Name: Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Ex-vivo-Kultur fetaler Mäuse-Därme für dreidimensionale Live-Imaging von Zottenentwicklung. Diese Methode ermöglicht die Manipulation von Signalwegen und liefert wertvolle Einblicke in die Darmorganogenese.

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Wir danken Dr. Deborah L. Gumucio als unsere Beraterin und für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Definition der Kultur und der bildgebenden Methoden. Wir danken auch Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dr. Charlotte Mistretta und Dr. Ann Grosse für ihre Beiträge zur Entwicklung des gesamten Darmorgankultursystems. Hilfreiche Diskussionen über die Bildgebung lieferten hervorragende Ratschläge von Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski und Sasha Meshinchi. Die gesamte Bildgebung wurde im Labor für Mikroskopie und Bildanalyse an der University of Michigan durchgeführt. Die finanzielle Unterstützung wurde vom NIH R01 DK065850. bereitgestellt.

HINWEIS: Alle Mäuse wurden mit human Protokolle, die von der University of Michigan Medical School Einheit für Labortiermedizin zugelassen und nach den Richtlinien der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren behandelt. 1. Vollorgankultursystem <ol><li> Herstellung der Medien und Kulturplatten <ol><li> In einer Gewebekultur Haube, entfernen 5 ml BGJb Medien aus der Flasche und 5 ml Pen / Strep. Bereiten Sie einen Arbeitsvorrat von Medien in einem 50 ml konischen Röhrchen, durch Zugabe von 1 ml 5 mg / ml Ascorbinsäure bis 49 ml BGJb Medien (mit Pen / Strep). </li><li> Bereiten Sie eine 6-Loch-Kulturplatte durch Zugabe von 1 ml unter jedem der Transwells. HINWEIS: Wenn alle 6 Transwells nicht verwendet werden, bewegen zusätzlichen Transwells in eine frische sterile 6-Well-Platte für die spätere Verwendung. 3 ml Arbeits BGJb Medien zu jedem der drei 10 cm sterile Petrischalen. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Präparation <ol><li> Weichen Sie sezieren Tools in 70% Ethanolnol und sicher sein, die Werkzeuge sauber zu halten, während der Arbeit. </li><li> Einrichten der Sektionsbereich mit einem großen Eiskübel und platzieren Sie den 6-Loch-Kulturplatte und 10 cm Petrischalen mit BGJb Medien auf Eis. Arbeiten auf Eis, so viel wie möglich, während sezieren und die Vorbereitung der Darm für die Kultur. </li><li> Betäuben erwachsenen weiblichen Mäusen in einer Kammer mit Isofluran (100 ul) vor der Euthanasie durch Genickbruch für die Ernte der fetalen Darm. </li><li> Nach der Ernte der Föten von ihrer Mutter, zu inszenieren jeder Fötus sorgfältig nach dem Theiler Inszenierung Grafik 13. An den Tagen Verlassen Sie sich nicht nach dem Koitus auf das Alter des Fötus als Variationen von bis zu 24 Stunden in Entwicklungsstufe werden routinemäßig in einem einzigen Wurf beobachtet zu bestimmen. </li></ol></li><li> Dissektion der fetalen Darm <ol><li> Euthanize Föten durch Enthauptung vor der Entfernung der Eingeweide. </li><li> Sezieren jeden Darm in 1x Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) und dann place es in eine 10 cm Petrischale mit Arbeits BGJb Medien. </li><li> Die Milz aus dem Magen und die Bauchspeicheldrüse aus dem Magen und Zwölffingerdarm oberen vorsichtig entfernen. </li><li> Trennen Sie vorsichtig das Netz darauf achten, dass die Netz so weit wie möglich und Trenn Verbindungen nur genug befestigt lassen, damit der Darm begradigt werden. HINWEIS: Für Darm älter als E14.5 oder den Personen, die länger als 24 Stunden kultiviert, sanft trennen den Darm in 3 gleich große Segmente