Name: Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Lernen Sie die verbesserte Northern-Blot-Methode zur Detektion kleiner RNA-Spezies in Drosophila melanogaster. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Visualisierung von RNA-Expressionsmustern aus Embryonen, Zellen und Geweben.

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Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale unterstützt, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Université de Strasbourg, das Hôpital de Strasbourg, der Verband pour la Recherche sur le Cancer, dem Institut National du Cancer, der Agence Nationale de la Recherche und dem Elsass. Pietro Laneve wurde von der Fondation la Recherche Médicale unterstützt gießen. Derzeit ist er ein Empfänger einer Istituto Italiano Tecnologia (IIT) Gemeinschaft. Publikationskosten werden von der Neurex Netzwerk unterstützt (TriNeuron - Programm Interreg IV Oberrhein)

1. Probenentnahme <ol><li> Lösen halbhaft Schneider 2-Zellen (1-5 × 10 6 Zellen im Durchschnitt), und durch Pipettieren geerntet sie durch Zentrifugation (100 × g für 1 min). Im Falle von in vitro kultivierten adhärenten Zellen, trypsinize sie unter Standardbedingungen oder direkt sammeln sie von den Platten in eine geeignete Menge an RNA-Extraktionsreagenz, mit Hilfe eines Zellschabers. </li><li> Für Embryo-Entnahme, wachsen Drosophila-Stämmen in Flugkäfigen und lassen Embryonen sammeln sich auf Legeplatten. Wischen Embryonen durch einen Pinsel in destilliertem Wasser (dH 2 O), entsorgen Trümmer durch Sieb-Filterung, spülen und erholen Embryonen in einer Ampulle 48. </li><li> Als alternative Technik, manuell zu sezieren Gewebe / Organe. Isolieren Hoden (ein Präferenzsystem für piRNA Analyse) von Drosophila Leib in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter einem Stereomikroskop (Vergrßerung 20X) unter Verwendung von Nadeln oder Dissektion Zange gegenin Sullivan et al 49 ualized. </li><li> Stößel homogenisieren Proben auf der Sucht nach 0,5 Volumen RNA-Extraktion Reagenz. </li></ol> 2. RNA-Extraktion / Analyse <ol><li> Den Anweisungen des Herstellers durchführen RNA-Isolierung durch kommerzielle Reagenzien. VORSICHT! RNA Extraktionsmittel sind in der Regel toxisch und ätzend. Alternativ Anwendung einer Proteinase K-basiertes Protokoll für die RNA-Isolierung 50, wie folgt: <ol><li> Verdünnen Sie die Proben in 400 ul Stop-Mix und Inkubation bei RT für 15 min. </li><li> Recover wasserlöslichen Komponenten durch Standard Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und Chloroform-Extraktionen und Ethanol (EtOH) Fällung / Waschen. Luft trocknen die Proben und resuspendieren in Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelten doppelt destilliertem (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Beurteilen RNA-Konzentration durch UV-photometrische Messung. Auch dafür sorgen, das RNA-Reinheit hoch, in der Nähe von 2.0 ist, based auf der A 260 / A 280 Lesung. </li><li> Überprüfen RNA-Präparation auf denaturierenden Agarose-Gel wie folgt: <ol><li> In einen sauberen Becher löst man 1,2 g Agarose in 82 ml DEPC-ddH 2 O, unter kontinuierlichem Rühren. Kochen, bis vollständig gelöst ist. </li><li> Lassen