Name: Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Entdecken Sie multimodale optische Mikroskopie zur Analyse der Gewebemorphologie von Korallenpolypen bei Montastraea annularis und M. faveolata. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Darstellung feiner Strukturen und Pigmentlokalisationen.

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Wir danken Donna Epps, Hhistologin am Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), für ihre kompetente technische Unterstützung bei der Probenvorbereitung und Schnittbildung. Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium des Office of Naval Research an B.W. Fouke (N00014-00-1-0609) unterstützt. Darüber hinaus erhielt C.A.H. Miller Stipendien vom Wanless Fellowship des UIUC Department of Geology, dem Leighton Fund des UIUC Department of Geology und dem Roscoe Jackson Fieldwork Fund des UIUC Department of Geology. Die in diesem Manuskript vorgestellten Interpretationen sind die der Autoren und müssen nicht unbedingt die der gewährenden Institutionen repräsentieren. Wir danken auch dem Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) Labor auf Curaçao für seine Unterstützung und Zusammenarbeit bei der Entnahme der Korallengewebe-Biopsieproben. Wir danken Claudia Lutz, Fachkraft für Medienkommunikation am IGB, für ihre kompetente Sprachkorrektur.

HINWEIS: Reagenzien für Serienblockfläche Imaging von Coral Proben vorbereitet werden 1. Preinfiltration Wax <ol><li> Schmelzen 3,6 g STEARIN Flocken in einem Becherglas. Gut mischen auf einer heißen Platte (60-70 ° C). </li><li> Geben Sie 400 mg des Sudan IV (Wachs Hintergrundfluoreszenz zu minimieren). Gut mischen und warten, bis ein rot transparent Lösung erreicht wird. </li><li> 96 ml heißem hinzufügen geschmolzenem Paraffin (100%) und gut mischen. </li></ol> 1.2) Embedding Wax <ol><li> Schmelzen 7,2 g STEARIN Flocken in ein Becherglas geben und gut mischen auf einer heißen Platte (60-70 ° C). </li><li> Fügen Sie 0,8 g Sudan IV. Gut mischen und warten, bis ein rot transparent Lösung erreicht wird. </li><li> Fügen Paraffin-Granulat (162 g) und mischen, bis Paraffin vollständig schmilzt. </li><li> Fügen Sie 30 g weißes, körniges Vybar und Schmelze vollständig im selben Becher; einmal geschmolzen, zu mischen. </li><li> Lose schließen Sie die Glasflasche mit einem Deckel. Legen Sie die Glasflasche in einem 60 ° C Umluft oven, um die Zutaten in einem flüssigen Zustand zu halten. Führen Sie alle Infiltrationen in diesem Ofen. </li><li> Teilen Sie die Gesamtmenge der 200 ml rotem Wachs in zwei Glasflaschen von je 100 ml. Verwenden Sie eine aliquote Menge für die Infiltration und die andere für die endgültige Einbettung. </li></ol> 1.3) Embedding Coral Gewebe für Serial Blockfläche Imaging <ol><li> Waschen Sie die Korallenpolypen im Feld (SI Video 1) gesammelt und gespeichert (3-6 Monate bei 4-5 ° C in Para) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (3x 5 min) und zu entkalken, wenn bereit, abgebildet werden. Entkalken die Polypen in Excal Lösung für 24 Stunden oder bis, wie die Polypen sind völlig frei von CaCO 3. Inkubieren mehrere entkalkt Korallenpolypen als ein einzelner Block in einer 25, 50, 75 und 100% Ethanol-Serie, gefolgt von 1x Xylolersatz, um die Proben zu entwässern. </li><li> Platzieren der verarbeiteten Polypen in einem vorgeheizten Ofen 65 ° C, die 100% Xylol-Ersatz. Inkubation für 30 min zweimal von Changing bis frische Lösung. Richten Sie die Polypen in der Weise, dass die Spitze der Polypen nach unten zeigt und die Oberseite so flach wie möglich ist. </li><li> Machen Lösungen von 2: 1, 1: 1 und 1: 2 Xylolersatz und preinfiltration Wachs (Schritt 1.1) in 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Inkubieren Korallenpolypen mit diesen drei steigenden Konzentrationen von preinfiltration Wachs, gefolgt von 3x Inkubation in 100% preinfiltration Wachs für 30-60 min jeder Zeit. </li><li> Hinweis: Je nach der Dicke der Proben, Schritte 1.3.1-1.3.5 könnte mit längeren Zeitraum erhöht werden. </li><li> Bewegen Sie die Proben auf die Einbettung Wachs (siehe Schritt 1.2.6) nach 3x Inkubation in 100% preinfiltration Wachs. </li><li> Entfernen Sie die Einbettung Wachs nach 30 min. Ersetzen Sie mit frischen Einbettung Wachs und weiterhin Inkubation für mindestens 4 h bei 65 ° C. </li></ol> 1.4) Einbettung in rotem Wachs <ol><li> Fotografieren Sie den Block (das Edelstahlblech wo das weiße Wachs gelegt und oben auf dem die samweise platziert ist). Dies ist notwendig, denn wenn in dem Wachs eingebettet, wird die Lage der Probe unsichtbar wie die Einbettungs rotem Wachs undurchsichtig ist. </li><li> Legen Sie kleine Tropfen hohen Schmelzpunkt Wachs um den neuen vorgeheizten Edelstahl Einbettung Form