Name: A Novel In vivo Gentransfer-Technik und In-vitro- Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Erfahren Sie eine neuartige Gentransfer-Technik zur Osteoklastendifferenzierung in vivo und zellbasierte Assays in vitro. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Zytokin-Effekten auf die Osteoklastogenese.

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Die Forschung wurde teilweise durch die NIH-Forschungszuschüsse R01 AR062173 und SHC 250862 an IEA unterstützt. ES ist Empfänger des NIH T32 CTSC Predoctoral Fellowship.

1. Hydrodynamische Lieferung der sRANKL MC DNA <ol><li> Hydrodynamische Lieferung über Mausschwanzvene <ol><li> Wiegen Sie die Maus vor der Schwanzveneninjektion. Verdünnen sRANKL oder grün fluoreszierende Protein (GFP) MC in Ringer-Lösung (pre-warmen bei 37 ° C) in einem Gesamtvolumen von ca. 10% der Mauskörpergewicht. </li><li> Wärmen Sie die Maus in einem Käfig für 10 Minuten vor der Injektion, um die Blutgefäße erweitern und machen seitlichen Venen (LVs) sichtbar. Überwachen Sie die Maus sorgfältig zu Dehydrierung und Hyperthermie zu vermeiden. </li><li> Sobald die LVs sind erweitert und sichtbar, übertragen Sie die Maus auf den Restrainer und den Stecker weit genug in den Lauf, um die Bewegung zurückzuhalten. Überwachen Sie die Maus für die normale Aktivität wie Atmung. Stellen Sie den Stecker des Restrainer, wenn nötig. </li><li> Desinfizieren Sie die Injektionsbereich 3/4 von der Spitze des Schwanzes mit einem Alkoholtupfer. Verwenden Sie eine 27 bis 30 G-Nadel für die Mausschwanzveneninjektion. Halten Sie den Schwanz mit einer Hand fest und legen Sie die Nadel inin die Schwanzvene. Üben Sie Druck auf die Spritze und füllen Sie die Injektion innerhalb von 5-7 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Schwanzvene und Druck mit einem Wattebausch auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu stoppen. Überwachen Sie die Maus für 15-30 min, übertragen Sie dann die Maus wieder auf, sobald das Vivarium Atemfrequenz wird auf seiner normalen Geschwindigkeit reduziert. </li></ol></li><li> Bestätigung der Maus Systemische sRANKL Expression und Quantifizierung der Maus Serum TRACP5b Beitrag Gentransfer <ol><li> Wärmen Sie die Maus in einem Käfig für 5-10 min, um die Blutgefäße erweitern und machen LVs sichtbar. Überwachen Sie die Maus sorgfältig zu Dehydrierung und Hyperthermie zu vermeiden. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einem Messer an der Maus den Schwanz an einem Ort, ein Viertel von der Spitze des Schwanzes. </li><li> Sammeln Sie etwa 100 ul Blut im Serum Trennung Röhren. </li><li> Serumtrennröhrchen bei Raumtemperatur inkubiert für 30 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 xg für 5 min und sammeln Serum. Store Serum -80 ° C zur weiteren Analyse. </li><li> Führen sRANKL ELISA und Mausserum TRACP5b Assay auf Serum-Proben unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits. </li></ol></li></ol> 2. Osteoklasten in vitro Generierung von Maus BMM <ol><li> Isolierung und Kultivierung von BMM <ol><li> Die Isolierung des Schien-und Oberschenkelknochen: Euthanize den Spender-Maus mit CO 2, und desinfizieren Sie die Beine mit 70% Ethanol. Präparieren Sie vom Schambein zu dem Fersenbein, um die Oberschenkel und Schienbein Knochen entfernen intakt. </li><li> Entfernen Sie die Haut-und Muskel sorgfältig, ohne die Knochen. Platzieren verarbeitet Femur und Tibia Knochen in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Entfernung von Knochenmark: Schneiden Sie die Spitze auf der einen Seite der Oberschenkel und Schienbein Knochen und spülen, die Knochenmark in einen 50-ml-Tube mit einer 1 ml-Spritze mit einer 25 G-Nadel, mit α-MEM mit 1% Penicillin / Streptomycin belastet (Osteoklasten Kultur Medium / OCM). </li><li&gt; Prozessknochenmark: Mix und übertragen Knochenmark-Suspension auf einen neuen 50-ml-Tube, indem es durch einen 70 um Nylon Zellsieb. Zentrifugation der Zellen bei 300 × g und resuspendieren in α-MEM, das 1% Penicillin / Streptomycin und 10% FBS (Osteoklasten-Kulturmedium / OCM (+)). </li></ol></li><li> Kultur von Makrophagen <ol><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder automatische Zellzähler. </li><li> Platte 1 x 10 6 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte oder 3 × 10 5 Zellen auf Glasdeckgläschen (5 mm) oder Dentinscheiben in 96-Well-Platte gelegt und bei 37 ° C </li><li> Saugen Sie alle Medien, die nicht-adhärenten Zellen und Inkubation Zellen bei 37 ° C mit frischem OCM (+) mit 25 ng / ml Maus M-CSF für 48 Stunden. </li><li> Saugen Sie alle Medien Zellen und Inkubation bei 37 ° C mit frischem OCM (+)-Medien mit 25 ng / ml Maus M-CSF und 30 ng / ml Maus sRANKL Osteoklastogenese zu initiieren. Tanken Medien alle 3 Tage nach Bedarf. </li><li> Zellen wachsenca. 