Sie das Gel Lösung abkühlen; wenn die Temperatur 60 ° C erreicht 10 ml 10X 4-Morpholinpropansulfonsäure hinzufügen (MOPS) Puffer auf 1X Endkonzentration (FC) und 8 ml 37% Formaldehyd zu 3% FC. VORSICHT! Formaldehyd ist krebserregend. </li><li> Gießen Sie das Gel in eine horizontale Elektrophorese-Zelle. Lassen Sie das Gel unter einer Haube für mindestens 1 Stunde fest werden. Nach der Erstarrung, tauchen das Gel in MOPS 1X. </li><li> Aliquoten 2 ug RNA-Probe und 1 ug Ladder (verwenden Sie ein RNA-Marker, wenn genaue Auswertung gewünscht wird). Hinzufügen 3 Volumen Agarose-Ladefarbstoff (ALD), um RNA und Leiter. Wärme bei 70 ° C für 5 min und sofort auf Eis kühlen. CAUTION! Inhalt der ALD (Ethidiumbromid und Formamid, siehe Materialien) sind mutagen und korrosiven sind. </li><li> Legen Sie die Proben und führen Sie das Gel bei 50 V für ca. 1 h mit gelegentlichen Puffer Recycling. Überprüfen Sie die RNA durch UV-Fraktionierung Muster Visualisierung oder Gel Imaging. Erkennen diskrete Banden, die 28S-und 18S-rRNAs und tRNAs (siehe Abbildung 1). </li></ol></li><li> Gehen Sie nach Nord Assay oder speichern RNA bei -80 ° C. </li></ol> 3. Denaturierung Acrylamid-Gel Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine kleine vertikale Elektrophorese-Apparat für diese Fraktionierung Schritt (Plattengröße ca. 8 cm x 9 cm, Kamm Dicke 0,75 mm). </li><li> Montieren Sie saubere Gläser zusammen in einem Gussrahmen. </li><li> Herstellung von 10 ml 10% Acrylamid / Bis-Acrylamid (19: 1)-Lösung in MOPS-1X, 7 M Harnstoff. Unmittelbar vor dem Gießen werden 100 ul 10% Ammoniumpersulfat und 10 ul TEMED und schnell mischen Sie die Lösung. VORSICHT! Acrylamid ist neurotoxischen und krebserregend. </li><li> Gießen Sie das Gel zwischen Glasplatten und legen Sie die gut Kamm vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie das Gel polymerisiert bei Raumtemperatur mindestens 45 min vor der Verwendung. Alternativ speichern Sie das Gel O / N, in Wasser getränkten Filterpapiere eingewickelt und in Frischhaltefolie versiegelt. </li></ol> 4. Probenvorbereitung <ol><li> Aliquot 0,5-20 ug Gesamt-RNA pro Probe. Wenn Volumen 3-4 ul überschreitet, Vakuum trocknen die Probe. </li><li> Für Größenbestimmung, führen Sie einen aliquoten (20-30 cps) von radioaktiv markiertem Low-Range-Leiter parallel zu Proben, als Marker (siehe Abschnitt 4.3 und 4.4 für Vorbereitung). Behandeln Sie es parallel zu Proben, wie in Schritt 4.5 beschrieben. </li><li> Ladder: eine Phosphatvorwärtsreaktion unter Verwendung von 0,1 ug eines 10 bp-Schritt-Leiter eingestellt. Bei 37 ° C für 30 Minuten und stoppt die Reaktion durch Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 20 mM FC. </li><li> Reinige durch EtOH Fällung / Waschen, trocknen undresuspendieren in ddH 2 O (etwa 100 ul). VORSICHT! 32 P ist eine radioaktive Quelle. </li><li> Zu jeder Probe das gleiche Volumen von Acrylamid blauen Farbstoff (ABD). Denaturieren durch Erhitzen bei 80 ° C für 5 min auf Eis und kühlen, bis Belastung. VORSICHT! Formamid (Gehalt in ABD) ist ätzend. </li></ol> 5. Die elektrophoretische Fraktionierung <ol><li> Entfernen Sie die Glasplatten aus der Casting-Unterstützung und richtig montieren sie in der Elektrophorese-Zelle. Füllen inneren und äußeren Kammer mit ausreichender Laufpuffer (RB). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und Vorlauf das Gel bei 200 V für 10 min. Vor dem Laden der Proben, abzuwaschen Harnstoffablagerungen aus den Vertiefungen durch Spritzen einige RB durch eine Spritze. </li><li> Verwenden Sie flache Spitzen sorgfältig stratify Proben aus Schritt 4.5 an der Unterseite von jedem gut. Überprüfen Anode und Kathode Verbindungen zu umgekehrten Lauf zu vermeiden. Nachdem die Proben in das Gel bei 100 V für 5 min, il zu erhöhen, um die Spannung 200 V. </li><li> Für eine Fraktionierung Länge von etwa 7 cm, einer 45 min-Dauer ausreichend. Vermeiden Bromphenolblau (a Tracking Pigment in ABD), um das Gel überlaufen. </li><li> Visualisieren auf-Gel-der fraktionierten lange RNAs durch Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung, als optionaler Schritt: <ol><li> Schneiden Sie 2 cm von der Spitze des Gels und die Scheibe in ddH 2 O. kurz spülen </li><li> Inkubieren Sie die Gel-Scheibe bei RT für 15 min unter leichtem shacking in RB, EtBr 0,5 ug / ml FC. </li><li> Entfärben des Gels für 15 min in RB, visualisieren lange rRNAs durch UV-Bestrahlung oder Gel-Bildgebung. Überprüfen Sie für die RNA-Beladung und Qualität (siehe Abbildung 1, Tafel 7). VORSICHT! Ethidiumbromid ist mutagen. </li></ol></li><li> Unterdessen gehen Lösch den unteren Teil des Gels, die kleine RNA-Spezies. </li></ol> 6. Gel-Blotting <ol><li> Schneiden Sie 6 Stück Löschpapier, um die Blotting Bereich passen und eine äquivalente Stück uncharged Nylon-Membran. Dämpfen Papierbögen, Membran und 2 Schreibunterlagen in RB. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pads vollständig genießen, indem Sie wiederholt drückte sie in RB. </li><li> Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät, und öffnen Sie die Gläser durch Mittel einer Spachtel. Verwenden Sie ein sauberes Schneider, um die Vertiefungen zu entfernen. Legen Sie ein Blatt feuchten Whatman-Papier auf dem Gel und heben es auf. </li><li> Das Nylonmembran auf die freie Fläche des Gels. Markieren eine Ecke, um die Filter nach Probenbeladung zu orientieren. Füllen Sie das &quot;Sandwich&quot; (3 Papierstücke auf jeder Seite). Wirf einen Kunststoffstab auf dem Blot Oberfläche, um mögliche Luftblasen zu entfernen. </li><li> Legen Sie den Fleck zwischen zwei Schreibunterlagen und dann in der Blotting-Kassette. Bauen Sie die Kassette in den Löschmodul, füllen die Kammer mit RB und kontrollieren die korrekte Ausrichtung (Nylonmembran muss zwischen dem Gel und der positive Terminus zu bleiben). </li><li> Transfer bei 20 V für 20 min. Hinweis: Um homogenen Bedingungen zu gewährleisten, nach 10 Minuten öffnen Sie das Löschmodul und rOtate das Sandwich um 180 ° vor dem Abschluss der Übertragung. </li></ol> 7. Membran Vernetzung <ol><li> Bereiten Sie 6 ml frischem Vernetzungslösung (XLS). Tränken Sie ein 10 cm x 10 cm (größer als Nylonmembran) Stück Löschpapier mit XLS. VORSICHT! HCl (eine Komponente von XLS) ist stark ätzend. </li><li> Blot die Demontage und legen Sie die Membran auf dem nassen 3MM Filterpapier. Hinweis: RNA muss nicht in direktem Kontakt mit der gesättigten Papier. Setzen Sie den Filter und Papier zwischen zwei Glasplatten und wickeln in Saran-Wrap. </li><li> Erwärmen die Membran bei 60 ° C für 2 Stunden, gefolgt von einer ddH 2 O Waschen. Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit der Hybridisierung. </li></ol> 8. Membran Prähybridisierung <ol><li> Wenn RNA-Beladung überprüft wurde (optionaler Schritt 5.5), direkt an der Hybridisierung fortfahren. Oder aber, schneiden Sie 1 cm vom Anfang des Nylon-Filter, um die Sondenquer hybridizatio vermeidenns bis fraktionierten lange RNAs. </li><li> Vorwärmkammer 10 ml Hybridisierungslösung (HS) bei 37 ° C aufweist. Denaturieren 1 mg Lachssperma bei 95 ° C für 5 min, cool auf Eis und in den HS. </li><li> Den Filter in HS Inkubation bei 37 ° C für mindestens 1 h unter Rotation in einem Hybridisierungsofen. Überprüfen Sie, dass die RNA-Seite der Filterflächen HS. </li></ol> 9. Sondensynthese <ol><li> Ein Phosphat Vorwärtsreaktion eingestellt auf 10 pmol spezifischer Antisense-Oligonukleotid, wie in 4.3 beschrieben. </li><li> Mit 5 Volumina von Tris-EDTA-NaCl (TEN)-Puffer, um die Reaktion und Reinigung des markierten Primers von nicht eingebauten Nukleotiden durch Gel-Ausschluß-Chromatographie auf G-25 Sephadex-Säulen (oder auch von EtOH-Fällung). Sonde Aktivität kann durch Flüssig-Szintillationszählers beurteilt. </li></ol> 10. Membran Hybridisierung <ol><li> Ersetzen Sie die HS mit einem frischen 10 ml Aliquot (vorbereitet und ergänzt, wie oben beschrieben). Erhitzen Sie die Sonde an95 ° C für 10 min, cool auf Eis und in den neuen HS. Inkubieren des Filters bei 37 ° C auf. </li></ol> 11. Waschen der Membran <ol><li> Wiederherstellen der Hybridisierungslösung und bei -20 ° C in einer Radioaktivität-Abschirmung-Box. </li><li> Spülen Sie die Filter in Waschpuffer (WB) und waschen Sie es gründlich für 10 min bei RT. </li><li> Verwenden Sie ein Geiger Mueller-Detektor zur Überprüfung Restradioaktivität an den Filter Ecken. Wenn Hintergrundemission ist etwa 5 cps, fahren Sie mit Membranexposition. </li></ol> 12. Signalerkennung <ol><li> Setzen Sie den Filter auf Autoradiographie-Filme oder auf einem Molecular Imager-Bildschirm auf. Zeigen Signale, die von der fotografischen Verarbeitung oder Digital-Wandlung. </li><li> Analysieren Sie die Bandenintensität von engagierten Quantifizierungssoftware (ImageJ oder Optiquant). </li></ol> 13. Membran Stripping <ol><li> Um Primärsignale in 500 ml kochendes entkleiden Lösung zu entfernen, tauchen die Membran, Dann bei RT inkubieren für 1 min. Fahren Sie mit Roman (vor)-Hybridisierung oder den Filter bei -20 ° C. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Obwohl unsere Wertschätzung der Feingeist, durch die Verflechtung RNA reguliert die Neurogenese steigt kontinuierlich, die mechanistische Auswirkungen der RNA-basierten Schaltungen beeinflussen neuronalen Stammzellbiologie, die neuronale Differenzierung / Funktionsintegration, Entwicklung von neuronalen Erkrankungen und Krebserkrankungen bleiben unerforscht. Die Pflege solcher Netzwerke durch Reiche macht das Potenzial der genetischen Systemen wie Drosophila melanogaster Instrumental in unerforschte zelluläre S...