und lassen Sie ihn abkühlen. Gießen Sie eine kleine Menge von frisch geschmolzenem Wachs Einbettung von zweiten Behälter, wie in Schritt 1.2.6 angegeben. </li><li> Positionieren Sie den Korallenpolypen schnell nach unten über dem weißen Wachs Punkt, dann ein Kunststoffprobenhalter auf das Edelstahlblech gießen und mehr Einbettung Wachs, so dass das Wachs kommt bis an die Oberfläche der Kunststoffform. </li><li> Nehmen Sie die gesamte Einrichtung von 65 ° C im Ofen und lassen Sie es auf einer Bank oder einem kühlen Oberfläche abkühlen, bis das Wachs komplett aushärtet. </li><li> Das kann dauern 6 Stunden bis zu zwei Tage. Legen Sie den Block in einem Kühlschrank bei 4 ° C getrocknet, vor Licht geschützt, zur Langzeitlagerung. </li></ol> 1.5) Schnitte an der seriellen Blockfläche einrichten <ol><li> Trim der Block und geschnitten 1 um Abschnitte mit Hilfe eines Mikrotoms. Sammeln Sie nicht die Abschnitte, wie sie wie Pulver zu werden. Denken Sie daran, wir sind bildgebende nur die Blockfläche. Die Probe wird angezeigt, wenn das weiße Wachs beginnt zu verschwinden. </li><li> Machen Sie Bilder von der glatten Blockfläche, die die Probe jedes Mal ein Abschnitt entfernt enthält. Fortfahren, bis die Korallen Polypen verschwindet wie in SI Video 2. </li><li> Record / Erfassen Sie die Bilder mit einem Monochrom-Kamera mit einem fluoreszierenden FITC-Filter zu holen die Autofluoreszenz der Chromatophoren / Korallenpolypen. Bild 3-4 entkalkt Kerne aus einzelnen Arten. </li></ol> 2. Imaging Korallen unter zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Fix Korallenpolyp Kerne, die jeweils etwa 10-12 Polypen etwa einen Zentimeter im Durchmesser, in 4% Para am Ort der Sammlung (Küste), sobald sie unter Wasser geerntet. </li><li> Halten Proben bei 4 ° C bis zur Bildgebung. Gewaschen Kerne werden in th platzierte gleiche Lösung auf den Kopf in einem Deckglas Bodenschale (0,17 mm dick). </li><li> Mit Hilfe eines Zwei-Photonen-Laser bei 780 nm Anregung, Bild 3-4 Polypen bei zwei unterschiedlichen Vergrößerungen (Digitalzoom) mit einem 10-fach (0,3 NA) Ziel. Die Korallenpolyp Form und Höhe variiert zwischen den Proben (in der Regel 1-2 mm) und der Abbildungstiefe auch von den Arbeitsabstand des Abbildungsobjektivs beschränkt. </li><li> Verwenden Sie die Kachel-Scan-Modus auf etwa 25-100 (5 x 5 oder 10 x 10 Fliesen) mit 10 oder 20 um Intervall sammeln Bilder pro Brennebene in xy und 50-100 Bilder durch die z-Achse, in Höhe von rund 5.000-10.000 images / Korallenpolypen. </li><li> Bild drei vor vier Polypen Bereichen einen Kern und Korallenarten darstellen. HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit variiert zwischen 2-5 h / Polypen-Bereich. </li><li> Speichern Sie alle Bilder im RAW-Datenformat auf der Festplatte des Systems als LSM 5. Render 3D in einem 3D-Bildanalyse und Rendering-Software. </li></ol> 3. 3D Volume Rendering und Visualization der SBFI und Zwei-Photonen-Fluoreszenzdaten Spectral <ol><li> Schneiden Sie das 2D-Daten, um die Dateigröße durch die Konzentration auf einen einzigen Polypen mit dem Quadrat Zuschneidetool im Programm reduzieren und kompilieren als einzelne TIFF-Datei (auch eine Verringerung der Dateigröße durch Speichern der Datei in 8-Bit-Format) in der Erfassungssoftware. </li><li> Öffnen Sie die Dateien zusammengefügt der SBFI Daten (in Schritt 1.5.1 gesammelt) oder die Fliesen mehrere z-Stapel von Zwei-Photonen-optische Schnitte (in Schritt 2.1.4 gesammelt) im Programm Imaris Surpass Modul unter Volumen-Algorithmus. </li><li> Projekt Das SBFI Daten in 3D mit einem Schattenprojektion gemacht. Neues isosurface Modus, in dem die Voxel Schwellenwert, um eine feste Oberflächenmuster (SI Video 3) erstellen. </li><li> Visualisierung der 3D-Projektionen mit einem Clipping-Ebene Algorithmus bei XY, XZ und YZ orthogonalen Modi, um 3D-Struktur und Form der Korallen zu offenbaren. </li><li> Animieren Sie die Projektionen mit einem Keyframe-Animation-Modul in der gleichen Imaris Programm (SI ViDEOS 3-7). </li><li> Video-Dateien zu erzeugen, bei 5% Kompression und erzeugen eine Film-Clips im AVI-Format mit Volumen (SI Videos 4 und 6), 3D und Isosurface Modalitäten (SI Videos 5 und 7). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Korallenriff Forschung ist ein interdisziplinäres Forschungsanstrengungen, mit der gleichzeitigen Analyse physikalischen, chemischen und biologischen Phänomene, die in der Meeresumwelt betrieben werden. Die Studie von komplexen Korallenriff-Ökosysteme ist daher am besten innerhalb von ein &quot;Powers of Ten&quot; kontextuellen Rahmen (Abbildung 10) abgeschlossen. Diese Grafik zeigt, dass die Zusammenstellung Korallen Ökosystem umfasst eine breite Palette von Raumdimensionen (10 -9 bis 10 <su...