zu ermöglichen luminalen Inhalte durch den Darm fließen und von den Schnittenden ausgeschlossen werden. Für Kulturen begannen vor E13.5 warten, bis nach 24 h der Kultivierung vor Abtrennen der 3 Segmente des Darms, damit der Serosa ordnungsgemäß über die Länge des Darms wachsen. </li><li> Verwenden Sie einen Mund pipettieren, um die Darmstücke auf die Transwells von der Kulturplatte (1.1.2) zu übertragen. </li><li> Vorsichtig positionieren den Darm nach Bedarf, so dass sie gerade über die transwell. Hinweis: Wenn der Darm beginnen, sich luminalen Inhalte durch die Röhre, werden alle Knicke im Darm ein Backup und eine Beschädigung des Darmes führen. </li></ol></li><li> Kultur und Behandlung <ol><li> Entfernen Sie die Medien unter dem Transwell, fügen Sie 700 ul der Behandlung Medien (Arbeitsmedien mit Mehr rekombinanten Proteinen oder pharmakologische Inhibitoren) im Rahmen des Transwell. </li><li> Fügen Sie 300 ul Behandlungsmedien tropfenweise auf der Oberseite des Darms und lassen Sie es durch die Transwell einweichen. Positionieren Sie den Darm wie nötig. </li><li> Ändern Behandlungsmedien mindestens einmal täglich oder öfter in Abhängigkeit von der Halbwertszeit des Behandlungs Reagenz. </li></ol></li><li> Herstellung von Protein-Agarose-Kügelchen eingeweicht für eine lokalisierte Quelle der Behandlung Reagenz <ol><li> Resuspendieren der Agarose in ihren Vorratsbehälter und dann 100 ul Agarosekügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Füllen Sie die restliche Volumen des Rohres mit sterilem 1x Phosphate Kochsalzlösung (PBS) und mischen Sie die Perlen, um sie zu waschen. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Rack für ein paar Minuten, damit die Perlen am Boden absetzen und dann pipettieren Sie das PBS von oben auf den Perlen. Füllen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit sterilem 1x PBS und zweimal wiederholen Sie den Waschprozess. </li><li> Vorbereitung für das Protein von Interesse auf das Zweifache der für die Behandlung gewünschten Konzentration. </li><li> Mischen 5 ul gewaschenen Agarose-Kügelchen mit 5 ul der Protein 2x Lager und sanft schütteln die Perlen in das Protein. Das Röhrchen auf Eis für 1 h, vorsichtiges Mischen alle 10-15 min. </li><li> Spülen Sie die Perlen kurz in sterilem 1x PBS, bevor Sie die Perlen auf den Darm. </li></ol></li><li> Platzierung von Agarose-Beads <ol><li> Sanft legen Sie die Agarose-Kügelchen auf der Oberseite der Darm mit Hilfe eines mit dem Mund pipettieren gezogen Kapillarnadeln. Legen Sie die Perlen mit äußerster Vorsicht als grobe Behandlung wird den Darm beschädigen und zu verhindern villus Entwicklung in den verletzten Bereich. </li><li> Legen Sie doppelt so viele Perlen wie für die Analyse benötigt werden, da der Darm wird peristaltische Bewegungen und etwa die Hälfte der Perlen gelegt wird weg von den Darm über die Kultivierungszeit rollen zu unterziehen. </li></ol></li><li> Fixierung von kultivierten Darm <ol><li> Die Behandlungsmedien vorsichtig aus unterhalb des Transwell und lassen den Darm an der Luft trocknen für 3 min. </li><li> 1 ml Fixativ unter der Transwell für 2 min, dann decken die Spitze der Darm mit 2 ml Fixiermittel für den Rest der Fixierungszeit. Fix mit 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C oder für 2 Stunden bei RT. </li></ol></li></ol> 2. Imaging von Fest Darm <ol><li> Wholemount-Bildgebung <ol><li> Stelle sämtliche Darm (mit endogenen Fluoreszenz) auf einem Objektträger mit 100 ul 1x DPBS. Verwenden einer Pinzette vorsichtig arrangieren den Darm. </li><li> Verwenden Sie ein Labor Gewebe vorsichtig