Name: Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Dynamik einzelner Clathrin-beschichteter Gruben in lebenden Zellen mit TIRF-Mikroskopie visualisieren und quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.

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Die Autoren danken Dr. C. Szalinski, H. Teng und M. Bruchez für ihre Hilfe bei Imaris, R. Schüttein und D. Shiwarski für technische Hilfe und Ratschläge sowie bei Dr. M. von Zastrow, Dr. T. Kirchhausen, Dr. D. Drubin und Dr. W. Almers für die Reagenzien und hilfreiche Diskussionen. Die Finanzierung durch den T32-Zuschuss NS007433 an SLB und NIH DA024698 und DA036086 an MAP.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir den Einsatz von TIRFM zu Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) auf der Ebene der einzelnen CCPs in lebenden Zellen in Echtzeit zu visualisieren. CME ist eine schnelle und hochdynamische Veranstaltung durch die kumulative Wirkung vieler räumlich und zeitlich getrennte Einzelveranstaltungen vermittelt. Die meisten Assays, die gegenwärtig verwendet werden, wie zum Beispiel biochemische Messungen der Internalisierung mit Oberflächen Biotinylierung oder Liganden-Bindung, Durchflusszytometrie oder fixiert...

Der Prozess der Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) ist abhängig von der rechtzeitigen Ankunft der vielen Komponenten der Clathrin-vermittelten endozytischen Maschinen, um Fracht in die Vesikel 1-3 sammeln und die Plasmamembran zu manipulieren. CME ist durch Membran Verformung und Fracht-Adapterproteine, die an werdende Stellen der Endozytose 1 zusammen kommen eingeleitet. Diese Proteine ​​rekrutieren das Hüllprotein Clathrin, die in eine käfigartige Struktur, die die Clathrin-beschichteten Nadel (KPCh) 4 bildet versammelt. Nachdem die KPCh ist vollständig in eine Kugelform, Membranspaltung, vor allem durch Maßnahmen der großen GTPase, Dynamin montiert, erzeugt freie Clathrin-umhüllten Vesikeln (CCV) 5,6. Diese Internalisierung triggert schnelle Demontage der Clathrin-Mantel, so dass für mehrere Runden von CME Komponenten wiederverwendet werden. Die Entdeckung und Charakterisierung der Proteine ​​in CME beteiligt wurde in der traditionellen Bioch verwurzeltemical, genetischen und mikroskopischen Techniken 4-6,8. Diese Tests haben die Rollen und Interaktionspunkte dieser endozytischen Komponenten erläutert. Obwohl sehr nützlich zur Definition von wesentlichen Komponenten Handel Maschinen sind diese Tests sehr bei der Erfassung des dynamischen Verhaltens von CME Komponenten oder Ladungskonzentration begrenzt. Dies ist eine kritische Einschränkung, da CME wird durch die Anordnung choreographiert von Sätzen von Protein-Module in definierten Schritten angetrieben wird, und da kleine Veränderungen in der Dynamik der einzelnen endocytic Ereignisse große kumulativen Auswirkungen auf die Endozytose haben. Ferner bisherigen Daten zeigen, dass einzelne CCP kann sowohl in ihrer Zusammensetzung und in ihrem Verhalten unterscheiden, was darauf hindeutet, dass die physiologische Regulation dieses Verfahren ist sehr räumlich und zeitlich eingeschränkt 9-14. Visualisierung einzelner endozytischen Ereignisse ist daher wichtig zu verstehen, warum es mehrere redundante Proteine ​​in CME beteiligt und wie diese Proteine ​​könnte gesteuert werden by physiologische Signale, um Fracht Internalisierung regulieren. Hier beschreiben wir den Einsatz von Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) CME auf der Ebene der Dynamik der einzelnen CCPs in lebenden Zellen zu beobachten. TIRFM beruht auf dem Unterschied im Brechungsindex zwischen dem Deckglas und der Fluidumgebung der Zellen 15,16. Wenn das Anregungslicht auf die Zellen zu mehr als dem kritischen Winkel gerichtet ist, wird intern reflektiert, wodurch eine abklingende Welle, die einen dünnen Bereich der Beleuchtung, der sich ungefähr 100 nm oberhalb des Deckglases beibehält. Dies stellt sicher, dass nur die Fluoreszenzmoleküle in diesem engen Bereich angeregt werden. Praktisch kann dies die Anregung von Fluoreszenzmolekülen auf oder in der Nähe der Plasmamembran, und minimiert die Fluoreszenz von den inneren Teilen der Zelle. Dies stellt einen wesentlich höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis und z-Achsenauflösung auf Ereignisse in der Plasmamembran, CO visualisierenzu häufig verwendeten Modi wie herkömmliche Epifluoreszenz oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mpared. Wir beschreiben auch, zu einem Einführungs und praktischen Ebene, um die Verwendung einer gängigen Bildanalyse-Plattform zu analysieren und zu quantifizieren einfache morphologische Merkmale und Dynamik der einzelnen Lade endozytischen Veranstaltungen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Hoher Glukosegehalt mit L-Glutamin und Natriumpyruvat</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), kein Calcium, kein Magnesium</td><td>Gibco, von Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Free Acid</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Gibco, von Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, kein phenolrotes</td><td>Gibco, von Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, von Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE von Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>25 mm Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Corning Zellkultur-behandelte Flaschen, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-6-Well-Platte</td><td>Greiner Bio-One, by VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG</td><td></td></tr> <tr><td>[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalinacetatsalz (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Proteinmarkierungskit</td><td>Life Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris Bildanalysesoftware</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris für die automatisierte Analyse</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti inverses Mikroskop und erforderliches Zubehör, einschließlich Filterwürfel und Filter</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TIRF-Arm mit erforderlichen Adaptern für Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Zum Einstellen des Einfallswinkels</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCD Kamera und Adapter</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung clathrin-vermittelte endozytose von g-protein-gekoppelten rezeptoren an einzelereignis resolution über tirf-mikroskopie