Die globale Erwärmung und begleitenden Umweltveränderungen werden direkt, die die Gesundheit und die Verteilung der tropischen Meereskorallen 1-4. Mehreren Stößen eingehalten werden, einschließlich der Korallenbleiche und die Entstehung von Infektionskrankheiten 5-6. Allerdings werden genauere Vorhersage der Zukunft Korallen Reaktion auf diese Umweltbedrohungen erfordern, dass eine histologische &quot;Baseline&quot; eingerichtet werden, die Gewebemorphologie und Zellzusammensetzung und Verteilung für &quot;scheinbar gesunden&quot; Korallen definiert. Im Gegenzug &quot;belastet&quot; Korallen können dann quantitativ verglichen werden. Außerdem sollte diese Basislinie für die scheinbar gesunden Korallen unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen festgelegt werden, so dass &quot;gesunde Reaktion&quot; kann auch über Umwelt Gradienten gemessen werden. Als ersten Schritt in Richtung Etablierung dieser Grundlinie, hat eine hochauflösende 3D-Studie, wie scheinbar gesunden Korallenpolyp Gewebe durchgeführt wordenMorphologie und zelluläre Zusammensetzung reagiert auf Anstieg der Wassertiefe (WD) und begleitende Abnahme der Sonneneinstrahlung Bestrahlungsstärke. Ergebnisse können dann verwendet werden, um ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen Korallen Anpassung zu schaffen, sowie einen Einblick in die Korallen-Symbionten Entwicklung und die Verbesserung der Lichtsammel zu gewinnen. Steinkorallen (Scleractinia) sind Kolonialmarinewirbellose Tiere, die Gastgeber für eine komplexe Ansammlung von anderen Mikroorganismen, die gemeinsam als die Korallen holobiont 7-10 bezeichnet spielen. Die Forschung in der vorliegenden Studie durchgeführt, soll eine Reihe von innovativen Imaging-Technologien nutzen, um gleichzeitig zu verfolgen Änderungen mit zunehmender Wassertiefe in den Gewebe Pigmente und symbiotischen Zooxanthellen von scheinbar gesunden Wirtskorallen. Dadurch werden die erforderlichen vergleichenden Gewebezelle &quot;Baseline&quot; über eine bathymetrischen Gradienten für scheinbar gesunde Korallen und als Indikatoren von Korallen hea etablierenlth 10. Coral Pigmente, genannt Chromatophoren, zu handeln, um absorbieren, reflektieren, streuen, brechen, beugen, oder auf andere Weise mit einfallenden Sonnenstrahlung 11 stören. Die Zooxanthellen-Chromatophoren endosymbiontischen Beziehung hat die Koevolution von strategisch vorteilhafte Lichtsammel Optimierung und Skelettwachstumsstrategien sowie trophische Plastizität (Verschiebung Fütterungsstrategien hin-und her, um aus Autotrophie Heterotrophie) für die Korallen Tier 12 freigegeben. Die südliche Karibik-Insel Nation von Curaçao (früher Teil der Niederländischen Antillen) liegt etwa 65 km nördlich von Venezuela in der Ost-West verlaufenden Aruba-La Blanquilla Archipel (Abbildung 1A). Die 70 km lange Südküste von Curaçao beinhaltet eine kontinuierliche moderne und Miozän-Pliozän-Pleistozän-Holozän alten Korallenriff-Darm-Trakt 13,14. Die durchschnittliche Jahres SST auf Curaçao variiert etwa 3 ° C einnually, von einem Minimum von 26 ° C im Ende Januar zu einem Maximum von 29 ° C im Anfang September mit einer Jahresdurchschnittstemperatur von 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Das Korallenriff an der Playa Kalki (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot; W), in der Nähe der nordwestlichen Spitze der Curaçao (Abbildung 1A) liegen, wurde für die Probenahme gewählt, weil es vorher gut untersuchte und das war marine Ökosystem an diesem Standort wird in frischem Meerwasser nonpolluted 7,15-19 gebadet. . Zwei eng verwandte Arten Steinkoralle, M. annularis und M faveolata wurden für Experimente und Analysen in dieser Studie ausgewählt, da jede Spezies: (1) zeigt deutlich unterschiedliche und nicht überlappende bathymetrische Distributionen auf dem Riff-Darm-Trakt in Bezug auf die Schelfkante und die verbunden Carbonat Sedimentablagerungsräume (M. annularis Bereich = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; 1B, 2A, 2B und); (2) ist ein gemeinsames Korallenriff Rahmen Bauer in