die DPBS und sofort 100 l 70% Glycerin, um das Gewebe zu machen mowieder transparent und erhöhen die mögliche Tiefe der Bildgebung. HINWEIS: Wenn ein weiteres Eindringen des Darms gewünscht wird, statt die Montage der Darm in 70% Glycerin, genießen den Darm in ein paar Tropfen von Focus Klare Lösung für 10-30 min. Pipettieren Sie den Fokus Klare Lösung und montieren Sie den Darm mit dem Berg Klar. </li><li> Tauchen Sie jede der vier Ecken eines Deckglases in Knetmasse und holen Sie eine kleine Menge von Ton zu als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas zu verwenden, um das Deckglas aus Abflachung der Darm zu halten. </li><li> Deckglas auf den Objektträger mit geschmolzenem VALAP mit einem Wattestäbchen aufgetragen. </li><li> Bild der Darm entweder aufrecht oder invertiert konfokalen Mikroskop. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Details. </li></ol></li><li> Vibratom Schnitte von Fest Darm (zum Querschnitt der Darmstrukturen) <ol><li> Einbetten Darm in 7% Agarose in kleinen Kunststoffformen (10 x 10 x 15 mm) und damit die Agarose-Blöckeabkühlen und sich verfestigen. </li><li> Entfernen Agarose-Blöcke aus den Kunststoffformen und Leim Agarose-Blöcke auf die Sammlung Vibratom Bühne mit Sekundenkleber. </li><li> Füllen Sie die Sammelphase mit eiskaltem 1x DPBS. </li><li> Zuschnitte mit einer Dicke zwischen 100-150 um. Bei dickeren Abschnitte verwenden Clearing-Lösungen (in Abschnitt 2.1.2 beschrieben) tiefer in den Querschnitt zu visualisieren. </li><li> Pour Vibratom Abschnitte der Sammelstufe in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Lagerung bei 4 ° C ist. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung von festen, Vibratom geschnitten Gewebe <ol><li> Zeigen 5-12 Vibratom Abschnitte pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit 1x DPBS. </li><li> 1x DPBS entfernen und fügen 500 ul Permeabilisierung Lösung pro Vertiefung. Schaukeln die Proben für 25 min bei RT. </li><li> Nach Permeabilisierung, waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS 1x. </li><li> Block die Proben für mindestens 30 min in 500 ul Blockierungslösung. </li><li> Nach dem Blockieren exchange der Blockierungslösung mit 500 ul primäre Antikörper verdünnt in Blockierungslösung und halte die Proben bei 4 ° CO / N. HINWEIS: Die primären Antikörperverdünnungen, die auf gefrorenen und Paraffinschnitten gut funktionieren in der Regel gut auf Vibratom Abschnitte zu, jedoch erfordern Antikörper im Kern Antigen-Retrieval in der Regel nicht gut mit diesem Protokoll (zB BrdU) zu arbeiten. </li><li> Am folgenden Tag, waschen Sie die Proben 3 mal für 15 min mit je Blockierlösung. </li><li> Nach dem Waschen anzuwenden 500 ul des sekundären Antikörpers in Blockierlösung verdünnt. Wickeln Sie die 24-Well-Platte in Alufolie, um die Fluorophore von Licht für 45 min bei RT schützen und rocken die Proben 2 Stunden. </li><li> 3 mal waschen die Proben mit 1x PBS für jeweils 15 min und montieren Sie die Vibratom Abschnitte auf Objektträger, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben. </li></ol></li><li> Montage Vibratom Abschnitte <ol><li> Bereiten Sie Folien für Vibratom Montage durch Schneiden von dünnen Scheiben der Doppel-stick Band und indem sie entlang der langen Seiten der Folien. </li><li> Vorsichtig 5-10 Vibratom Abschnitte zwischen dem doppelseitigem Klebeband auf den Folien in einem Tropfen von 100 ul 1x PBS. </li><li> Entfalten alle Abschnitte und breitete sie in einer einzigen Schicht über die Rutsche. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Agarose oder unebenen Bits, die einen Deckglas aus dem Sitzen Flach verhindern würde. </li><li> Sorgfältig einen Labor Gewebe aus der ganzen Vibratom Abschnitte tanken überschüssige 1x PBS. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen wässrigen Eindeckmedium auf der Oberseite der Vibratom Abschnitte und dann das Deckglas. </li><li> Verschließen Sie die Deckgläser auf die Objektträger mit zerlassener VALAP angewendet mit einem Wattestäbchen. </li><li> Bild die Vibratom Abschnitte entweder aufrecht oder invertiert konfokalen Mikroskop. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Details zur Auswahl eines Abbildungssystems beziehen. </li></ol></li></ol> 3. Live-Imaging von Whole Darm Darm von fetuse geerntets nach E12.5, mit dem angeschlossenen Netz intakt gelassen, erfolgreich zu entwickeln Zotten in Kultur unter Verwendung der oben System. Daher ermöglicht diese ex vivo-System die Erfassung von lebenden z-Schnittbilder der Entwicklungs Darm, die eine dreidimensionale Ansicht der Morphogenese im Laufe der Zeit wieder aufgebaut werden kann. <ol><li> Einrichten Live-Bildgebung <ol><li> Sekundenkleber verwenden, eine individuelle Polycarbonatmembran auf ein feinmaschiges Sieb zu halten. Dies bietet eine Unterstützung Gerüst, um den Darm an Ort und Stelle unter dem Eintauchen Linse des konfokalen Mikroskop aufrecht zu halten. Bitte beachten Sie die Diskussion Abschnitt für weitere Details über die Auswahl der Live-Bildgebung Mikroskope beziehen. </li><li> Legen Sie die Mesh-Bildschirm in der Mitte und einer Kulturplatte. </li><li> Legen Sie die seziert Darm auf die Polycarbonatmembran und einen Tropfen Sekundenkleber an jedem Ende. Verwenden Sie nur ausreichend Leim, um den Darm zu befestigen, aber nicht überziehen es! </li><li> Fügen Kulturmedien frei von Phenol-Rot unter dem PolycarbonatMembran in der Mitte und von der Kulturplatte. </li><li> Wasser hinzufügen, um den äußeren Rand der Kulturplatte gegen Feuchtigkeit bieten. </li><li> Da die fötalen Darm erfährt peristaltische artige Kontraktionswellen in der Kultur wird mit 100 ul einer 1: 5-Lösung von Xylazin in 1x PBS bis 3 ml Medium, um die Bewegung des Darmes während Abbildungs ​​steuern. Diese Dosierung wird Darmbewegungen für etwa 8-10 Stunden ohne Kompromisse villus Entwicklung steuern. </li><li> Für eine Queransicht des Darms, die Live-Darm einbetten in einer 3-4% igen Lösung und schneiden dicke Abschnitte (150-500 um) auf einem Vibratom. Entsprechen die Steifigkeit der Agarose mit der Steifigkeit des Darms geschnitten und empirisch ermittelt die Entwicklungsstadium. Im Allgemeinen wird eine 3% Agarose-Lösung eignet sich gut für Darm jünger als E14.5 und eine 4% ige Lösung funktioniert gut für Darm E15-E16. </li><li> Kleben Sie die Vibratom Abschnitte, um eine Polycarbonatmembran mit einem Mesh-Sieb angebracht (wie in Abschnitt 3.1.1) undKultur, wie in Abschnitt 3.1.2-3.1.6 beschrieben. </li><li> Führen die Echtzeit-Bildgebung unter Verwendung einer Zwei-Photonen konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser zwischen 690-1,040 nm) an einem aufrechten Ständer mit einem abstimmbaren Tabelle. </li><li> Zwei-Photonen-Laser bis 900 nm tiefe Penetration mit der besten Auflösung für GFP-Signale bietet abgestimmt. Es reduziert Schäden an Geweben während Imaging. Darüber hinaus die Einstellung der Leistung des Lasers auf das geringstmögliche Emissions verringert Gewebeschäden. Typischerweise, um eine gute Anregung von GFP zu erhalten, verwenden 12% der Leistung auf der Zwei-Photonen-Laser. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Konflikte offenzulegen.

