Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die genomische Instabilität in B-Lymphozyten der Maus zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die B-Zellen für die primäre Zellkultur isoliert werden. Als nächstes werden die Zellen fixiert, was die Vorbereitung der Metaphasenausbreitungen erleichtert.

Schließlich wird eine Telomer-PNA-Fischuntersuchung zur Visualisierung der fluoreszenzmarkierten Telomere durchgeführt. Letztendlich kann das Ausmaß verschiedener Arten von Chromosomenaberrationen durch Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Die Auswirkungen dieser Technik können unser Verständnis der DNA-Reparaturwege erweitern, da sie dazu beitragen kann, Gene zu identifizieren, die die genomische Stabilität in unseren Zielmausmodellen fördern.

Obwohl diese Methode Einblicke in Chromosomenbrüche und andere große chromosomale Umlagerungen geben kann, kann sie auch angepasst werden, um andere Formen genomischer Instabilität wie Translokationen zu messen. Um die B-Zellen zu isolieren, legen Sie zunächst eine frisch isolierte Milz in eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale mit zwei Millilitern Waschpuffer in einer Laminar-Flow-Haube. Verwenden Sie dann die Rückseite des Kolbens aus einer Fünf-Milliliter-Spritze, um die Milz vorsichtig zu mazerieren.

Filtrieren Sie anschließend die Gewebeaufschlämmung durch ein 70-Mikrometer-Nylon-Netzsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, indem Sie den Kolben verwenden, um die größeren Gewebestücke vorsichtig durch das Sieb zu drücken. Spülen Sie die Platte und die Spritze mit acht Millilitern Waschpuffer aus und filtern Sie die Wäsche durch das Sieb. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, pipettieren Sie das Pellet einige Male in drei Millilitern eines CK-Lysepuffers auf und ab.

Stoppen Sie die Reaktion nach fünf Minuten mit 10 Millilitern Waschpuffer. Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, klopfen Sie auf den Boden des Rohrs, um das Pellet wieder zu suspendieren, und fügen Sie den Zellen einen Milliliter Waschpuffer hinzu. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Anti CD 43 max Mikrokügelchen auf Eis.

Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten vorsichtig in 10 Millilitern Waschpuffer. Während der Zentrifugation wird eine Minimax-Säule auf den Magneten und ein beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen unterhalb der Säule gelegt. Geben Sie dann einen Milliliter Waschpuffer in die Säule und sammeln Sie das EIT im Röhrchen.

Resuspendieren Sie das Küvettenpellet in einem Milliliter Waschpuffer und laden Sie die Zellen dann auf die Säule. Nachdem die Probe durchlaufen ist, spülen Sie die Säule mit einem Milliliter Waschpuffer und geben Sie sieben Milliliter Waschpuffer direkt in die entnommene Probe. Nachdem Sie die gesammelten Zellen gezählt haben, geben Sie sie zur Zentrifugation in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Um dann die B-Zellen zu aktivieren, resuspendieren Sie das Pellet einmal mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter in supplementiertem B-Zell-Medium und inkubieren Sie die Zellen in sechs Well-Platten mit fünf Millilitern Zellen pro Well in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die B-Zellen zu fixieren.

Als nächstes werden 50 Mikroliter Smid in jede der Vertiefungen gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius werden die B-Zellen in ein beschriftetes 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Decken Sie das Etikett mit Klebeband ab und drehen Sie die Zellen nach unten.

Saugen Sie dann alles bis auf etwa einen Milliliter Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren. Fügen Sie fünf Milliliter Kaliumchlorid mit 37 Grad Celsius hinzu, Tropfen für Tropfen, während Sie auf einem Wirbel pulsieren. Fügen Sie dann weitere 10 Milliliter Kaliumchlorid hinzu und mischen Sie die Zelllösung durch Inversion.

Anschließend inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Fügen Sie dann fünf Tropfen frisches Fixiermittel hinzu und mischen Sie es erneut durch Umdrehen. Schleudern Sie dann die Zellen nach der Reanimation herunter, indem Sie das Pellet in einem Milliliter Überstand suspendieren, fügen Sie fünf Milliliter frisches Fixiermittel hinzu, Tropfen für Tropfen, während Sie auf einem Wirbel pulsieren, und inkubieren Sie die Zellen und weitere 10 Milliliter Fixiermittel bei Raumtemperatur.