der ganzen Karibik 21; und (3) gut untersuchten ökologischen, physiologischen und evolutionären Beziehungen 22. Feld Probenahme für die vorliegende Studie wurde unter Verwendung von Standardtechniken Tauchen Playa Kalki Offshore auf Curaçao durchgeführt. Ein flacher zu tiefen Wasser bathymetrische Transekt wurde gegründet, die sich über dem Regal lief, über die Schelfkante, und in die tiefen Wasser Vordergrund Riff-Umgebungen. (1) drei Einzel ~ 1 m Durchmesser Korallen von M.: scheinbar gesunden Korallen wurden dann für die Probenahme entlang dieser bathymetrische Transekt einschließlich identifiziert, annularis, von denen alle in 5 m Wassertiefe (WD); und (2) drei Einzel ~ 1 m Durchmesser Korallen von M. faveolata, von denen alle bei 12 m WD. Photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) wurde als 33-36% P gemessenAR bei 5 m WD und 18-22% PAR 10 m WD. Probenahme wurde im Januar durchgeführt, wenn der SST betrug 26 ° C bei den Wassertiefen sowohl der 5 m und 12 m. Jede dieser sechs Korallen wurde in dreifacher Ausfertigung bei äquivalenten Raumpositionen abgetastet (dh., Etwa 45 ° nördlicher Breite auf jeder der sechs halbkugelförmigen Korallenköpfen). Jede einzelne Probe bestand aus einer 2,5 cm Durchmesser Korallengewebe-Skelett Stanzbiopsie, die mit einem Schlag gereinigt Bogen gesammelt wurde. Drei Korallengewebe-Skelett-Biopsien wurden auf Standard-SCUBA mit Handschuhen aus jeder der Korallen abgetastet (9 von M. annularis Kolonien in 5 m WD und 9 von M. faveolata bei 12 m WD). Unmittelbar nach Sammlung der Tiefe wurde jede Biopsie Kernprobe in ein steriles 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, mit Schraubverschluss verschlossen und wieder an die Oberfläche. Das Meerwasser wurde aus jedem Zentrifugenröhrchen dekantiert und jeder Kern-Biopsie wurde dann eingetaucht, gespeichert und in 4% Paraformaldehyd transportiert. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; SBFI Abbildungs ​​zuvor auf eine Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich Ganzhirn-und Vollherz menschlichen Geweben, intakten Mausembryonen, Zebrafischembryos, und mehrere Arten von tierischen Proben mit intakten Knochen 23-30 durchgeführt. Die meisten dieser Studien genutzt optisch / Lichtmikroskopie mit entweder Fluoreszenz oder Hellfeld-Techniken. Studien haben jedoch bei ultra-hohen Vergrößerungen mit Rasterelektronen-Serienblock Gesicht Bildgebung in der Vergangenheit 31 durchgeführt worden. In der vorliegenden Studie wurde eine modifizierte SBFI Protokoll entwickelt worden und Korallen zum ersten Mal angewendet. Da M. annularis und M. faveolata Korallenpolypen sind 1-2 mm in der Dicke, würde keine der Routine Lichtmikroskopie-Techniken der Lage sein, zu durchdringen die gesamte Dicke der Korallenpolypen Gewebe. Deshalb haben wir SBFI Probenvorbereitung Protokoll speziell für Korallenproben konzipiert. Darüber hinaus haben wir kunden ein Stereomikroskop Halter entwickelt, Die motorisiert ist, in beiden Richtungen x und y zu bewegen. Diese Vorrichtung nimmt Bilder der Blockseitenfläche der Probe zu sammeln, anstatt die Abschnitte unter Verwendung eines Mikrotoms in regelmäßigen vor dem Mikroskop. Wir führten auch eine andere nichtlineare optische Zwei-Photonen-mikroskopische Technik, um Bild die gleichen Korallenpolypen über die gesamte Dicke der Korallengewebe. Dies überwindet die Beschränkungen von SBFI in Bezug Entkalkung und der Möglichkeit von Veränderungen der Gewebemorphologie und des Volumens (Schrumpfung), die durch die Probenvorbereitung (Dehydratation) und Verarbeitungsprotokolle induziert werden können auferlegt. Außerdem wurden die Emissionsprofile von den Korallen spektral aufgelöst, ihre Spitzenemissionen und Variationen zwischen den Chromatophoren und der photosynthetischen Zooxanthellen identifizieren. Diese Ergebnisse wurden im Rahmen der verwendeten Methode und ihre individuellen Vorteile in Bezug auf Akquisitionszeit, Analysezeit, und die Fähigkeit, feine Strukturdetails, ohne Kompromisse zu lösen str bewertetuctural Integrität des Korallengewebe.

<table><tbody><tr><td>Korallengewebe Skelett</td><td></td><td></td><td>2,5 cm Biopsie aus natürlichem Lebensraum</td></tr><tr><td>Arch Punch Coring Device</td><td>C.S. Osborne and Company</td><td>No. 149</td><td>Für die Sammlung von Korallenbiopsie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>RT 15700</td><td>16% Vorverdünnt</td></tr><tr><td>Histoclear/Safeclear II</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>RT 64111-04</td><td>Ungiftige Alternative zu Xylol, Dehydrierung und Deparafinisierung</td></tr><tr><td>Xylol und Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Dehydrierung</td></tr><tr><td>Paraffinwachs</td><td>Richard Allen Scientific</td><td>Typ H REF 8338</td><td>Infiltrationslösung</td></tr><tr><td>Vybar</td><td>The Candle Maker</td><td></td><td>Komponente von Red</td></tr><tr><td>Wax Stearin</td><td>The Candle Maker</td><td></td><td>Komponente von Red Wax</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Fisher Chemical</td><td>S667-25</td><td>Roter wachsundurchsichtiger Hintergrund</td></tr><tr><td>Weizenkeim-Agglutinin (WGA)</td><td>Life Technologies</td><td>W32466</td><td>Für die Etikettierung&nbsp; Coral Mucus</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36095</td><td>Anti-Fade-Einbettmedien</td></tr><tr><td>Fluoro Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD-35-100</td><td>Für die Zwei-Photonen-Bildgebung</td></tr><tr><td>XY-Motor, Treiber und Controller</td><td>Lin Engineering</td><td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td><td>XY Translationsbewegung</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Corning</td><td>DC-220</td><td>Schmelzen des gesamten Wachses</td></tr><tr><td>Konvektionsofen</td><td>Yamato</td><td>DX-600</td><td>Infiltration und Einbettung</td></tr><tr><td>Gewebeprozessor</td><td>Leica</td><td>ASP 300</td><td>Dehydration, Infiltration</td></tr><tr><td></td><td>Mikrotom Leica</td><td>RM2055</td><td>Einwegmesser</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereolumar V 12</td><td>1,5x (30 mm WD) Objektiv</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit ApoTome</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td><td>Imaging Dünnschliff eines Polypen: Zooxanthellen</td></tr><tr><td>Axiocam Kamera</td><td>Carl Zeiss</td><td>MRm</td><td>Monochrome Kamera 1388x1040 Pixel</td></tr><tr><td>Axiovision Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Version 4.8</td><td>Bildaufnahmeprogramm</td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Laser</td><td>Spectraphysics</td><td>Maitai eHP, gepulster Laser (70 fs)</td><td>Mit DeepSee-Modul</td></tr><tr><td>Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710 mit Spektraldetektor</td><td>34-Kanal-PMT-Detektion</td></tr><tr><td>Zen-Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>2010 oder höher</td><td>für Zwei-Photonen- und spektrale Bilderfassung</td></tr><tr><td>Imaris Suite Software</td><td>Bitplane, Inc.,</td> <td>Version 7.0 oder höher</td><td>3D-Volumen, Iso-Oberflächen-Rendering, Visualisierung</td></tr></tbody></table>