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Viele wichtige Signalrezeptoren werden durch den gut untersuchten Prozess der Clathrin-vermittelten Endozytose (CME) internalisiert. Traditionelle zellbiologische Assays, die globale Veränderungen der Endozytose messen, haben über 30 bekannte Komponenten identifiziert, die an der CME beteiligt sind, und biochemische Studien haben eine Interaktionskarte vieler dieser Komponenten erstellt. Es wird jedoch immer deutlicher, dass CME ein hochdynamischer Prozess ist, dessen Regulation komplex und heikel ist. In diesem Manuskript beschreiben wir die Verwendung der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF), um die Dynamik von Komponenten der Clathrin-vermittelten endozytären Maschinerie in Echtzeit in lebenden Zellen auf der Ebene einzelner Ereignisse, die diesen Prozess vermitteln, direkt sichtbar zu machen. Dieser Ansatz ist wichtig, um die subtilen Veränderungen aufzuklären, die die Endozytose verändern können, ohne sie global zu blockieren, wie es bei der physiologischen Regulation der Fall ist. Wir werden uns auf die Verwendung dieser Technik konzentrieren, um ein Gebiet von aufstrebendem Interesse zu analysieren, nämlich die Rolle der Ladungszusammensetzung bei der Modulation der Dynamik verschiedener Clathrin-beschichteter Gruben (CCPs). Dieses Protokoll ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Fluoreszenzsonden kompatibel und kann zur Visualisierung der Dynamik vieler Frachtmoleküle angewendet werden, die von der Zelloberfläche internalisiert werden.

Verwendung lebender Zellen TIRF Mikroskopie wir die endozytischen Dynamik des μ-Opioid-Rezeptor (MOR) aufgezeichnet ist, ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) und deren endocytic Adapterprotein β-Arrestin. Die β-Arrestin-Konstrukt wurde vorübergehend in einem stabil exprimieren MOR-Zelllinie unter Verwendung des Protokolls in Abbildung 1 skizziert transfiziert und 96 Stunden später abgebildet. Die MOR in der stabilen Zelllinie ist N-terminal mit einem pH-sensitive GFP markiert. Diese fluoreszierende...