RNA Biochemie hat spektakuläre Fortschritte in den vergangenen Jahren erlebt 1. Unser Verständnis von RNA-Potenzial in der Steuerung der Genexpression durch die Identifizierung von nicht-kodierenden leistungsstarke Ribo-Regulatoren 2 gesprengt, durch die Entdeckung von neuartigen RNA-basierte Regulationsmechanismen 3,4 und durch eine tiefere Charakterisierung der bereits bekannten posttranskriptionale Veranstaltungen 5. Alle zusammen haben diese Studien erlaubt RNA Biologie drastisch machen die Szene, zu einem wichtigen Forschungsthema in der aktuellen Wissenschaftslandschaft. Insbesondere in den letzten Jahren sind wir immer ein Gefühl von der allgegenwärtigen Auswirkungen der &quot;RNA-Welt&quot; auf der molekularen Neurobiologie 6, eines der dynamischsten Forschungsbereiche in der modernen Lebenswissenschaften. Im letzten Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts hat sich die wissenschaftliche Gesamtszenario durch die Entdeckung der RNA-Interferenz 7,8 und der kleine regulatorische RNAs 9,10 revolutioniertinsbesondere im Bereich der Mikro-RNAs 11, endogen exprimiert kleinen nicht-kodierenden RNAs in der Kontrolle fast aller zellulären Funktionen als pleiotrope und kombiRegulaToren der Genexpression beteiligt ist. Fast 10 Jahre nach miRNA ersten Entdeckung in Caenorhabditis elegans durch Ambros und Ruvkun-Labors, wurde die Aufmerksamkeit erneut auf das Feld eingeschaltet, wenn eine hohe Zahl von miRNAs wurden in Drosophila und in menschlichen Zellen als auch 12-15 identifiziert. Seitdem dank vielseitiger transgene Ansätze, Drosophila melanogaster hat sich als wertvolle biologische Kontext für das Eintauchen in miRNA Biosynthese und Aktivität stand. Drosophila miRNAs haben unterschiedliche Funktionen in Insektenspezifische oder evolutionär konservierten Prozesse aufgedeckt, die sich vom Altern, den Stoffwechsel, Signalwege , Verhalten und, natürlich, die Neurogenese. Entlang dieser Richtung, die wir vor kurzem eine neuartige Verbindung 16 in die faszinierende Zusammenarbeitrrelation zwischen dem Master-Gen gcm / Gleiten und der RNA-Weg stattfindet. Die Fliege Transkriptionsfaktor Gcm / Glide 17-19 stellt ein einzigartiges Beispiel für das Schicksal der Zelle Determinante, die diktiert die Glia gegen neuronale Schicksal Wahl in multi fliegen neuronalen Vorläufer 20. Zwanzig Jahre lang Forschung zu diesem Thema hat deutlich unterstrichen, das Auftreten von mehreren überlappenden und Eingänge der Genregulation konvergierenden über GCM / gleiten 21-28, die zum Ausgleich der zarte Verhältnis zwischen neuronalen und Gliazellen während der Entwicklung des Nervensystems Kollegen erforderlich Schwellenwerte festzulegen. Wir entdeckten, dass die Verordnung über DMEL-miR279 Targeting stellt eine weitere Steuerungsebene einen Beitrag zur posttranskriptionale Feinabstimmung der GCM / 16 gleiten Ausdruck. Weltweit haben diese Forschungslinien erforderliche spezifische methodische Verbesserungen: entlang Jahren mehrere Technologien, die ursprünglich entwickelt, um zu analysieren traditional RNAs wurden zur Quantifizierung der kleine nicht kodierende RNAs wurden wie umgewandelt, wie RNAse-Schutzassays, cDNA-Arrays 29-31, Echtzeit-PCR-Verfahren 32-35 und Sequenzierung 36,37. Auf der anderen Seite hat Rekalibrierung technische Ansätze kontinuierlichen Fortschritte auf dem Gebiet gefördert. Northern Blot-Assay (NB, oder RNA-Gel-Blot-Test) stellt eine repräsentative Beispiel: Es wird weitgehend eingesetzt, um RNA-Akkumulation Profil, da sie gewährleistet, sowohl quantitative Expressionsniveau sowie Größenbestimmung. Allerdings ist die Eigen geringe Empfindlichkeit der Methode begrenzen, wenn es um den Nieder reichlich Genexpression Feinstimmer wie kurze RNAs angewendet werden kann, ist. Eine nachteilige Folge ist das Erfordernis großer Mengen an Gesamt-RNA, die nur schwer ihre Anwendung auf bestimmte biologische Proben ermöglicht. Aus solchen Gründen bestimmte NB Varianten für kleine RNAs Erkennung entwickelt worden 38-40: wir nutzten eine verbesserte NB procEDURE 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), während die Aufklärung der oben genannten Wechselspiel zwischen DMEL-miR279 und GCM / gleiten. Dieses Verfahren beruht auf einer chemischen Vernetzungsschritt auf der Basis der Aktivität eines Carbodiimid-Derivats [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid, EDC] die Nucleinsäure auf festen Trägern zu fixieren. Carbodiimid ist ein vielseitiges Vernetzer bekannt, die Bildung von Amidbindungen zwischen den aktivierten Carboxy oder Phosphat-und Amingruppen 42 katalysieren. Diese Eigenschaft kann durch die Mono-phosphorylierten 5&#39;-Hydroxylgruppe kovalent paar kleine RNAs ausgenutzt werden, um Gruppen an der Oberfläche der Nylonmembranen Amino ist. Die resultierende Befestigung Konfiguration erhöht die Zugänglichkeit des immobilisierten Nukleinsäure und