multimodale optische mikroskopie methoden reveal polyp gewebemorphologie und struktur in der karibik korallen-riff-gebäude

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewendet, um die dreidimensionale (3D) Morphologie und Zellstruktur der Polyp Gewebe, die die Karibik Riff Gebäude Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Diese Ansätze sind Fluoreszenzmikroskopie (FM), serielle Blockfläche Bildgebung (SBFI) und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen (TPLSM). SBFI bietet tiefe Gewebe-Bildgebung nach körperlicher Schnitte; es beschreibt die Gewebeoberfläche Textur und 3D-Visualisierung, um Gewebetiefen von mehr als 2 mm. Ergänzende FM und TPLSM Ausbeute ultra-hochauflösende Bilder von Gewebezellstruktur. Ergebnisse: (1) bisher nicht gemeldet gelappten Gewebe identifiziert Morphologien an der Außenwand der einzelnen Korallenpolypen und (2) hat die ersten Oberflächenkarten der 3D-Verteilung und Gewebedichte von Chromatophoren und Algen-wie Dinoflagellaten Zooxanthellen Endosymbionten. Spektrale Absorptions Erbseks von 500 nm und 675 nm, legen nahe, dass M. annularis und M. faveolata enthalten ähnliche Arten von Chlorophyll und Chromatophoren. Allerdings, M. annularis und M. faveolata signifikante Unterschiede in der Gewebedichte und 3D-Verteilung dieser Schlüssel zellulären Komponenten. Diese Studie mit Schwerpunkt auf bildgebenden Verfahren zeigt, dass SBFI ist äußerst nützlich für die Analyse großer mm-Skala Proben entkalkt Korallengewebe. Kostenlose FM und TPLSM zeigen subtile Submillimeter Skala Veränderungen der zellulären Verteilung und Dichte in nondecalcified Korallen Gewebeproben. Die Technik erlaubt TPLSM: (1) minimal-invasive Probenvorbereitung, (2) überlegene optische Schnitte Fähigkeit, und (3) minimale Lichtabsorption und Streuung, während immer noch erlaubt tiefe Gewebe-Bildgebung.