Nach 30 Minuten pelletieren Sie die Zellen und entfernen Sie alle bis auf einen Milliliter des Fixiermittels. Nach dem Waschen der Zellen zwei weitere Male in 15 Millilitern Fixiermittel wird das Pellet in den letzten 70 Mikrolitern des Überstands wieder suspendiert. Legen Sie nun beschriftete Objektträger in einem Winkel von 35 Grad in eine Feuchtigkeitskammer, die auf 22,9 Grad Celsius und 52 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.

Geben Sie 35 Mikroliter der resuspendierten B-Zellen auf jeden Objektträger und bereiten Sie zwei Objektträger pro Probe vor. Nachdem Sie die Objektträger 30 Minuten lang in der Feuchtigkeitskammer trocknen gelassen haben, lagern Sie die Objektträger in einer Objektträgerbox bei 37 Grad Celsius, bis sie vollständig getrocknet sind. Nach dem Trocknen markieren Sie mit einem Diamantstift einen 18 x 18 Millimeter großen Bereich für die Hybridisierung auf der Rückseite jedes Objektträgers, um die Objektträger für Fische zu denaturieren.

Tragen Sie anschließend 120 Mikroliter 70 % deionisiertes Formamid auf 24 Millimeter x 60 Millimeter große Deckgläser auf und berühren Sie dann jeden Objektträger mit einem Deckglas. Denaturieren Sie die Objektträger auf einer 80 Grad heißen Platte für 90 Sekunden und schieben Sie sie dann schnell und vorsichtig nacheinander von den Deckgläsern ab. Legen Sie die Objektträger jeweils drei Minuten lang in eiskaltes 70, 90 und 100 % Ethanol. Legen Sie die Objektträger nach dem Trocknen in eine feuchte Kammer und tragen Sie die erforderliche Sondenmischung auf die markierten Bereiche auf den Objektträgern auf.

Decken Sie die Sondenmischung mit einem 18 x 18 Millimeter großen Deckglas ab und inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie dann die Objektträger in vorgewarnten zwei XSSC mit Schütteln. Tragen Sie nach fünf Minuten 35 Mikroliter moyal Eindeckmittel auf die Objektträger auf.

Decken Sie das Medium mit 24 Millimeter x 60 Millimeter großen Deckgläsern ab und lagern Sie die Dias bei vier Grad Celsius. Analysieren Sie abschließend die Metaphasen-Objektträger mit einem Standard-Epi-Fluoreszenzmikroskop. Metaphase-Chromosomen, die von einer Mauszelle stammen, sollten einen diskreten Cluster mit 40 Chromosomen bilden.

Jedes Chromosom hat ein Zentromer an einem Ende, in der Nähe von zwei Telomersignalen, sowie zwei zusätzliche Telomersignale am anderen Ende des Chromosoms. Chromatidenbrüche sind Brüche in einem der beiden Schwesterchromatiden, aus denen jedes Metaphase-Chromosom besteht. In einigen Fällen kann das gebrochene Ende des Chromosoms als Fragment mit Telomersignalen in der gleichen Metaphasenausbreitung beobachtet werden.

Radiochromosomen sind komplexe Umlagerungen, an denen zwei Chromosomen beteiligt sind. Chromosomen können sich auch zu dizentrischen Chromosomen verbinden, die als Ende-zu-Ende-Verschmelzungen von Chromosomen mit Zentroeren an beiden Enden erscheinen. Robertsonsche Translokationen sind eine Art der Translokation zwischen den Zentroeren zweier Chromosomen, die als vier Schwesterchromatarme erscheinen, die an einem einzigen Zentromer befestigt sind.

In diesem letzten Bild ist eine Metaphase zu sehen, in der keine Telomersignale vorhanden sind. Das Fehlen von Telomersignalen kann durch Fehler in der Sondenvorbereitung oder durch Luftblasen unter dem Deckglas während der Hybridisierung entstehen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Zellzyklusanalysen und Dickdarminformationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob eine erhöhte genomische Instabilität die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflusst.