Ein lateralisierte Geruch-Lern-Modell in neugeborenen Ratten zum Präparieren Neural Circuitry Underpinning Gedächtnisbildung

Dieses Protokoll führt das lateralisierte frühe Lernen von Geruchspräferenzen bei Ratten mit akuten Einzelnärverschlüssen ein. Dies wird erreicht, indem zunächst abnehmbare Nasenstopfen aus Polyethylen konstruiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, den gewünschten Widder vor dem Verhaltenstraining zu verschließen.

Bereiten Sie anschließend die Dufteinstreu vor und trainieren Sie das Tier dann in der Dufteinstreu, während Sie es mit einem Pinsel streicheln. Der letzte Schritt besteht darin, die lateralisierte Geruchspräferenz mit einem Zwei-Auswahl-Testgerät zu testen. Letztendlich wird die Immunhistochemie des phosphorylierten C-amp-Response-Element-Bindungsproteins oder P crib verwendet, um die einseitige Stilllegung der neuronalen Aktivität aufgrund der Einzelabgeschiedenheit und der Reversibilität der Methode zu demonstrieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik unserer bestehenden Methoden zur Tierkontrolle besteht darin, dass wir in der Lage sind, die Variabilität und die Anzahl der Tiere durch die Art unseres Versuchsdesigns zur tierinternen Kontrolle vor der postnatalen Schicht 11 zu reduzieren, da aufgrund des Fehlens von MA reifen anterioren Kommesprojektionen, dass zwei olfaktorische Hemisphären nicht verbunden sind. Dies ermöglicht es uns, eine Hemisphäre unabhängig von der anderen durch die Einzelnahrungsokklusion zu manipulieren. Die verschlossene Hemisphäre dient als tierinterne Kontrolle.

Obwohl sich diese Technik auf das olfaktorische Lernen bei neugeborenen Ratten konzentriert, werden die Implikationen es uns ermöglichen, grundlegende Fragen zu neuronalen Prozessen während des Lernens und des Gedächtnisses zu beantworten, wie z.B. synaptische Plastizität, Metaplastik und die ihnen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Die Schlussfolgerungen, die aus Studien mit dieser Methode gezogen werden, können auf die Grundprinzipien des Lernens, des Gedächtnisses und der Säugetiere verallgemeinert werden, insbesondere während der postnatalen kritischen Phasen. Dies wird uns helfen, einen vielversprechenden Hintergrund für potenzielle Therapeutika gegen Gedächtnisverlust im Zusammenhang mit pathophysiologischen Zuständen aufzubauen.

Diese Methode eignet sich auch sehr gut für andere olfaktorische Prozesse wie die Geruchswahrnehmung und die Geruchsbeschichtung. Der Nasenstopfen besteht aus Polyethylen 20-Schläuchen und drei Null-Seidennahtfäden. Schneiden Sie zunächst ein kleines Stück Polyethylen 22 auf ca. 0,8 Zentimeter ab.

Fädeln Sie dann die Seidennaht so durch den vorbereiteten Schlauch, dass sich auf beiden Seiten des Schlauchabschnitts Faden befindet. An einem Ende des Fadens außerhalb des Steckers einen Knoten binden. Ziehe den Schlauchabschnitt über den Knoten im Gewinde nach unten.

Der Knoten sollte sich im Schlauch festsetzen. Schneiden Sie beide Enden des Gewindes so ab, dass etwa zwei Millimeter Gewinde aus einem Ende des Schlauchs herausragen. Um mit diesem Vorgang zu beginnen, nehmen Sie den Welpen aus dem Muttertier und legen Sie ihn in eine sichere Schüssel, die mit normaler Einstreu bedeckt ist.

Mit einem Wattestäbchen-Applikator ein Lokalanästhetikum, 2%Xylocain, auf den Widder tupfen, um ihn zu verschließen. Lassen Sie den Welpen etwa drei Minuten in der Schüssel ruhen. Lucin im Welpen ist der kritischste Schritt in diesem Verfahren.

Die Kur sollte während des Einführens des Nasenstopfens eingenommen werden, um Blutungen und Gewebeschäden zu vermeiden. Nehmen Sie als nächstes den Welpen und halten Sie ihn sanft, aber sicher in der nicht-dominanten Hand mit der dominanten Hand, nehmen Sie eine Nase, einen Stöpsel und tupfen Sie das gleiche Lokalanästhetikum-Gelee um die Spitze, aus der der Faden nicht herausragt. Dies wirkt sowohl als Betäubungsmittel für leichte Schmerzen, die mit dem Einführen des Plugs verbunden sind, als auch als Schmiermittel im Inneren des Steckers.

Führen Sie den Nasenplug vorsichtig ein, indem Sie den Pup fest halten und den Plug langsam mit sehr sanften Drücken drehen, bis der Plug vollständig eingeführt ist und nur noch das zwei Millimeter lange Gewinde aus dem Widder herausragt. Während dieses Prozesses sollte es zu keiner Blutung aus einem der beiden Widder kommen. Welpen mit Blutungen während des Einführens des Nasenstöpsels können nicht für den Versuch verwendet werden.

Lassen Sie das Tier fünf Minuten in der Schale ruhen, um sich an den Plug zu gewöhnen. Bereiten Sie vor Beginn des Trainings zur Vermeidung von Geruchskontamination die Dufteinstreu in einem Abzug vor und geben Sie mit neuen Handschuhen 500 Milliliter Hackschnitzeleinstreu in eine Plastiktüte. Ziehe mit einer Spritze 0,3 Milliliter Pfefferminzextrakt auf und sprühe diesen über die Einstreu in der Plastiktüte. Binden Sie den Beutel zu, schütteln Sie den Beutel kräftig und lassen Sie die Einstreu fünf Minuten lang im Beutel ruhen, legen Sie die parfümierte Einstreu vor dem Gebrauch fünf Minuten lang in eine durchsichtige, flache 20 x 20 x fünf Zentimeter große Acryl-Trainingsbox, die nicht im Abzug liegt.

Sobald die Bettwäsche vorbereitet ist, entsorgen Sie die benutzten Handschuhe. Lassen Sie die Handschuhe nicht mit den Tieren in Berührung kommen. Legen Sie 500 Milliliter unparfümierte Einstreu in eine andere saubere Trainingsbox aus Acryl und achten Sie darauf, dass sie nicht mit parfümierter Einstreu oder benutzten Handschuhen in Berührung kommt.

Beginnen Sie mit dem Paradigma der Geruchskonditionierung, indem Sie den gewöhnten Welpen auf die duftende Einstreu legen, um einen experimentellen Geruch zu erzeugen. Plus Schlaganfall-OS-positive Welpen. Streicheln Sie den Welpen 30 Sekunden lang.

Führen Sie mit einem kleinen Pinsel schnelle kreisende Bewegungen hauptsächlich um die Hinterregion des Welpen aus. Streicheln induziert die Freisetzung von Noradrenalin an den Riechkolben und die Riechrinde. Dies dient als bedingungsloser Reiz.

Lassen Sie den Welpen 30 Sekunden ruhen. Wiederhole das 30-sekündige Streicheln, gefolgt von 30 Sekunden Pause für insgesamt 10 Minuten. Wenn die 10 Paarungen von Streicheln plus Geruch abgeschlossen sind, nehmen Sie den Welpen aus der Konditionierungsbox.

Entfernen Sie den Nasenstopfen und bringen Sie den Welpen zur Kontrolle zum Muttertier zurück. Riechen Sie nur OS-negative Welpen. Legen Sie den gewöhnten Welpen 10 Minuten lang ohne Streicheln auf die duftende Einstreu.

Nehmen Sie den Welpen nach 10 Minuten aus der Konditionierungsbox. Entfernen Sie den Nasenstopfen und bringen Sie den Welpen zur Mutter zurück. Die lateralisierte Geruchspräferenzprüfung wird zu verschiedenen Zeitpunkten nach der abschließenden Trainingseinheit durchgeführt.

Die Prüfung erfolgt in einer 30 x 20 x 18 Zentimeter großen Prüfkammer aus Edelstahl, die auf zwei Acryl-Trainingsboxen steht, die durch eine zwei Zentimeter große neutrale Zone getrennt sind. Eine Trainingsbox enthält parfümierte Einstreu, während die andere Box saubere, unparfümierte Einstreu enthält. Bereiten Sie eine nach Pfefferminze duftende Einstreu und eine unparfümierte Einstreu vor, wie zuvor gezeigt, und platzieren Sie jede Schachtel unter den gegenüberliegenden Seiten der Testkammer.

Zwei Zentimeter voneinander entfernt. Legen Sie das Kunststoffgitter auf den Metallgitterboden der Prüfkammer. Entferne das P vom Damm und gib einen festen Tupfer geruchloses Silikonfett auf den Widder, der verschlossen ist.

Während des Trainings kann das Fett während des ersten Testvorgangs bei Bedarf erneut aufgetragen werden. Stellen Sie den Welpen in die neutrale Zone der Prüfkammer. Lassen Sie den Welpen eine Minute lang die Kammer erkunden und notieren Sie, wie lange der Welpe auf beiden Seiten der Kammer verbracht hat, d.h. über Pfefferminze oder neutral duftender Einstreu.

Bringen Sie den Welpen in eine abgedeckte Haltekammer aus Kunststoff und lassen Sie ihn eine Minute ruhen. Wiederholen Sie die Testversuche für insgesamt 10 Minuten und ändern Sie die anfängliche Ausrichtung des Welpen in der Kammer, um die Richtungspräferenzen zu steuern. Wischen Sie unmittelbar nach dem Test das Fett vom Aries ab.

Führen Sie einen Nasenstopfen aus Polyethylen in den gegenüberliegenden Widder ein, indem Sie das gleiche RY-Absonderungsverfahren befolgen, das zuvor gezeigt wurde, und lassen Sie das Tier 10 Minuten lang ruhen. Anschließend wird ein lateralisierter Geruchspräferenztest am Welpen durchgeführt. Wieder. Wenn der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie den Stopfen und bringen Sie den Welpen zum Muttertier zurück.

Eine einzelne enge Abgeschiedenheit während des Geruchs- und Streicheltrainings führt zu einem lateralisierten Geruchsgedächtnis, das auf die verschonten NRIs beschränkt ist. Wenn Welpen auf eine Geruchspräferenz getestet werden, bei der sie genauso isoliert sind wie während des Trainings, zeigen sie eine Präferenz für den konditionierten Geruchs. Dies wurde nicht beobachtet, wenn die Tests mit dem gegenüberliegenden nary abgeschieden durchgeführt wurden.

Im Gegensatz dazu zeigen reine Geruchskontrollgruppen keine Geruchspräferenz, unabhängig davon, welcher Geruch verschlossen ist. Während des Tests führte das lateralisierte Geruchstraining zu einer lateralisierten Aktivierung des olfaktorischen Systems während der Geruchsexposition, die Immunhistochemie des Riechkolbens oder OB und des anterioren piriformen Kortex oder eines PC zeigte signifikant weniger phosphoryliertes Creb in der verschlossenen Hemisphäre nach Geruchsexposition im Vergleich zur kontralateralen verschonten Hemisphäre. Die Nissel-Färbung zeigt vergleichbare Zellkörper in der Mitralzellschicht des OB und in der pyramidalen Zellschicht des PC beider Hemisphären.

24 Stunden nach der Entfernung des Nasenpfropfens, der Erbsenkrabbe, der Expression nach Geruchsexposition in den Mitralzellen des OB und den Pyramidenzellen im PC sind zwischen der verschlossenen und der verschonten Hemisphäre vergleichbar. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung einer einzigen Abgeschiedenheit in einem einzigen Versuch vorübergehend und reversibel ist und nicht zu sichtbaren langfristigen neuronalen Schäden führt, die die Geruchswahrnehmung und die neuronale Aktivierung von Gerüchen während des Tests beeinträchtigen könnten. Einmal gemeistert, kann die NA-Okklusion in weniger als fünf Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, beim Verstopfen des Nasenlochs äußerst vorsichtig zu sein. Jede übermäßige Kraft oder unsachgemäße Technik kann zu Blutungen und damit zu Schäden am Nasenloch führen. Nach diesem Verfahren kann es zu einer Schädigung des Nasenlochs kommen. Andere Methoden wie ex vivo, Elektrophysiologie und molekulare Techniken können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur synaptischen Plastizität zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie temporäre einseitige schmale Okklusionen verwenden können, um das Geruchslernen zu lateralisieren und die neuronalen Schaltkreise zu analysieren, die der Gedächtnisbildung zugrunde liegen.