quot;nicht-Stromazellen&quot; angereichert vorsichtig entfernen. HINWEIS: Wenn die Analyse der T, B, dendritischen Zellen und CD45 - gp38 - CD31 - vorgesehen ist, speichern Sie die &quot;nicht-Stromazellen&quot; Fraktion. </li><li> Wasch übrigen Lymphknotengewebe einmal mit 750 ul Basismedium. Hinweis: Dieser Schritt nur erforderlich, wenn die Arbeit mit immunkompetenten Mäusen. </li><li> Lassen Lymphknotenfragmente zu begleichen. </li><li> Entfernen Sie dieNicht-Stromazellen-Schwimmfraktion. </li><li> In den Lymphknoten-Fragmente 750 ul basischen Medium mit 3,5 mg ergänzt / ml Collagenase D und 40 ug / ml DNase I </li><li> Ort Rohr zurück in den Becher mit dem 37 ° C vorgewärmt Wasser. </li><li> Verdauen Lymphknotengewebe für 5 min, während langsam umrühren. </li><li> Disaggregierten Lymphknotengewebefragmente durch Pipettieren und Mischen 700 ul für 10 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit mit Hilfe eines automatisierten Mehrkanalpipette. HINWEIS: Dies stört Lymphknotengewebe, um die Verdauung zu verbessern. </li><li> Das Röhrchen zurück in das Becherglas mit 37 ° C vorgewärmte Wasser. </li><li> Digest Lymphknotengewebefragmente für weitere 10 min unter langsamem Rühren. </li><li> Disaggregate Lymphknotengewebefragmente durch Pipettieren und Mischen für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit mit Hilfe eines automatisierten Mehrkanalpipette. </li><li> Fügen 7,5 ul 0,5 M EDTA zur Aufrechterhaltung Einzelzellsuspension zu gewährleisten. </li><li> Disaggregierten Lymphknotengewebefragmente von RohrArmatur und Mischen für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit unter Verwendung eines automatisierten Mehrkanalpipette. </li><li> Fügen Sie 750 ul Basismedium und übergeben Zellen durch eine 70 um Nylon-Mesh. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension 5 min bei 1.500 × g, 4 ° C beträgt. </li><li> Stromazellen können nun für die weitere Analyse verwendet werden. </li></ol> 2. Die Färbung der Lymphknoten Stromazellen <ol><li> Verwenden Sie eine Kombination von Anti-CD45, Anti-podoplanin (gp38), Anti-CD31-Antikörper gegen TRC, LEC, BEC und DN Zellen erfolgreich zu erkennen. </li><li> Inkubieren der verdauten Lymphknotengewebe mit Live / Dead-Tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), Anti-CD31-APC (1: 200) in 100 ul HBSS, enthaltend 2 % FCS für mindestens 20 min, 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Zellen, indem 500 l HBSS, enthaltend 2% FCS </li><li> Zentrifuge Zellsuspension 3 Minuten bei 1500 × g, 4 ° C beträgt. </li><li> Resuspendieren in 100 ul HBSS, enthaltend 2% FCS. </li><li> Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer equipped mit folgenden Optik: Anregungsquelle mit bis zu drei Laser: blau (488 nm, luftgekühlt, 20 mW Festkörper), Rot (633 nm, 17 mW HeNe) und Violett (405 nm, 30 mW Festkörper) . </li><li> Tor CD45 - Zellen, die blutbildenden Zellen aus. </li><li> Tor Slips (FSC-W) und lebenden Zellen (LIVE / DEAD-Tracker), um Dubletten und tote Zellen auszuschließen. </li><li> , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) und DN (gp38 - CD31 - Zellen) (siehe Abbildung 1) - Inhalts gp38 gegen CD31 zu TRC (gp38 + CD31) zu visualisieren. </li></ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
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<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Studie von Lymphknoten Stromazellen vor kurzem wurde ein Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung von zwei Protokolle veröffentlicht Verdauung 6,13. Beide Protokolle angemessen sind, um einzelne Lymphknoten Stromazellen zu erhalten, unterscheiden sich jedoch in der Verwendung von Verdauungsenzymen und dem Zeitpunkt der Verdauung. Da Stromazellen und ihre Oberflächenmarker empfindlich enzymatischen Verdau und mechanischer Belastung sind, wird ein optimiertes Protokoll erforderlich. <p class="jove_cont...

Lymphknoten sind spezialisierte Fächer, wo adaptiven Immunantwort gegen fremde und Selbst-Antigene initiiert und koordiniert. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt eine kurze enzymatische Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Pipettieren Lymphknoten Einzelzellsuspension zu erhalten und Zugang zu lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen, die die Oberflächenexpression von mehreren Molekülen zu erhalten. Lymphknoten Stromazellen bilden das Gerüst des Lymphknotens und erfüllen drei wichtige Funktionen: sie filtern ersten Körperflüssigkeiten, Antigene, Krankheitserreger und ihre Erregermuster (PAMPs) sowie Zytokine und Gefahr assoziierte molekulare Muster zu probieren (gedämpft) vorhanden im Körper. Zweitens, sie ziehen und weisen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Lymphozyten zu interagieren und zu initiieren adaptive Immunantworten; und die dritte, bieten sie eine strukturelle Umgebung für die Homöostase und Differenzierung von Lymphozyten 1-3. Während der Entzündung Lymphknoten Stromazellen produzieren Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine, die Anpassung an Schwellungen damit die Organisation der Interaktion zwischen dendritischen Zellen (DCs), T-und B-Zellen. Die Instrumentation von Immunantworten ist aufgrund der komplexen Strukturarchitektur von unterschiedlichen stromalen Zellpopulationen gebildet möglich. Lymphknoten Stromazellen CD45-negativen Zellen und kann durch die Expression von CD31 und gp38 in Fibroblasten und Endothelzellen 1 -6 unterscheiden. Gp38 + CD31 - T-Zone definiert Retikulumzellen (TRC, die auch als FRC bekannt: fibroblastischen Retikulumzellen), gp38 + CD31 + definiert lymphatischen Endothelzellen (LEC), gp38 - CD31 + definiert Blut Endothelzellen (BEC). Weitere Charakterisierung von Subpopulationen zeigte die Existenz von anderen Lymphknoten Stromazellen. In der Tat wurde eine kleine pericyte artigen Zellpopulation innerhalb der gekennzeichnetgp38 - CD31 - Population 7. Daher ist die Anpassung des Isolationsverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften von verschiedenen Lymphknoten Stromazellen vorteilhaft. Vor der Entwicklung von Lymphknoten Stromazellen Verdauung Protokolle die Untersuchung von Lymphknoten Stromazellen wurde in situ Beobachtungen mit Gewebeabschnitt und Mikroskopie beschränkt. Dennoch zeigte strukturelle und funktionelle Untersuchungen wichtige Eigenschaften von Lymphknoten Stromazellen. Lymphknoten Stromazellen mit podoplanin, Kollagen und extrazellulärer Matrix (ECM) Proteinen verbunden, um eine komplexe dreidimensionale Struktur 3 genannte Leitungssystem, die Lymphe und assoziierten-niedermolekulare Proteine ​​auf die hohe endotheliale Transporte vom subkapsuläre Sinus des Lymphknotens bilden Venolen in der T-Zellen-Zone 8. DCs sind in engem Kontakt mit Stroma-Zellen und in das rohrförmige con vorstehenden beachtenDuit Struktur zu Probenflüssigkeit und erkennen Antigene 8. Die Wechselwirkung von Lymphknoten Stromazellen (TRCs und LECs) mit DCs ist durch die Freisetzung und Präsentation von Chemokinen CCL21 und CCL19 9,10 vermittelt. CCL19 und CCL21 werden von der CCR7 Rezeptor erleichtert DCs und T-Zellen zu den Lymphknoten T-Zell-Zone 4,11 migrieren anerkannt. Trotz Verwendung ähnlicher Chemokine DCs und T-Zellen haben unterschiedliche Wanderungs in die Lymphknoten 12. Später mittels enzymatischer Verdauung der Lymphknoten und Isolierung von reinem Lymphknoten Stromazellen, funktionelle Studien über die Rolle der verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ihre Fähigkeit, mit DCs und T / B-Zellen interagieren 6,13 durchgeführt. Zuerst wird das Übersprechen zwischen IFN-γ produzierenden T-Effektorzellen und Lymphknoten Stromazellen induziert die Produktion der gezeigten T-Zell-Antworten und die Proliferation in den sekundären lymphoiden Organen 14-16 dämpfen Metaboliten Stickoxid. Zweiten, Lymphe node Stromazellen wurde berichtet, dass die Differenzierung der DC regulatorischen Untergruppen über die Produktion von IL-10-17 zu unterstützen und naiven T-Zell-Homöostase durch die Produktion von IL-7 6,18 modulieren. Drittens TLR-Expression in Lymphknoten stromalen Zellen legt nahe, dass Stromazellen sind anfällig für eine Infektion oder selbst Moleküle während Gewebeverletzung freigesetzt abgeleiteten Signals. Tatsächlich ist die Behandlung von Lymphknoten Stromazellen mit dem Liganden von TLR3 Poly (I: C) induziert eine geringe Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Expression und die Hochregulation von