6-8 Tage, um das riesige Mehrkernzellen, die Resorption Knochen zu bilden. Sobald kernige Zellen erscheinen, führen TRAP (Tartrat-resistente saure Phosphatase)-Färbung mit einem kommerziell erhältlichen Kit, und als voll ausgereift, führen Funktionstests. Visualisieren F-Aktin-Ringe auf Deckgläsern mit Phalloidin-Färbung und Bild die Zellen angebracht, um Scheiben durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), wie zuvor beschrieben 19 Dentin. </li></ol></li></ol> 3. Osteoklasten in vitro-Erzeugung aus Menschen PBMCs <ol><li> Isolierung von humanen PBMCs <ol><li> 10 ml vorgewärmten Histopaque-1077 in ein 50-ml-Tube. </li><li> Leere Leukozytenfilter aus Blutbank mit sterilem PBS erhalten in einen 50-ml-Tube (1:1-Verhältnis von Blut mit PBS). Schicht die verdünnte Blut über die Histopaque Lösung sehr langsam, dafür sorgen, dass das Blut nicht mit dem Histopaque mischen. </li><li> Zentrifuge Proben bei 1000 g für 20 min bei 18 ° C. Folgening Zentrifugation sorgfältig isolieren weiß Buffy-Coat-Schicht, die die weißen Blutkörperchen und übertragen auf ein neues 50-ml-Tube. </li><li> Zellen mit PBS verdünnen und Zentrifuge wieder bei 650 g für 5 min, um die Zellen zu sammeln. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in OCM (-) Medien und zählen Zellen mit Zellzähler. </li></ol></li><li> Plating und Kultivierung PBMCs <ol><li> Resuspendieren der Zellen in OCM (+)-Medium und der Platte 8 x 10 6 Zellen / ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte oder 1 x 10 6 Zellen / ml pro Vertiefung in 96-Well-Platte. Platten Zellen auf Glasdeckgläschen (5 mm), die für Immunfluoreszenz-Bildgebung als auch auf Knochenscheiben für Knochenresorption Assays, wie zuvor beschrieben 20 erforderlich. </li><li> Änderung Kulturmedien, Auffüllen der Zellen mit menschlichen M-CSF alle 2-3 Tage oder nach Bedarf. Dann Differenzierungsschritt am Tag 5 gehen durch Zugabe von 30 ng / ml humanes sRANKL zusammen mit 25 ng / ml menschlichen M-CSF in OCM (+)-Medium zu initiieren osteoclastogenesist. </li><li> Wachsen Zellen für ca. 14 bis 21 Tage, um das riesige Mehrkern Zellen zu bilden. Sobald kernige Zellen angezeigt werden, können diese Zellen dann für TRAP beschriftet werden, und als voll ausgereift, können funktionelle Assays durchgeführt werden. F-Actin-Ringe können auf Deckgläsern mit Phalloidin-Färbung sichtbar gemacht werden. Die Morphologie der Zellen in Zellen angebracht, um Scheiben von SEM Dentin untersucht werden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+musculoskeletal+diseases%3A+impact+of+work+disability+and+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+rheumatology.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li>
<li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast%2C+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+%28sODF%29+exhibit+severe+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li>
<li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li>
<li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+tissue+international%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li>
<li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+bone+turnover%2C+bone+marrow+cell+development%2C+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li>
<li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+medicine%22%5BJournal%5D)">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li>
<li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menopausal+transition%3A+analysis+of+LH%2C+FSH%2C+estradiol%2C+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li>
<li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li>
<li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenotropic%2C+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors%3A+dissociation+from+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li>
<li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li>
<li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li>
<li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+deficiency+and+bone+loss%3A+an+inflammatory+tale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li>
<li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li>
<li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li>
<li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+%28ODF%29+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+researc.%2C+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).</li>
<li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis%2C+osteoporosis%2C+cancer%2C+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li>
<li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+osteoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li>
<li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+design%2C+development+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li>
<li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b%3A+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis%2C+osteoclast+formation%2C+and+maintenance+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li>
<li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li>
<li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology%3A+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li>
<li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Erkrankungen des Bewegungsapparats sind die führenden Ursachen von Morbidität und Behinderung und werden von über 150 Krankheiten und Syndrome besteht; Auswirkungen auf heute etwa 90 Millionen Amerikaner. Gelenkentzündungen und Knochenzerstörung wiegen Merkmale Erkrankungen des Bewegungsapparats, einschließlich Arthritis und Osteoporose. Osteoporose ist eine Erkrankung, die Knochen schwächt Integrität, die häufig Frakturen der Knochen führt. Arthritis ist eine chronische, schwächende Erkrankung, die durch Entzündung der...

Muskel-Skelett-Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten und Gegenwart schwerwiegende Folgen für die nationalen und lokalen Gesundheitssysteme ein. Diese Erkrankungen sind durch den Verlust von Knochen-und Gelenkfunktion, die umfangreiche Behandlung und lange Erholungsphasen erfordern gekennzeichnet. Üblicherweise wird eine relative Erhöhung der Anzahl und / oder Aktivität von Osteoklasten, spezialisierte Zellen zu Knochenresorption, Osteoporose und Arthritis beobachtet 2. Unter physiologischen Bedingungen ist die Anzahl und Aktivität von Osteoklasten durch Rezeptor-Aktivator-von Kernfaktor κ-B-Liganden (RANKL), die von Osteoblasten produziert wird geregelt. Osteoprotegerin (OPG), wird ein Köder Rezeptor für RANKL auch durch Osteoblasten 3 erzeugten In-vivo-Tiermodelle, die systemische Überexpression von sRANKL oder Deletion von OPG einzubeziehen sind sehr wertvoll bei Osteoporose-Forschung. Allerdings erfordern diese Verfahren die Herstellung von transgenen Mäusen 4,5. Hier wird eine neuartige AlternativeVerfahren überexprimieren sRANKL für die Untersuchung von Muskel-Skelett-bedingten Erkrankungen beschrieben. Insbesondere Minicircle (MC) DNA-Technologie und hydrodynamischen Versandmethoden wurden verwendet, um Gen-Transfer von sRANKL in vivo zu erreichen und überexprimieren Maus sRANKL systemisch 6. Diese Methode ist auch eine Ergänzung zu anderen in-vivo-Modelle von Osteoporose, wie hormonelle Modulation der Osteoklasten folgenden ovariectomy 7 und diätetische Intervention durch kalziumarme Ernährung 8. Diese Modelle sind sehr nützlich, um verschiedene Aspekte des Bewegungsbedingten Störungen aber sie erfordern chirurgische Verfahren und kann bis zu mehreren Monaten, was mit erheblichen Kosten 9 studieren. Ovariektomierte (OVX) Nagetier-Modell ist ein Modell, bei dem Versuchstier Entfernung der Eierstöcke führt zu Östrogenmangel, wodurch menschliche postmenopausalen Osteoporose 10 imitiert. Menschen postmenopausalen Osteoporose, eine Erkrankung, bei Östrogen deficirenz führt zu einem erhöhten Risiko von Knochenbrüchen und Osteoporose rund acht Millionen Frauen allein in den Vereinigten Staaten. Obwohl die OVX Modell ist nützlich für postmenopausalen Osteoporose bietet begrenzte Vorteile bei der Untersuchung von Osteoporose im Allgemeinen. Östrogen unterdrückt Knochenverlust, durch Induktion von Osteoklasten und Osteoblasten Hemmung der Apoptose, also in seiner Abwesenheit eine erhöhte Aktivität der Osteoklasten beobachtet 10-12. Ein RANKL-OPG-Verhältnis Ungleichgewicht, das die Knochenresorption begünstigt wird auch beobachtet, 13. Jedoch Östrogenmangel in vivo auch begleitet von verringerten Niveaus des transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF β), erhöhte Interleukin-7 (IL-7) und TNF, IL-1 und IL-6 14,15. Da diese Zytokine Knochenumbau modulatorische Funktionen der RANKL Weg unabhängig bekannt ist, ist es unmöglich, eine Osteoklastenaktivierung nur auf die RANKL-RANK-Achse zuzuordnen. Die in diesem Dokument beschriebene Modell ermöglicht es Forschern, in viv studierenRANKL-RANK-o-Achse in Osteoklastogenese und Knochenverlust ohne pro-inflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu OVX Nagetiermodellen. Zusätzlich kann in vitro Osteoklastogenese Techniken sind wesentliche Instrumente zur Aktivierung der Osteoklasten für mögliche therapeutische Behandlungen von Muskel-Skelett-Erkrankungen zu studieren. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass die Kultivierung Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) mit Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und Maus sRANKL können, um die Differenzierung von Osteoklasten 3,16,17 führen. Hier werden die Protokolle kernige Osteoklasten-ähnliche Zellen aus Maus-Knochenmark sowie aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in vitro zu erzeugen 18 beschrieben. Die zellbasierte Assays erforderlich, um eine reife terminal differenzierten und voll funktions Osteoklasten definieren ebenfalls kurz beschrieben. Diese in-vitro-Techniken ergänzen den Roman in vivo Ansatz zusammen und dienen als powerful Untersuchungswerkzeuge, um die Differenzierung von Osteoklasten und Aktivierung zu studieren. Mit Hilfe dieser Systeme sind die Wissenschaftler in der Lage, die Osteoklasten in vivo und in vitro zu erzeugen und definieren Sie die Reize und Signale für ihre Verbreitung und Aktivierung erforderlich sowie testen die Wirksamkeit von pharmakologischen und biologischen Inhibitoren.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Humaner M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Maus M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Humaner RANK-Ligand - löslich</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Maus RANK-Ligand - löslich</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Suspension für Mäuse</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Maus TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP Assay&nbsp;</td><td>immundiagnostische Systeme</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gentransfer-technik und in-vitro- zellbasierte assays für das studium der knochenverlust in skeletterkrankungen

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Die Differenzierung und Aktivierung von Osteoklasten spielt eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von Muskel-Skelett-Erkrankungen, da diese Zellen hauptsächlich an der Knochenresorption beteiligt sind. Osteoklasten können in vitro aus Monozyten-/Makrophagen-Vorläuferzellen in Gegenwart bestimmter Zytokine erzeugt werden, die das Überleben und die Differenzierung fördern. Hier werden sowohl in vivo- als auch in vitro-Techniken demonstriert, die es den Wissenschaftlern ermöglichen, verschiedene Zytokinbeiträge zur Differenzierung, Signalgebung und Aktivierung von Osteoklasten zu untersuchen. Das Minicircle-DNA-Verabreichungs-Gentransfersystem bietet eine alternative Methode zur Etablierung eines Osteoporose-bezogenen Modells, das besonders nützlich ist, um die Wirksamkeit verschiedener pharmakologischer Inhibitoren in vivo zu untersuchen. In ähnlicher Weise ermöglichen In-vitro-Kultivierungsprotokolle zur Herstellung von Osteoklasten aus menschlichen Vorläuferzellen in Gegenwart spezifischer Zytokine den Wissenschaftlern, die Osteoklastogenese in menschlichen Zellen für translationale Anwendungen zu untersuchen. In Kombination haben diese Techniken das Potenzial, die Wirkstoffforschung für osteoklastenspezifische zielgerichtete Therapeutika zu beschleunigen, von denen Millionen von Osteoporose- und Arthritis-Patienten weltweit profitieren können.