Die Dynamik und komplexe Gewebe-Wechselwirkungen der Entwicklungs Darm erfordert 3D-Visualisierung, um eine volle Anerkennung dieser morphogenetischen Ereignisse. Mit der Entwicklung der Imaging-Technologie, die Fähigkeit villus Morphogenese im Detail entwickelt / verbessert und mit ihr wird das Verständnis der räumlichen Kommunikation und Interaktion während der Organogenese stark verbessert zu prüfen. Alternative Methoden zur Kultivierung ganze Darm wurden auch getestet worden, aber die Tr...

Jeder Darmzotten besteht aus zwei Hauptgewebekompartimenten: einer epithelialen Oberflächenschicht und einem mesenchymalen Kern. Der Dünndarm der Maus wird am embryonalen Tag 10 gebildet, wenn sich eine Endodermschicht schließt und zu einer Epithelröhre versiegelt, die von mesenchymalen Zellen umgeben ist3. Diese flache Epithelröhre durchläuft eine schnelle Proliferation, wächst sowohl in der Länge als auch im Umfang und erfährt dramatische Umlagerungen, die mit dynamischen Veränderungen der Zellform einhergehen1. Gleichzeitig durchläuft das umgebende Mesenchym auch viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Bildung des Gefäßplexus, der Differenzierung der glatten Muskulatur und der Rekrutierung enterischer Neuronen4. Im proximalen Dünndarm beginnen sich am embryonalen Tag 14.5 Kondensationen (Cluster) von Hedgehog- und PDGF-responsiven Zellen neben dem Epithelzu bilden 2,5. Die Bildung von mesenchymalen Clustern breitet sich weiter über die gesamte Länge des Darms aus, so dass sie am Embryonaltag den gesamten Dünndarm bedecken 16.52. Wenn sich mesenchymale Cluster bilden, beginnen die Epithelzellen, die den Clustern am nächsten liegen, sich aus dem Zellzyklus zurückzuziehen, während sich die anderen Epithelzellen weiter vermehren. Die Zellen direkt über dem mesenchymalen Cluster, die sich aus dem Zellzyklus zurückgezogen haben, beginnen ihre Form zu verändern, wenn sich der entstehende Zotten in das Lumen einknickt. Das weitere Wachstum der Zotten wird zum Teil durch die anhaltende Vermehrung des Epithels zwischen den entstehenden Zotten vorangetrieben. Die mesenchymalen Cluster bleiben fest mit dem Epithel des wachsenden Zottus verbunden und exprimieren weiterhin eine Vielzahl von Signalmolekülen. Die Welle des Zottenaufkommens breitet sich entlang der Länge des Dünndarms aus, nachdem sich mesenchymale Cluster gebildet haben. Wenn der Darm weiter wächst und sich die Intervillusregion zwischen den entstehenden Zotten ausdehnt, bilden sich neue mesenchymale Cluster neben dem Intervillusepithel und es folgen weitere Runden des Zottenaufkommens und -wachstums6.
Die synchronisierte Entwicklung des Epithels und des Mesenchyms ist essentiell für die Morphogenese des Zottens. Signalmoleküle werden von einer Schicht zur anderen sezerniert, wo Rezeptoren die Signalbotschaft empfangen und weiterleiten, um die Entwicklung zwischen Epithel und Mesenchym zu koordinieren. Mesenchymale Cluster fungieren als Signalzentren und exprimieren eine Vielzahl von Entwicklungsmorphogenen7-10. Eine Störung der Clusterbildung oder des Clustermusters führt zum Verlust des Aufkommens und des Musters der Zotten. Die Hemmung des PDGF-Signalwegs führt zu weniger Clustern und weniger Zotten, und die Zotten, die sich bilden, sind nach den abnormalen Clustern unförmig11. Der Verlust des Hedgehog-Signalwegs führt zum vollständigen Verlust der Clusterbildung und zum Versagen des Zottenaufkommens2,12. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Cluster die Entwicklung des Zottenepithels mit seinem mesenchymalen Kern koordinieren.
Mit diesem gesamten Organkultursystem sind wir in der Lage, die Signalübertragung zu verändern, die an der epithelial-mesenchymalen Cluster-Cross-Talk beteiligt ist, um die Rolle dieser Signale bei der Zotten-Morphogenese zu bestimmen. Konfokale optische Schnitte und Rekonstruktionen mit zwei Photonen ermöglichen es, die Clusterbildung und das Aufkommen von Zotten dreidimensional zu visualisieren und die räumlichen Beziehungen zwischen den mesenchymalen Clustern und ihrem darüber liegenden Epithel besser zu verstehen. Wenn wir das Kultursystem auf vier Dimensionen erweitern, können wir Z-Stacks von sich entwickelnden Clustern und Zotten im Laufe der Zeit erfassen und diese Wechselwirkungen beobachten. Letztendlich wird die Fähigkeit, die Entwicklung des Zottens auf diese Weise zu verfolgen und Veränderungen zu beobachten, die mit veränderten Signalen auftreten, das Verständnis der epithelialen mesenchymalen Wechselwirkungen in der Zottenmorphogenese revolutionieren.