Co-inhibitorische Molekül PD-L1, jedoch nicht von kostimulatorischen Molekülen, was zu dramatische Veränderungen im peripheren Gewebe-Antigene Ausdruck 19. Mehrere Gruppen haben gezeigt, Lymphknoten Stromazellen exprimieren peripheren Gewebe-Antigene und induzieren Toleranz von selbstreaktiven T-Zellen 19,21-27. Daher, das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Lymphknoten Stromazellen und die andere Zugvögel und Wiedersident Lymphknotenzellen werden dabei helfen, neue Zielmoleküle zur Aktivierung oder Unterdrückung von Immunreaktionen während der Entzündung ermöglichen zu finden. Daher wird die Umsetzung der veröffentlichten enzymatische Trennung des Lymphknotens erforderlich. Zuvor veröffentlichten Protokolle verwenden verschiedene Kombinationen von Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung mit geringer mechanischer Belastung 6,19,20. Allerdings könnte lange Inkubationen mit Verdauungsenzymen oder andere Kombination von verschiedenen Enzym die Verdauung benötigt, um den Aktivierungsstatus zu analysieren und neue Lymphknoten Stromazellen identifizieren Oberflächenmoleküle abzubauen. Abhängig von der Art der stromalen Zellanalyse, kann die Link-Protocol-Protokoll oder Fletcher besser geeignet sein. Bei dem beschriebenen Verfahren wird eine etwas kürzere enzymatischen Verdau mit automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um Oberflächenmarker Abbau von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen minimieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht hoch reproduzierbare Isolation undUnterscheidung von Lymphknoten Stroma-Zellpopulationen mit geringer Variabilität und mehr als 95% Lebensfähigkeit. Die frisch isolierten Lymphknoten Stromazellen können direkt für Oberflächenmarker-Expression, Proteinanalyse und Transkriptionsstudien sowie Errichtung Stromazellen Leitungen verwendet, um funktionelle Assays in vitro durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Endkonzentration 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>Endkonzentration 1,2 mM</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>>160 Einheiten pro mg Trockengewicht, bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml</td></tr><tr><td>verwenden Kollagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>Anwendung mit 3,5 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11284932001</td><td>Einsatz bei 40 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Rührmagnete</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm lang-2 mm &oslash;</td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenröhrchen 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer mit Heizfunktion</td><td>IKA-RCT-Standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 100 mm, steril</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 G Nadeln</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti Maus CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti Maus CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti Maus Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>Anti Maus CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, Multichannel</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &micro; l max. Volumen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>Anti-Maus I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Nah-IR-Färbeset für tote Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von murinen lymphknoten stromazellen

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Sekundäre lymphatische Organe einschließlich Lymphknoten bestehen aus Stromazellen, die eine strukturelle Umgebung für die Homöostase, Aktivierung und Differenzierung von Lymphozyten bieten. Verschiedene Untergruppen von Stromazellen wurden durch die Expression des Adhäsionsmoleküls CD31 und des Glykoproteins Podoplanin (gp38), retikuläre Zellen der T-Zone oder fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische Endothelzellen, Blutendothelzellen und FRC-ähnliche Perizyten innerhalb der doppelt negativen Zellpopulation identifiziert. Für alle Populationen werden unterschiedliche Funktionen beschrieben, darunter die Trennung und Auskleidung verschiedener Kompartimente, die Anziehung und Interaktion mit verschiedenen Zelltypen, die Filtration der drainierenden Fluidik und die Kontraktion der Lymphgefäße. In den letzten Jahren haben verschiedene Gruppen eine zusätzliche Rolle von Stromazellen bei der Orchestrierung und Regulierung zytotoxischer T-Zell-Antworten beschrieben, die für den Wirt potenziell gefährlich sind. 