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik einzelner Clathrin-beschichteter Gruben in lebenden Zellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszenzmarkierte Endozytät- und Frachtproteine in eine Adhärenzzelllinie transektiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen mit Totalreflexion, Fluoreszenz- oder Rasenmikroskopie abzubilden.Die Lebensdauern kleiner Sätze von Clathrin-beschichteten Gruben werden dann manuell mit einem Bildverarbeitungs- und Analyseprogramm quantifiziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Lebensdauer von Clathrin-beschichteten Gruben durch objektive automatisierte Detektion und Analyse zu quantifizieren. Letztendlich wird die Rasenmikroskopie verwendet, um die Dynamik einzelner Clathrin-beschichteter Gruben mit Einzelereignisauflösung zu quantifizieren, um die Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu untersuchen.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Membrantransports zu beantworten, z. B. wie sich der Aufbau und die Dynamik der Endozytose basierend auf den verschiedenen vorhandenen endozytären Proteinen und Frachtproteinen ändern können. Zu Beginn der Transfektion von HEC 2 93 Zellen mit Plasmiden, die für Tag-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder GPCRs und/oder Komponenten der Claro-Maschinerie kodieren. In einer 12-Well-Platte, wie im Textprotokoll beschrieben, fügen Sie am Tag nach der Transfektion 0,5 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS mit jeweils einem millimolaren EDTA hinzu.Nun, dann legen Sie drei Patronen sterile 25-Millimeter-Abdeckfolien in separate Vertiefungen von sechs Stück. Well-Platte Füllen Sie jede Vertiefung mit zwei Millilitern Medium. Schieben Sie den Abdeckbezug vorsichtig auf den Boden der Vertiefung, um zu verhindern, dass Zellen an der Unterseite des Abdeckschirms wachsen.Bewegen Sie als Nächstes manuell eine Vertiefung der 12-Well-Platte, um die Zellen vom Boden der Vertiefung abzuheben. Fügen Sie einen Milliliter DM EM mit 10 % FBS hinzu, um es erneut zu senden. Verteilen Sie dann die angehobenen Zellen aus einer Vertiefung gleichmäßig auf die drei Abdeckplatten.Lassen Sie die Zellen vor der Bildgebung mindestens 48 Stunden lang auf den Deckgläsern wachsen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen ausgebreitet und flach sind, um die Dynamik der mit Clathrin-beschichteten Grube und Ladung abzubilden. Zuerst werden die Zellen mit Antikörpern vorinkubiert, wie im Textprotokoll beschrieben.Bereiten Sie dann die Übertragung des Deckglases in eine Bildgebungskammer für lebende Zellen vor, indem Sie eine Pinzette und eine 25-Gauge-Nadel verwenden, die an der Spitze zu einem Haken gebogen sind. Halten Sie die Pinzette in der dominanten Hand. Halten Sie die verbogene Nadel in der anderen.Drehen Sie die Nadel, bis sich der Haken nach unten in Richtung Glas wölbt. Ziehen Sie den Nadelhaken vorsichtig mit der Seite nach unten über den Boden einer Platte mit sechs Vertiefungen, bis er sich in den Deckglas einhakt. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Deckglases nicht zu zerkratzen, da sich dadurch Zellen ablösen.Heben Sie den Deckel vorsichtig vom Boden der Vertiefung nach oben. Balancieren Sie den Deckslip zur Unterstützung an der Wand des Schachts. Fassen Sie mit der Pinzette in der Nähe des Randes des Deckglases und bewegen Sie die Seite der Deckglaszelle nach oben zur Bildgebungskammer.Bauen Sie die Kammer zusammen und fügen Sie 700 Mikroliter vorwarmes Bildgebungsmedium hinzu. Nachdem Sie die Kammer auf das Mikroskop übertragen haben, bringen Sie die Zellen mit einem Rasenöl-Immersionsobjektiv in den Fokus, indem Sie die Zellen im herkömmlichen Epi-, Fluoreszenz- oder konfokalen Beleuchtungsmodus abbilden, um Zellen zu identifizieren, die die entsprechenden Konstrukte exprimieren, was eine wichtige Sicherheitsvorkehrung darstellt. Achten Sie immer auf den Winkel des Laserstrahls und richten Sie ihn immer vom Betrachter weg.Fokussieren Sie sich dann auf die untere Oberfläche einer exprimierenden Zelle, bis der Umriss der Plasmamembran um die Zelle verschwindet und die untere Oberfläche der Zelle erscheint. Am deutlichsten ist dies bei einem in der Plasmamembran lokalisierten Frachtprotein wie dem mu-Opioid-Rezeptor. Wenn