Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik einzelner Clathrin-beschichteter Gruben in lebenden Zellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszenzmarkierte Endozytät- und Frachtproteine in eine Adhärenzzelllinie transektiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen mit Totalreflexion, Fluoreszenz- oder Rasenmikroskopie abzubilden.

Die Lebensdauern kleiner Sätze von Clathrin-beschichteten Gruben werden dann manuell mit einem Bildverarbeitungs- und Analyseprogramm quantifiziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Lebensdauer von Clathrin-beschichteten Gruben durch objektive automatisierte Detektion und Analyse zu quantifizieren. Letztendlich wird die Rasenmikroskopie verwendet, um die Dynamik einzelner Clathrin-beschichteter Gruben mit Einzelereignisauflösung zu quantifizieren, um die Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu untersuchen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Membrantransports zu beantworten, z. B. wie sich der Aufbau und die Dynamik der Endozytose basierend auf den verschiedenen vorhandenen endozytären Proteinen und Frachtproteinen ändern können. Zu Beginn der Transfektion von HEC 2 93 Zellen mit Plasmiden, die für Tag-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder GPCRs und/oder Komponenten der Claro-Maschinerie kodieren. In einer 12-Well-Platte, wie im Textprotokoll beschrieben, fügen Sie am Tag nach der Transfektion 0,5 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS mit jeweils einem millimolaren EDTA hinzu.

Nun, dann legen Sie drei Patronen sterile 25-Millimeter-Abdeckfolien in separate Vertiefungen von sechs Stück. Well-Platte Füllen Sie jede Vertiefung mit zwei Millilitern Medium. Schieben Sie den Abdeckbezug vorsichtig auf den Boden der Vertiefung, um zu verhindern, dass Zellen an der Unterseite des Abdeckschirms wachsen.

Bewegen Sie als Nächstes manuell eine Vertiefung der 12-Well-Platte, um die Zellen vom Boden der Vertiefung abzuheben. Fügen Sie einen Milliliter DM EM mit 10 % FBS hinzu, um es erneut zu senden. Verteilen Sie dann die angehobenen Zellen aus einer Vertiefung gleichmäßig auf die drei Abdeckplatten.

Lassen Sie die Zellen vor der Bildgebung mindestens 48 Stunden lang auf den Deckgläsern wachsen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen ausgebreitet und flach sind, um die Dynamik der mit Clathrin-beschichteten Grube und Ladung abzubilden. Zuerst werden die Zellen mit Antikörpern vorinkubiert, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie dann die Übertragung des Deckglases in eine Bildgebungskammer für lebende Zellen vor, indem Sie eine Pinzette und eine 25-Gauge-Nadel verwenden, die an der Spitze zu einem Haken gebogen sind. Halten Sie die Pinzette in der dominanten Hand. Halten Sie die verbogene Nadel in der anderen.

Drehen Sie die Nadel, bis sich der Haken nach unten in Richtung Glas wölbt. Ziehen Sie den Nadelhaken vorsichtig mit der Seite nach unten über den Boden einer Platte mit sechs Vertiefungen, bis er sich in den Deckglas einhakt. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Deckglases nicht zu zerkratzen, da sich dadurch Zellen ablösen.

Heben Sie den Deckel vorsichtig vom Boden der Vertiefung nach oben. Balancieren Sie den Deckslip zur Unterstützung an der Wand des Schachts. Fassen Sie mit der Pinzette in der Nähe des Randes des Deckglases und bewegen Sie die Seite der Deckglaszelle nach oben zur Bildgebungskammer.

Bauen Sie die Kammer zusammen und fügen Sie 700 Mikroliter vorwarmes Bildgebungsmedium hinzu. Nachdem Sie die Kammer auf das Mikroskop übertragen haben, bringen Sie die Zellen mit einem Rasenöl-Immersionsobjektiv in den Fokus, indem Sie die Zellen im herkömmlichen Epi-, Fluoreszenz- oder konfokalen Beleuchtungsmodus abbilden, um Zellen zu identifizieren, die die entsprechenden Konstrukte exprimieren, was eine wichtige Sicherheitsvorkehrung darstellt. Achten Sie immer auf den Winkel des Laserstrahls und richten Sie ihn immer vom Betrachter weg.