Lymphknoten sind komplexe Strukturen mit vielen verschiedenen Zelltypen und erfordern daher ein geeignetes Verfahren zur Isolierung der gewünschten Zellpopulationen. Derzeit beruhen Protokolle für die Isolierung von Lymphknotenstromazellen auf enzymatischer Verdauung mit unterschiedlichen Inkubationszeiten; Stromazellen und ihre Oberflächenmoleküle reagieren jedoch empfindlich auf diese Enzyme, was zu einem Verlust der Oberflächenmarkerexpression und zum Zelltod führt. Hier wird ein kurzes enzymatisches Verdauungsprotokoll in Kombination mit einer automatisierten mechanischen Unterbrechung vorgeschlagen, um lebensfähige Einzelzellsuspensionen von Lymphknotenstromazellen unter Beibehaltung ihrer Oberflächenmolekülexpression zu erhalten.

Das vorliegende Protokoll ist ein von Link-et al., 2007 6 mit einer kürzeren Kochzeit (45 min maximal) durch mechanische Disaggregation mit einem automatisierten Mehrkanalpipette veröffentlicht modifizierten Verdauung Protokoll. Darüber hinaus ist das Verfahren eher standardisierte minimiert Abbau von Oberflächenmarkern auf verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ermöglicht die Behandlung von mehr als einer Probe gleichzeitig. Kollagenase IV und Collagenase D Links-Pro...

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung von Lymphknotenstromazellen. Dazu wird zunächst die Lymphknotenkapsel aufgerissen. Im zweiten Schritt werden die Lymphknotenfragmente mit Kollagenase vier und D nase eins verdaut.Die Enzyme werden dann durch Kollagenase D und D nase eins ersetzt, und die Fragmente werden mit einer automatisierten Mehrkanalpipette mechanisch disaggregiert. Letztendlich kann die Expression der Zelloberflächenmoleküle der isolierten Lymphknotenzellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode besteht darin, dass bei dieser Methode die Lymphknoten-SHR-Zellen mit einem standardisierten enzymatischen Verfahren verdaut werden, das durch eine mechanische Disaggregation ergänzt wird, die die Lebensfähigkeit und Oberflächenmolekülexpression der Zellen bewahrt.Beginnen Sie damit, die präparierten Lymphknoten in eine sterile Petrischale zu legen, die zwei Milliliter eiskaltes Medium enthält. Verwenden Sie dann zwei Ein-Milliliter-Spritzen, die mit 25-Gauge-Nadeln ausgestattet sind, um die Lymphknotenkapseln aufzubrechen. Als nächstes wird das zerstörte Gewebe in ein konisches Fünf-Milliliter-Röhrchen mit 750 Mikrolitern Medium überführt, ergänzt mit Kollagenase vier und DNA eins und einem magnetischen Rühr.Legen Sie dann das Röhrchen in ein Becherglas mit vorgewärmtem 37 Grad Celsius heißem Wasser auf einen Magnetrührer und rühren Sie die Zellschlämme 30 Minuten lang mit einer Runde pro Sekunde um. Lassen Sie nach dem Rühren das Lymphknotenfragment absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Angereichert mit nicht-stromalen Zellen werden nun 750 Mikroliter frisches Medium, ergänzt mit Kollagenase D und D, auf die Lymphknotenfragmente übertragen und dann das Gewebe weitere fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius gerührt.Verwenden Sie anschließend eine automatisierte Mehrkanalpipette, um die Lymphknotengewebefragmente in einem Volumen von 700 Mikrolitern für 10 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit zu disaggregieren, und rühren Sie die Gewebefragmente nach 10 Minuten erneut um. Darüber hinaus können Sie die Gewebeklumpen mit der automatisierten Mehrkanalpipette für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit disaggregieren. Geben Sie dann 7,5 Mikroliter 0,5 molare EDTA in das Röhrchen und mischen Sie die Gewebesuspension für weitere 99 Zyklen mit der automatisierten Pipette.Nach