<table><tbody><tr><td>Feine Präparierzange</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 Paar</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x sterile Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 60 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>&nbsp; </td><td></td>451007</tr><tr><td>Transwell-Platten, 24 mm Einsätze, 8,0 mm Polycarbonat-Membranen</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>6 Einsätze pro Platte</td></tr><tr><td>BGJb Medien</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000 U/ml Penicillin; 10.000 mg/ml Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A0278</td><td>5 mg/ml Brühe herstellen, filtrieren, aliquotieren und bei -20 &° lagern; C</td></tr><tr><td>Mundpipette (Drummond 1-15 Zoll Absaugrohrbaugruppe)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>Entfernen Sie die Absaugbaugruppe und ersetzen Sie sie durch eine 1.000 &micro; l Pipettenspitze, die als Adapter zum Einstecken einer 6-Zoll-Pasteur-Glaspipette dient.</td></tr><tr><td>6-Zoll-Glaspasteurpipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Ziehnadeln</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td>hergestellt in 1 x PBS, pH bis 7,3</td></tr><tr><td>Kulturplatten</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>Feinmaschiges Edelstahlsieb</td><td>kaufen im Baumarkt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membranen</td><td>Thomas wissenschaftlich&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternativ, schneiden Sie Corning Costar 3428 Membranen von Transwell-Stützen</td></tr> ab <tr><td>Sofortkleberkauf</td><td>im Baumarkt Gel</td><td>basierend vorzugsweise</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm</td><td>Platten Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7% agarose</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A9414</td><td>Vorbereitung w/v in 1x DPBS, Erhitzen zum Auflösen in einem Wasserbad</td></tr><tr><td>minutien pins</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot freie Medien (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Basalmembranmatrix, Wachstumsfaktor reduziert, phenolrotfrei</td></tr><tr><td>3-4% Agarose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414</td><td>vorbereiten w/v in 1x DPBS, Erhitzen, um sich in einem Wasserbad aufzulösen</td></tr><tr><td>Bildgebung des festen Darms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name des Materials/Ausrüstung</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Kauf in der Apotheke</td><td></td><td>zur Herstellung von VALAP verwendet: gleiche Teile Vaseline, Lanolin, Paraffin,</td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L7387</td><td>zur Herstellung von VALAP: zu gleichen Teilen Vaseline, Lanolin, Paraffin</td></tr><tr><td>, Paraffin</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>zur Herstellung von VALAP: zu gleichen Teilen Vaseline, Lanolin, Paraffin</td></tr><tr><td>70% Glycerin in 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus Clear und Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td>kaufen im Kunstbedarfsgeschäft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelklebeband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffformen, 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>Tissue Tek&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Dias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labortuch</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>fusselfreies Tuch für zarte Aufgaben</td></tr><tr><td>Theiler Staging Chart</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ Downloads/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Leica SP5X Konfokalmikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Wird für die Durchführung der Live-Bildgebung verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMI 6000 Standfuß</td><td>Leica</td><td></td><td>Wird für die Durchführung der Live-Bildgebung verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Wässriges Einbettmedium (Prolong Gold)</td><td>Molekulare Sonden&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Name des Materials/der Ausrüstung</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T-8787</td><td>zur Herstellung von Permeabilisierungslösung: 0,5 % Triton X-100 in 1 x PBS</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td></td><td></td><td>zur Herstellung von Blockierungslösung: 4 % Ziegenserum, 0,1 % Tween20 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; Nr. P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