Fokussieren Sie sich dann auf die untere Oberfläche einer exprimierenden Zelle, bis der Umriss der Plasmamembran um die Zelle verschwindet und die untere Oberfläche der Zelle erscheint. Am deutlichsten ist dies bei einem in der Plasmamembran lokalisierten Frachtprotein wie dem mu-Opioid-Rezeptor. Wenn die gleichen Laser für die Bildgebung bei konventioneller Epi-Fluoreszenz verwendet werden, erhöhen Sie den Einfallswinkel des Lasers bis zur Unschärfe.

Die Fluoreszenz im Inneren der Zelle verschwindet und es ist kein Umriss der Plasmamembran um die Zelle herum zu sehen. Sobald Sie sich im Rasen m befinden, stellen Sie sicher, dass der Anregungslaser durch das Objektiv zurückreflektiert wird und nicht über dem Objektiv sichtbar ist. Indem Sie prüfen, ob der Laserpunkt sichtbar ist, verfeinern Sie den Fokus, um ein gestochen scharfes Bild zu erhalten.

Sobald die Zellen identifiziert sind, nehmen Sie 10 Minuten lang mindestens alle drei Sekunden Bilder auf. Wiederholen Sie alle Schritte, um weitere Zellen abzubilden. Um mit der Analyse der endozytären Dynamik zu beginnen, öffnen Sie die Datei im Bild J. Bilder werden als ein einziger Stapel von TIFF-Dateien gespeichert.

Mit Zwischenblattkanälen. Konvertieren Sie die Bilder in Hyper-Stapel, indem Sie im Popup-Fenster Bild-Hyper-Stapel und Stapel in Hyper-Stapel auswählen. Geben Sie die Anzahl der erworbenen Kanäle ein.

Geben Sie einen für Zack ein und geben Sie die Anzahl der Filmbilder ein. Das Hyper-Stack-Format ergibt ein Fenster mit zwei Bildlaufleisten. Verwenden Sie die obere Leiste, um durch die Kanäle zu navigieren, und die untere Leiste, um durch die Zeit zu navigieren.

Scrollen Sie zum Kanal des Proteins, dessen Lebensdauer getestet wird. Gehen Sie über das erste Bild des Films hinaus, um die Einbeziehung bereits vorhandener Clathrin-beschichteter Gruben oder CCPs zu reduzieren, deren gesamte Dauer nicht sichtbar ist. Zeichnen Sie einen Bereich von Interesse oder ROI um einen zufällig ausgewählten Ort.

Zählen Sie die Anzahl der Frames, für die ein Spot sichtbar ist. Um die Analyse mit der Objekterkennung zu starten, öffnen Sie die Rohbilddatei in der Bildanalysesoftware, die standardmäßig entstanden ist. Farbbild wird angezeigt.

Verwenden Sie das Anzeigeanpassungsfenster, um die Helligkeit eines Kanals anzupassen. Klicken Sie auf den Namen eines Kanals, um die angezeigte Farbe zu ändern. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen neben dem Kanal, um die Anzeige zu verhindern.

Erstellen Sie Flecken, indem Sie auf das Symbol mit den orangefarbenen Flecken klicken. Wählen Sie einen ROI um die Zelle aus, um Bereiche auszuschließen, die helle Vorderkanten und Plaques fälschlicherweise erkennen. Messen Sie den Durchmesser eines Punkts, um erste Schätzungen für den Algorithmus zu erhalten.

Wechseln Sie in den Schichtmodus und klicken Sie auf die polaren Enden eines Punkts, um dessen Durchmesser zu messen. Tun Sie dies für vier oder fünf runde Flecken, die auf dem Höhepunkt seiner Stabilität nach der Bildung vor der Abtretung auf A CCP hinweisen, verwenden Sie diese Messungen, um den durchschnittlichen Durchmesser auf das nächste 10stel Mikrometer genau zu berechnen. Um Spots zu erkennen, die in den Surpass-Modus zurückkehren, wählen Sie den entsprechenden Kanal für die Erkennung aus.

Geben Sie den durchschnittlich gemessenen Durchmesser ein, normalerweise 0,3 oder 0,4 Mikrometer. Klicken Sie auf den blauen Vorwärtspfeil, um die Punkte zu quantifizieren. Filtern Sie die Spots nach Qualität, indem Sie den Filter so anpassen, dass so viele Spots wie möglich ohne Hintergrund erfasst werden.

Standardmäßig ist der Qualitätsfilter ausgewählt. Verwenden Sie die Qualitätskurve als Richtlinie, um einen geeigneten Schwellenwert festzulegen. Verschieben Sie den unteren Schwellenwert des Filters mit der linken Maustaste auf diese erste Vertiefung in der Kurve.