dem letzten Disaggregationszyklus geben Sie 750 Mikroliter Medium in die Zelllösung und filtrieren die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Nylonnetz. Pelletieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 1500 G und vier Grad Celsius. Um Lymphknotenstromazellpopulationen durch Durchflusszytometrie sichtbar zu machen, färben Sie die entsprechenden Zellproben mit einem Lebendtot-Tracker und den Antikörpern von Interesse in 100 Mikrolitern HBSS, die 2 %FCS enthalten, für mindestens 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Anschließend werden die Zellen in 500 Mikrolitern HBSS mit FCS gewaschen und resuspendiert. Die Pellets in 100 Mikrolitern HBSS und FCS lassen die Zellen auf einem Durchflusszytometer laufen, wobei die CD 45-positiven Zellen ausgeschaltet werden, um die hämatopoetischen Zellen auszuschließen, und gehen dann auf die lebende Singulett-Population. Zum Schluss stellen Sie GP 38 im Vergleich zu CD 31 auf, um die retikulären Zellen der T-Zone, die lymphatischen Endothelzellen, die Endothelzellen des Blutes und die doppelt negativen Zellen zu visualisieren.Zellpopulationen. Die Gesamtzellzahl, die nach der Verdauung der Lymphknotenstromazell-Untergruppen wiedergewonnen wurde, war in dem gerade demonstrierten Protokoll etwas höher als in den Link- und Fletcher-Protokollen, was zeigt, dass die Lebensfähigkeit der Lymphknotenstromazellen nach der Isolierung durch dieses Protokoll ähnlich ist wie bei der Wiederherstellung unter Verwendung veröffentlichter Protokolle. Retikuläre Zellen der T-Zone und lymphatische Endothelzellen, die über diese isoliert wurden, und die Link- und Fletcher-Protokolle wurden für die Expression von IAB, CD eins 40, CD 80, PD L eins und CD 40 verglichen.Die Expression aller fünf Oberflächenmoleküle war bei der Verdauung mit dem gerade demonstrierten Protokoll und dem Link-Protokoll für beide Stromazell-Untergruppen höher, was darauf hindeutet, dass der Abbau einiger Oberflächenmoleküle durch Kollagenase vier und D weniger robust ist als mit Kollagenase p und DYS-Raum. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die vier Hauptsubpopulationen von Lymphknotenstromazellen erfolgreich isolieren und gleichzeitig die Expression mehrerer Oberflächenmoleküle beibehalten können, die für ihre weitere Charakterisierung und Analyse nützlich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen...

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Die Erzeugung von Lymphknoten-/Fettpolster-Chimären zur Untersuchung des Ursprungs von Lymphknotenstromazellen wird beschrieben. Die Methode umfasst die Isolierung von Lymphknoten aus neugeborenen Mäusen und embryonalen Fettpolstern, die Erzeugung von chimären Lymphknoten-Fettpolstern und deren Übertragung unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Dieses Protokoll beschreibt ein Überlebensverfahren für eine sichere und gut verträgliche musinare mesenterine lymphadenektomyat an jeder der vier Stationen entlang der mesenterischen Lymphknotenkette. Dieses Verfahren ist anpassungsfähig, um eine selektive Unterbrechung der lymphatischen Kommunikation mit dem distalen Dickdarm, dem proximalen Dickdarm und/oder dem Dünndarm zu ermöglichen.

Maus-mesenteriale Lymphadenektomie zur selektiven Störung der lymphatischen Kommunikation mit dem regionsspezifischen Darm

Erfahren Sie die Isolierung muriner Lymphknoten-Stromazellen durch enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation. Diese Methode bewahrt Zellviabilität und Oberflächenmarker für immunologische Studien.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

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