maus fetal ganze darm-system für kultur ex-vivo- manipulation von signalwegen und dreidimensionale live-imaging von zotte entwicklung

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Die meisten morphogenetische Prozesse in der fetalen Darm haben von Dünnschnitten von fixierten Gewebe entnommen worden, die Bereitstellung Schnappschüsse von Veränderungen über die Entwicklungsstadien. Dreidimensionale Informationen aus dünnen Serienschnitten kann eine Herausforderung sein, wegen der Schwierigkeit der Rekonstruktion Serienschnitte perfekt und die Aufrechterhaltung der richtigen Ausrichtung des Gewebes über Serienschnitte zu interpretieren. Jüngsten Erkenntnisse Grosse et al., 2011, die Bedeutung der dreidimensionalen Informationen für das Verständnis der Morphogenese der Entwicklungs Zotten des Darms 1. Dreidimensionale Rekonstruktion des einfach markierten Darmzellen zeigte, dass die Mehrheit der intestinalen Epithelzellen treten sowohl die apikale und basale Oberflächen. Weiterhin dreidimensionale Rekonstruktion des Aktin an der apikalen Oberfläche des Epithels zeigte, dass die Darmlumen kontinuierlich ist und dass die sekundäre Lumen ein Artefakt sectioning. Diese zwei Punkte, zusammen mit dem Nachweis der interkinetic Kernwanderung im Darmepithel, definiert die Entwicklungs Darmepithel als mehrreihigen Epithel und nicht wie bisher angenommen geschichtete 1. Die Fähigkeit, das Epithel dreidimensional beobachten war wegweisend für demonstriert diesen Punkt und die Neudefinition epithelialen Morphogenese in der fetalen Darm. Mit der Entwicklung der Mehrphotonen-Bildgebungstechnik und dreidimensionale Rekonstruktionssoftware, die Fähigkeit zu visualisieren intakt Entwicklungsorgane rasch verbessert. Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht weniger schädliches Eindringen tiefer in Gewebe mit hoher Auflösung. Zwei-Photon-Imaging und 3D-Rekonstruktion der gesamten fötalen Mausdarm in Walton et al., 2012, half, das Muster der Zotten Auswuchs 2 definieren. Hier beschreiben wir eine ganze Organkultursystem, das ex vivo Entwicklung der Zotten und Erweiterungen dieser Kultur-System ermöglicht, damitder Darm dreidimensional in ihrer Entwicklung dargestellt werden.

Kultur ganzer fötaler Explantate Darm ermöglicht die Analyse der Lage, die Verteilung, und die Dauer der Signalmoleküle, die Darmentwicklung zu koordinieren, da dieses System ermöglicht die Bearbeitung der Signalisierungs pharmakologische Reagenzien oder rekombinante Proteine. Die Transwell-Kultursystem (1A, von Walton et al wiedergegeben., 2012) 2 stellt ein Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle, die es ermöglicht, Wirkstoff-oder Protein getränkt Agarosekügelchen auf das Gewebe zu platzie...

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ganze Organkulturen aus embryonalen Därmen von Mäusen ex vivo zu züchten, um so die Modulation der zellulären Signalwege zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst Mausdärme von Föten zwischen dem 12.5. und 18.5. Embryonaltag entnommen werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Darm in eine Transwell-Kultur oder eine lebende Bildgebungskulturplatte zu legen.Als nächstes behandeln Sie den Darm mit Medien, die mit den pharmakologischen Inhibitoren der Zellsignalwege oder -orte hergestellt wurden. Die Aro-Geschwindigkeiten sind mit rekombinanten Proteinen getränkt, um die Zellsignalisierung auf dem Darm zu verändern. Der letzte Schritt besteht darin, die kultivierten Därme entweder in dicken Viomabschnitten oder in Lochhalterungen abzubilden.Letztendlich wird die konfokale Bildgebung mit anschließender dreidimensionaler Rekonstruktion verwendet, um zu visualisieren, wie sich die Modulation der Zellsignalwege auf die Entwicklung der Gewebeschichten während der Zottenbildung ausgewirkt hat. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das embryonale Gewebe sehr empfindlich ist und bei der Disse

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine...

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

Dieser Artikel und das dazugehörige Video präsentieren unser Protokoll zur Erzeugung von Tissue-Engineering-Darm der Maus, mit einem organoiden Einheiten-on-Gerüst Ansatz.

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Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

In diesem Video beschreiben wir die Methodik für den Aufbau eines ex vivo Darmorgankultursystems, um die Wechselwirkungen zwischen Darmgewebefragmenten von Mäusen und spezifischen Darmbakterien zu untersuchen. Die Vorrichtung besteht aus zwei Paaren von Eingangs-Ausgangs-Anschlüssen, wobei das erste das Darmgewebelumen verbindet und die spezifische Bakteriensuspension in dieses zuführt, und das zweite kontinuierlich Medien zu den Vertiefungen  der Vorrichtung zuführt, um die Lebensfähigkeit des...

Ein ex vivo Darmorgankultursystem zur Untersuchung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Wir beschreiben ein in vitro - Protokoll zur Zusammenarbeit Kultur gut microbiome und Darmzotten für einen längeren Zeitraum einen menschlichen Darm-on-a-Chip - microphysiological System.

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken.

Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Erfahren Sie die Ex-vivo-Kultur fetaler Mäuse-Därme für dreidimensionale Live-Imaging von Zottenentwicklung. Diese Methode ermöglicht die Manipulation von Signalwegen und liefert wertvolle Einblicke in die Darmorganogenese.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung (Video) | JoVE Journal

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

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