wiederum die Effizienz der Sonden-Target-Hybridisierung, die in bemerkenswerter Detektionsverstärkung 43 führt. Die Technik übernimmt insbesondere relevance in Drosophila molekulare Studien, mit denen das Auftreten von neuen und unverwechselbaren Klassen von kleinen nicht-kodierenden RNAs 44 entsteht. Unter diesen rasiRNAs 45,46 bilden einen bestimmten Subtyp von Piwi-interacting RNAs (piRNAs 47), in sequenzspezifische Gen-Silencing beteiligt. Operative Details dieses Verfahrens werden im Folgenden vollständig beschrieben und visualisiert, bezogen auf die Analyse der miRNAs DMEL--miR279 und DMEL--miR286 und zum ersten Mal von einem rasiRNA, rasi4. Wir schoben, diese Methode, die es uns erlaubt enthüllt schlecht ausgedrückt Ziele von minimalen Mengen von RNA (weniger als 1 ug) Extreme.

<table><tbody><tr><td>ENDGÜLTIGE ZUSAMMENSETZUNG/NAME</td><td>FIRMENKATALOG</td><td>(Lager)</td><td>KOMMENTARE</td></tr><tr><td colspan="4">ALLGEMEINE ANFORDERUNG</td></tr><tr><td>Zentrifuge, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Dekontaminationsmittel, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Auf Glas/Kunststoff auftragen, abwischen und spülen</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Gefährlich //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">PROBENVORBEREITUNG</td></tr><tr><td>Stereomikroskop, M60</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&nbsp;</td></tr><tr><td>1,8 mM KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA-EXTRAKTION/-ANALYSE</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Horizontales Elektrophoresys, Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Extraktionsreagenz, TRIzol Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Gefährlich</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 für Extraktion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 1:1 für Extraktion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2,5 Vol. für Fällung, 70% für Waschen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>SDS niemals abkühlen lassen, um Ausfällung zu vermeiden //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Retikulozyten-Standardpuffer (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>Denaturierendes Agarose-Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2% Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Lassen Sie das Gel mindestens 1 Std. erstarren //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS-Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M MOPS-Natriumsalz, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>MOPS-Natriumsalz nicht verwechseln mit MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>Agarose-Ladefarbstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS-Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Gefährlich //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Gefährlich //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid (EtBr) 30 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Gefährlich //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Bromphenolblau&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">KLEINE RNA-FRAKTIONIERUNG</td></tr><tr><td>Tipps zum Laden von flachem Gel</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Konzentrator</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Vertikale Elektrophorese, Mini-PROTEISCHE Tetrazelle&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Denaturierendes Acrylamid-Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Acrylamid/Bis-Acrylamid (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Gefährlich. Lassen Sie das Gel vor Gebrauch 45 min polymerisieren 1x</td></tr><tr><td>FSME-Puffer (oder 1x MOPS-Puffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0,1% Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&nbsp;</td></tr><tr><td>0,1 % TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Genruler DNA-Leiter mit ultraniedriger Reichweite (10 bp-Schritte)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Markierung 0,1 μm g, wie in der "Sondenmarkierung"-Reaktion</td></tr><tr><td>Acrylamidblauer Farbstoff beschrieben&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Gefährlich //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td>Laufender Puffer (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS-Puffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alternative RB: 1x TBE Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBE Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Gel-Färbelösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid 0,5 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Gefährlich //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>Fleck für 15 min mit EtBr, entfärben für 15 min ohne EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Whatman Papier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale Nylonmembran, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td colspan="4">CROSSLINKING</td></tr><tr><td>Vernetzungslösung (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-Methylimidazol (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Bereiten Sie immer ein frisches Aliquot von XLS vor //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12,5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Gefährlich //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3,1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRIDISIERUNG</td></tr><tr><td>Flüssigszintillationszähler&nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>Geschorenes Lachssperma, 0,1 mg/ml&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 Anti-Sense-Sonde</td><td></td><td></td><td>5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA</td></tr> <tr><td>Anti-Sense-Sonde</td><td></td><td></td><td>5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279</td></tr> <tr><td>Anti-Sense-Sonde</td><td></td><td></td><td>5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286</td></tr> <tr><td>Anti-Sense-Sonde</td><td></td><td></td><td>5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>, Illustra MicroSpin G-25 Säulen</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Hybridisierungslösung (HS)0,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&nbsp;</td></tr><tr><td>5x Denhardt's Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 M Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&nbsp; 60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt-Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonden-Beschriftung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4 μm; M Oligonukleotid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 μm; l Ci/&mu; l [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Gefährlich //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polynukleotidkinase Puffer</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase 0,5 Einheiten/&mu; l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">WASHING</td></tr><tr><td>Geiger Müller Detektoren</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &ndash; </td><td></td>EM77021</tr><tr><td>Waschpuffer (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stringent Waschpuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2x SSPE, 0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SIGNAL DETECTION</td></tr><tr><td>PharosFX Plus System</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Bild J</td><td>Frei verfügbar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menge One</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röntgenfilme , BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td>Lichtempfindlicher</td></tr><tr><td>Entwickler für Röntgenfilme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Fixierer für Röntgenfilme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">STRIPPING</td></tr><tr><td>Stripping-Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,1 % SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>SDS nach dem Kochen zugeben, um Schaumbildung zu vermeiden //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

verbesserte northern blot detektion von kleinen rna-spezies in drosophila melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Die letzten Jahrzehnte haben die Explosion der wissenschaftlichen Interesse rund um die Genexpression Kontrollmechanismen auf RNA-Ebene erlebt. Dieser Zweig der Molekularbiologie wurde stark durch die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs als Hauptakteure im post-Transkriptionsregulation angeheizt. Solch eine revolutionäre Perspektive wurde begleitet und durch die Entwicklung von leistungsfähigen Technologien für die Profilierung von kurzen RNAs Ausdruck ausgelöst, sowohl auf der Hochdurchsatz-Ebene (genomweiten Identifikation) oder als Single-Kandidat Analyse (steady state Anreicherung von spezifischen Arten). Obwohl mehrere state-of-art-Strategien derzeit zur Dosierung oder zu visualisieren, wie Flucht-Moleküle vorhanden sind, bleibt Northern Blot-Test die zuschussfähigen Ansatz in der Molekularbiologie für die sofortige und genaue Auswertung der RNA-Expression. Es ist ein erster Schritt in Richtung der Anwendung von anspruchsvoller, kostenintensive Technologien und in vielen Fällen bleibt eine bevorzugte Methode, um einfach Einblickein RNA Biologie. Hier Übersicht wir ein effizientes Protokoll (erweitert Northern Blot) zum Erfassen schwach exprimierte microRNAs (oder andere kleine regulatorische RNA-Spezies) von Drosophila melanogaster ganze Embryonen, manuell zerlegt Larven / adulten Geweben oder in vitro kultivierten Zellen. Eine sehr begrenzte Menge an RNA erforderlich ist, und die Verwendung von Material aus der Durchflusszytometrie isoliert Zellen können auch in Betracht gezogen.

Durch Befolgen der im Text beschrieben und schematisch in Abbildung 1 dargestellt Gesamtverfahren, untersuchten wir die Expression von RNAs kleine RNA-Komplex Proben unterschiedlicher Herkunft. In dem Experiment in Abbildung 1 dargestellt, wurde RNA aus Drosophila Schneider 2-Zellen durch Proteinase K-Extraktion, Integrität überprüft isoliert (optionaler Schritt: Denaturierung Agarose-Gel-Fraktionierung) und im Doppel geladen. Eine Hälfte des Gels wurde auf eine neutrale Membra...

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Nachweis der Expression kleiner RNA aus Deano-Gaster-Embryonen oder -Geweben oder -Zellen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst RNA aus den ausgewählten biologischen Quellen extrahiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, RNA durch Elektrophorese entlang eines Acrylamidgels zu fraktionieren, um Migrationsmuster mit niedrigem Molekulargewicht aufzulösen.Als nächstes werden die RNA-Spezies übertragen und chemisch mit einem neutralen festen Träger vernetzt. Der letzte Schritt besteht darin, die Kandidatenmoleküle zu markieren, indem sie mit spezifischen Antisense-Sonden geglüht werden. Letztendlich wird die Autoradiographie verwendet, um Signale aufzudecken, die die Expression der zu analysierenden Moleküle widerspiegeln.Diese unbeantwortete North-Block-Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der RNA-Biologie nicht beantworten, wie z. B. die Steady-State-Niveaus vollständig exprimierter RNA-Moleküle. Um zu beginnen, züchten Drosophila Schneiders zwei Zellen auf eine Dichte von eins bis fünf mal 10 bis zum Sechstel pro Milliliter. Trennen Sie dann die semi-adhärenten Zellen durch Pipettieren und zentrifugieren Sie die

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RNA-Interferenz wurde als sehr effektiv erwiesen, um Genfunktionen in...

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Drosophila ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung von Schlüsselmolekülen, die die Myogenese regulieren. Derzeitige Methoden reichen jedoch nicht aus, um die Dynamik der mRNA-Transkription und die räumliche Verteilung innerhalb der Synzytien zu bestimmen. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode optimiert, die den Nachweis und die Quantifizierung von mRNAs auf Einzelmolekülebene ermöglicht.

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Das Protokoll beschreibt die SNP-FISH-Methode (Single Nucleotide Polymorphisms) zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte, die vom ribosomalen DNA-Locus des X- oder Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster abgeleitet sind.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Dieser Artikel beschreibt ein effizientes Protokoll zur dissektion der imaginären Bandscheiben und zur Färbung von Antikörpern, das mit Reagenzien sparsam ist und den Umgang mit imaginären Bandscheiben in kleinen Mengen erleichtert.

Kleinskalige Dissektion und Antikörperfärbung der Augen-, Antennen- und Flügel-Imaginalscheiben von Drosophila melanogaster

Lernen Sie die verbesserte Northern-Blot-Methode zur Detektion kleiner RNA-Spezies in Drosophila melanogaster. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Visualisierung von RNA-Expressionsmustern aus Embryonen, Zellen und Geweben.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

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