die gleichen Laser für die Bildgebung bei konventioneller Epi-Fluoreszenz verwendet werden, erhöhen Sie den Einfallswinkel des Lasers bis zur Unschärfe.Die Fluoreszenz im Inneren der Zelle verschwindet und es ist kein Umriss der Plasmamembran um die Zelle herum zu sehen. Sobald Sie sich im Rasen m befinden, stellen Sie sicher, dass der Anregungslaser durch das Objektiv zurückreflektiert wird und nicht über dem Objektiv sichtbar ist. Indem Sie prüfen, ob der Laserpunkt sichtbar ist, verfeinern Sie den Fokus, um ein gestochen scharfes Bild zu erhalten.Sobald die Zellen identifiziert sind, nehmen Sie 10 Minuten lang mindestens alle drei Sekunden Bilder auf. Wiederholen Sie alle Schritte, um weitere Zellen abzubilden. Um mit der Analyse der endozytären Dynamik zu beginnen, öffnen Sie die Datei im Bild J. Bilder werden als ein einziger Stapel von TIFF-Dateien gespeichert.Mit Zwischenblattkanälen. Konvertieren Sie die Bilder in Hyper-Stapel, indem Sie im Popup-Fenster Bild-Hyper-Stapel und Stapel in Hyper-Stapel auswählen. Geben Sie die Anzahl der erworbenen Kanäle ein.Geben Sie einen für Zack ein und geben Sie die Anzahl der Filmbilder ein. Das Hyper-Stack-Format ergibt ein Fenster mit zwei Bildlaufleisten. Verwenden Sie die obere Leiste, um durch die Kanäle zu navigieren, und die untere Leiste, um durch die Zeit zu navigieren.Scrollen Sie zum Kanal des Proteins, dessen Lebensdauer getestet wird. Gehen Sie über das erste Bild des Films hinaus, um die Einbeziehung bereits vorhandener Clathrin-beschichteter Gruben oder CCPs zu reduzieren, deren gesamte Dauer nicht sichtbar ist. Zeichnen Sie einen Bereich von Interesse oder ROI um einen zufällig ausgewählten Ort.Zählen Sie die Anzahl der Frames, für die ein Spot sichtbar ist. Um die Analyse mit der Objekterkennung zu starten, öffnen Sie die Rohbilddatei in der Bildanalysesoftware, die standardmäßig entstanden ist. Farbbild wird angezeigt.Verwenden Sie das Anzeigeanpassungsfenster, um die Helligkeit eines Kanals anzupassen. Klicken Sie auf den Namen eines Kanals, um die angezeigte Farbe zu ändern. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen neben dem Kanal, um die Anzeige zu verhindern.Erstellen Sie Flecken, indem Sie auf das Symbol mit den orangefarbenen Flecken klicken. Wählen Sie einen ROI um die Zelle aus, um Bereiche auszuschließen, die helle Vorderkanten und Plaques fälschlicherweise erkennen. Messen Sie den Durchmesser eines Punkts, um erste Schätzungen für den Algorithmus zu erhalten.Wechseln Sie in den Schichtmodus und klicken Sie auf die polaren Enden eines Punkts, um dessen Durchmesser zu messen. Tun Sie dies für vier oder fünf runde Flecken, die auf dem Höhepunkt seiner Stabilität nach der Bildung vor der Abtretung auf A CCP hinweisen, verwenden Sie diese Messungen, um den durchschnittlichen Durchmesser auf das nächste 10stel Mikrometer genau zu berechnen. Um Spots zu erkennen, die in den Surpass-Modus zurückkehren, wählen Sie den entsprechenden Kanal für die Erkennung aus.Geben Sie den durchschnittlich gemessenen Durchmesser ein, normalerweise 0,3 oder 0,4 Mikrometer. Klicken Sie auf den blauen Vorwärtspfeil, um die Punkte zu quantifizieren. Filtern Sie die Spots nach Qualität, indem Sie den Filter so anpassen, dass so viele Spots wie möglich ohne Hintergrund erfasst werden.Standardmäßig ist der Qualitätsfilter ausgewählt. Verwenden Sie die Qualitätskurve als Richtlinie, um einen geeigneten Schwellenwert festzulegen. Verschieben Sie den unteren Schwellenwert des Filters mit der linken Maustaste auf diese erste Vertiefung in der Kurve.Dies ist ein guter Ausgangspunkt für den Filter. Da diese Position die Erkennung in der Regel nur auf sichtbare Punkte beschränkt. Entfernen Sie Arant Spots im Spot bearbeiten Bildschirm, wechseln Sie in den Auswahlmodus und klicken Sie auf den Spot Nachdem er gelb geworden ist, klicken Sie auf Löschen.Klicken Sie dann auf den blauen Pfeil, um mit dem Aufbau des Algorithmus fortzufahren. Messen Sie Spuren, indem Sie Spuren auf Brownie in Bewegung setzen. Der CCP sollte keine gerichtete Bewegung aufweisen, sondern nur eine minimale Drift durch die Plasmamembran.Dieser Algorithmus ist für diese Bewegung am besten geeignet. Legen Sie als Nächstes den maximalen Abstand auf einen kleinen Wert wie 0,7 Mikrometer