Hier wird ein neuartiges Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo Zellkulturprotokolle zur Differenzierung in Osteoklasten-Vorläuferzellen in vitro als ein Verfahren, um die Wirkungen von Cytokinen auf die Entstehung von Osteoclasten zu studieren beschrieben. In Fig. 1 sind die repräsentativen Ergebnisse erfolgreicher Gentransfer von GFP und Maus sRANKL MC in Mäusen gezeigt. In Abbildung 2 sind die repräsentativen Bilder von Knochenmark der Maus ...

Die Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoklasten wird durch Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Hier werden eine neuartige Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo und Zellkulturprotokolle zur Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoklasten in vitro als Methode zur Untersuchung der Auswirkungen von Zytokinen auf die Osteoklastogenese beschrieben.

A Novel In vivo Gentransfer-Technik und In-vitro- Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Das übergeordnete Ziel ist es, über eine neuartige Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo zu berichten. Wir beschreiben auch Zellkulturprotokolle zur Differenzierung von Knochenmarkmakrophagen der Maus von humanem PBMC in Osteoklasten. Dieses Video wird in drei Teile unterteilt.Eine, hydrodynamische Verabreichung von Rang-Flechten-Minikreis, DNA, zwei in vitro Osteoklasten Generation von Maus, Knochenmarkmakrophagen und drei in vitro Osteoklasten Generation von humanem PBMC. Erster Teil, hydrodynamische Abgabe des Mini-Kreises der Rangflechten, DNA. Die folgende Animation zeigt einen kurzen Überblick über die hydrodynamische Verabreichung mittels Schwanzveneninjektion der Maus.Legen Sie die Maus zunächst 10 Minuten lang vor der Injektion unter eine Heatmap. Dadurch werden die Blutgefäße erweitert und die Seitenvenen besser sichtbar. Suchen Sie dann die Injektionsstelle und fahren Sie mit der Injektion fort, wobei Sie darauf achten, dass die Injektion innerhalb von fünf bis sieben Sekunden abgeschlossen ist.Der nächste Teil dieses Videos zeigt eine detailliertere Beschreibung der Verfahren, die an der hydrodynamischen Abgabe über die Mausschwanzvene beteilig

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ein Längs-Untersuchung von Knochenschwund in der Oberschenkel-und Schienbein von erwachsenen Mäusen wurde nach Verletzungen des Rückenmarks mit sequentieller low-dose X-ray-Scans durchgeführt. Tibia Knochenverlust wurde während der Studie festgestellt, während Knochenverlust in den Oberschenkelknochen wurde erst 40 Tage nach der Verletzung festgestellt.