Dies ist ein guter Ausgangspunkt für den Filter. Da diese Position die Erkennung in der Regel nur auf sichtbare Punkte beschränkt. Entfernen Sie Arant Spots im Spot bearbeiten Bildschirm, wechseln Sie in den Auswahlmodus und klicken Sie auf den Spot Nachdem er gelb geworden ist, klicken Sie auf Löschen.

Klicken Sie dann auf den blauen Pfeil, um mit dem Aufbau des Algorithmus fortzufahren. Messen Sie Spuren, indem Sie Spuren auf Brownie in Bewegung setzen. Der CCP sollte keine gerichtete Bewegung aufweisen, sondern nur eine minimale Drift durch die Plasmamembran.

Dieser Algorithmus ist für diese Bewegung am besten geeignet. Legen Sie als Nächstes den maximalen Abstand auf einen kleinen Wert wie 0,7 Mikrometer fest. Die Einstellung eines kleinen Abstands minimiert die Verbindung benachbarter Spots und ermöglicht dennoch eine kontinuierliche Verfolgung eines Zellspots durch CCP oder Zellbewegung.

Legen Sie dann die maximale Lückengröße auf eins fest. Auf diese Weise kann die Spur fortgesetzt werden, wenn nur ein Frame fehlt. Aufeinanderfolgende Lückengrößen von mehr als drei führen dazu, dass verschiedene Gleise falsch miteinander verknüpft werden.

Der nächste Schritt besteht darin, die Streckenansicht auf Drachenschwanz umzustellen. Scrollen Sie durch den Film und beobachten Sie die Erkennungsqualität. Wenn benachbarte Punkte verbunden werden, verringern Sie den maximalen Abstand unter 0,7 Mikrometer.

Wenn Flecken zu leicht aufgebrochen werden, erhöhen Sie die maximale Spaltgröße. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um Spuren zu erstellen. Dies führt zum Filterspur-Bildschirm, um Spuren zu filtern.

Verwenden Sie einen Intensitätsfilter, um zusätzliche helle Plaques zu entfernen. Verwenden Sie dann einen Verdrängerfilter, um Endosomen zu entfernen, die in das Rasenfeld gelangen. Seien Sie vorsichtig, da längere Stellen auch eine längere Verschiebung haben.

Klicken Sie auf den grünen Doppelpfeil, um das Protokoll abzuschließen. Um Daten zu exportieren, gehen Sie auf die Registerkarte Statistiken. Klicken Sie auf das Symbol für eine einzelne Diskette, um die ausgewählte Statistik zu exportieren.

Klicken Sie auf das Symbol, das wie eine Reihe von Disketten aussieht, um alle Statistiken zu exportieren. Die Fokussierung auf die A-adhärente Plasmamembran und den konfokalen Modus zeigt eine Zelle, die mit schwacher Fluoreszenz gefüllt ist. Fokussiert man sich dagegen auf das Zentrum der Zelle, so zeigt sich die Plasmamembran als Fluoreszenzring um die Zelle.

Eine unscharfe Fluoreszenz macht sich bemerkbar, wenn auf konventionelle Epi, Fluoreszenz oder Rasen mit falschem Winkel umgeschaltet wird. Wenn der Rasenwinkel korrekt ist, ist die Plasmamembran sehr scharf, klar und hell und unscharf. Die Fluoreszenz stört das Bild nicht mehr.

Wenn sich Beta-Arrestin in einem zytosolischen Pool befindet, befindet sich nur sehr wenig auf dem Rasenfeld und es erscheint trüb und außerhalb des Fokus. Sobald das MOR durch den Agonisten Beta aktiviert wird, wird Arrestin an die Plasmamembran rekrutiert und sowohl Beta-Arrestin als auch der Rezeptor verteilen sich an CCPs weiter. Die Lebensdauer dieser Cluster wird manuell quantifiziert.

Anhand der drei Parameter für die abgeschlossene Endozytose können die Flecken, die CCPs kennzeichnen, vollständig verschwinden, ein- und ausschalten oder eine größere Struktur abklemmen. Nach der Filterung zur Entfernung von nicht-dynamischen Plaquestrukturen, überlagerten weißen Kugeln, kennzeichnen detektierte Flecken, dimmerne Flecken, die während ihrer gesamten Lebensdauer nicht detektiert werden konnten, ebenfalls mit dem Qualitätsfilter. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einzelne katheterkodierte Gruben mit Hilfe der Rasenmikroskopie visualisieren können.