fest. Die Einstellung eines kleinen Abstands minimiert die Verbindung benachbarter Spots und ermöglicht dennoch eine kontinuierliche Verfolgung eines Zellspots durch CCP oder Zellbewegung.Legen Sie dann die maximale Lückengröße auf eins fest. Auf diese Weise kann die Spur fortgesetzt werden, wenn nur ein Frame fehlt. Aufeinanderfolgende Lückengrößen von mehr als drei führen dazu, dass verschiedene Gleise falsch miteinander verknüpft werden.Der nächste Schritt besteht darin, die Streckenansicht auf Drachenschwanz umzustellen. Scrollen Sie durch den Film und beobachten Sie die Erkennungsqualität. Wenn benachbarte Punkte verbunden werden, verringern Sie den maximalen Abstand unter 0,7 Mikrometer.Wenn Flecken zu leicht aufgebrochen werden, erhöhen Sie die maximale Spaltgröße. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um Spuren zu erstellen. Dies führt zum Filterspur-Bildschirm, um Spuren zu filtern.Verwenden Sie einen Intensitätsfilter, um zusätzliche helle Plaques zu entfernen. Verwenden Sie dann einen Verdrängerfilter, um Endosomen zu entfernen, die in das Rasenfeld gelangen. Seien Sie vorsichtig, da längere Stellen auch eine längere Verschiebung haben.Klicken Sie auf den grünen Doppelpfeil, um das Protokoll abzuschließen. Um Daten zu exportieren, gehen Sie auf die Registerkarte Statistiken. Klicken Sie auf das Symbol für eine einzelne Diskette, um die ausgewählte Statistik zu exportieren.Klicken Sie auf das Symbol, das wie eine Reihe von Disketten aussieht, um alle Statistiken zu exportieren. Die Fokussierung auf die A-adhärente Plasmamembran und den konfokalen Modus zeigt eine Zelle, die mit schwacher Fluoreszenz gefüllt ist. Fokussiert man sich dagegen auf das Zentrum der Zelle, so zeigt sich die Plasmamembran als Fluoreszenzring um die Zelle.Eine unscharfe Fluoreszenz macht sich bemerkbar, wenn auf konventionelle Epi, Fluoreszenz oder Rasen mit falschem Winkel umgeschaltet wird. Wenn der Rasenwinkel korrekt ist, ist die Plasmamembran sehr scharf, klar und hell und unscharf. Die Fluoreszenz stört das Bild nicht mehr.Wenn sich Beta-Arrestin in einem zytosolischen Pool befindet, befindet sich nur sehr wenig auf dem Rasenfeld und es erscheint trüb und außerhalb des Fokus. Sobald das MOR durch den Agonisten Beta aktiviert wird, wird Arrestin an die Plasmamembran rekrutiert und sowohl Beta-Arrestin als auch der Rezeptor verteilen sich an CCPs weiter. Die Lebensdauer dieser Cluster wird manuell quantifiziert.Anhand der drei Parameter für die abgeschlossene Endozytose können die Flecken, die CCPs kennzeichnen, vollständig verschwinden, ein- und ausschalten oder eine größere Struktur abklemmen. Nach der Filterung zur Entfernung von nicht-dynamischen Plaquestrukturen, überlagerten weißen Kugeln, kennzeichnen detektierte Flecken, dimmerne Flecken, die während ihrer gesamten Lebensdauer nicht detektiert werden konnten, ebenfalls mit dem Qualitätsfilter. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einzelne katheterkodierte Gruben mit Hilfe der Rasenmikroskopie visualisieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

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Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.

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Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) zur Visualisierung exozytärer Ereignisse in kortikalen Neuronen. Ein pH-empfindlicher Marker für grün fluoreszierendes Protein (GFP) fluoresziert bei der Vesikelfusion, wobei die selektive TIRF-Anregung die membranproximale Exozytose...

Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse 

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

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Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

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Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

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Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

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Erfahren Sie, wie Sie die Dynamik einzelner Clathrin-beschichteter Gruben in lebenden Zellen mit TIRF-Mikroskopie visualisieren und quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

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