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Knochenverlust nach Rückenmarksverletzungen mit Novel, In vivo Methodology

Tiermodelle werden häufig genutzt, um Krebs Metastasen in Knochen zu untersuchen. In diesem Protokoll werden wir zwei gängige Methoden der Tumorinokulation für Knochenmetastasen Studien beschreiben und beschreiben Sie kurz einige Analysen genutzt werden, um zu überwachen und zu quantifizieren diese Modelle.

Models von Knochenmetastasen

Quantitative Messung der Knochenvorläuferfunktion in Frakturheilung erfordert hohe Auflösung Serienbildtechnologie. Hier werden Protokolle für die Verwendung von Intravitalmikroskopie und Osteo-Linie Tracking Bild sequentiell und Quantifizierung der Migration, Proliferation und Differenzierung der knochenbild endogene Stammzellen / Vorläuferzellen in den Prozess der Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Kombinierte optische und μCT Bildgebung in einem Mausmodell der orthopädischen Implantatinfektion unter Verwendung eines Biolumineszenz-engineered Stamm von Staphylococcus aureus, sofern die Möglichkeit, die Dynamik der bakteriellen Infektion, sowie die entsprechende Entzündungsreaktion und anatomische Veränderungen in den nichtinvasiven und in Längsrichtung zu überwachen Knochen.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Wir beschreiben ein in vivo Protokoll zur Messung der Dorsalflexion des Fußes nach Stimulation des Peroneusnervs und Kontraktion des vorderen cruralen Kompartiments der Hintergliedmaße der Ratte. Solche Messungen sind ein unverzichtbares translationales Werkzeug zur Bewertung der Skelettmuskelpathologie und der Tissue Engineering-Ansätze zur Muskelreparatur und -regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Kleine Laborfische sind zu beliebten Modellen für die Knochenforschung über die Mechanismen, die menschlichen Knochenerkrankungen zugrunde liegen, und für das Screening von knochenmodulierenden Medikamenten geworden. In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Beurteilung der Wirkung von Alendronat auf Knochenzellen bei Medaka-Larven mit osteoporotischen Läsionen.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Das Ziel dieses Protokolls ist eine nackte im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompression Bruch Rattenmodell zu generieren, die längs bewertet in Vivo mit einer parallelisierter Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse werden können.

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Das vorgeschlagene Protokoll beinhaltet einen globalen Ansatz zur Bewertung der Knochenbildung im Rahmen der Knochenregeneration mit Hilfe multimodaler Analysen. Ziel ist es, qualitative und quantitative Informationen über die Knochenneubildung bereitzustellen und so die Strenge und Validität grundlegender und präklinischer Untersuchungen zu verbessern.

Umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell

Das murine Knochenmarkverletzungsmodell ist ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation. Dieses vereinfachte chirurgische Protokoll beschreibt das Verfahren der Knochenmarkablation zur nachgelagerten Beurteilung der Knochenneubildung und der zellulären Reaktionen nach einer Verletzung.

Verbesserte Methodik zur Untersuchung der postnatalen Osteogenese durch intramembranöse Ossifikation in einem murinen Knochenmarkverletzungsmodell

Hier stellen wir einen gentherapeutischen Ansatz vor, bei dem ABE-beschichtetes Chitosan durch intraossäre Injektion direkt ins Knochenmark abgegeben wird.

Verbesserte Genverabreichung und -expression durch intraossäre Injektion von Chitosan-Nanopartikeln, verkapselten Adenin-Base-Editor-Plasmiden

Erfahren Sie eine neuartige Gentransfer-Technik zur Osteoklastendifferenzierung in vivo und zellbasierte Assays in vitro. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Zytokin-Effekten auf die Osteoklastogenese.

A Novel In vivo Gentransfer-Technik und In-vitro- Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

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