Ein kundenspezifisches SBFI Gerät (speziell für die vorliegende Studie hergestellt; Abbildung 3) produzierte die ersten detaillierten 3D-Karten mit plastischer Höhen (DHM) der äußeren Oberflächenstruktur und die Morphologie des M. annularis und M. faveolature Korallenpolypen (Abbildung 4 und SI Videos 1-2). Dies ergab Bilder von bisher nicht beschriebene gestapelt Lappen Korallengewebe konzentrisch nach außen strahlenförmig von der Mitte jeder Polyp <s...

Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewandt, um Polypen Morphologie und Gewebestruktur in der Karibik Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Fluoreszenz, Serienblock Gesicht und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen haben gelappten Struktur, Polypen Wände, und die geschätzte Chromatophoren und Zooxanthellen Dichten und Verteilungen identifiziert.

Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein bis zwei Millimeter dicke Korallenpolypen in 3D abzubilden, um die Feinstruktur sowie die Korallenpigmente und deren Lokalisierung zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Probe zuerst in Wachs eingebettet und dann mit einem Mikrotom in Ein-Mikrometer-Abschnitte geschnitten wird. Als nächstes wird eine speziell entwickelte serielle Blockflächentechnik verwendet, um die Korallenpolypen abzubilden und das 3D-Bild zu rekonstruieren.Unter Verwendung mehrerer 2D-Bilder werden Ergebnisse erzielt, die die Fähigkeit der Technik zeigen, feine strukturelle Details des Korallengewebes aufzulösen, ohne seine strukturelle Integrität zu beeinträchtigen. Demonstration des Verfahrens. Heute wird Dr. Maunde Siva Guru sein, ein Mitarbeiter meiner Forschungsgruppe.Zur Herstellung des Vorfiltrationswachses 3,6 Gramm Ochse in Flocken in einem Glasbecherglas auf einer heißen Platte schmelzen. Als nächstes fügen Sie 400 Milligramm Sudan hinzu. Vier, um die Fluoreszenz des Wachshintergrunds zu minimieren, gut mischen und warten, bis eine rote durchscheinende Lösung erreicht ist.Dann 81 Gramm Paraffin hinzufügen und gut vermischen. Anschließen

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Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Der Aufbau und die Verwendung eines multimodalen Mikroendoskops wird beschrieben, das oberflächliche Gewebebilddaten mit gewebephysiologischen Parametern wie Hämoglobinkonzentration, Melaninkonzentration und Sauerstoffsättigung koregistrieren kann. Diese Technik kann für die Beurteilung der Gewebestruktur und -perfusion nützlich sein und für die individuellen Bedürfnisse des Untersuchers optimiert werden.

Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; Gewebeanalyse

Wir demonstrieren die Verwendung verschiedener Mikroskopiemethoden, die nützlich sind, um die Verkalkung eines Röhrenwurms, Hydroides elegans, zu beobachten sowie das erste verkalkte Material zu lokalisieren und zu charakterisieren. Lebendmikroskopie und Elektronenmikroskopie werden zusammen verwendet, um funktionelle und materielle Informationen zu liefern, die für die Untersuchung der Biomineralisation wichtig sind.

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Durchführung von Unterwasser-Structure-from-Motion-Photogrammetrie-Vermessungen zur Erstellung von 3D-Modellen und Orthomosaiken.

Eine Feldeinführung für die Überwachung benthischer Ökosysteme mittels Structure-from-Motion-Photogrammetrie

Polypen-Bail-out ist ein Prozess, der durch akuten Stress induziert wird, bei dem Korallenpolypen das Gewebe verdauen, das sie mit ihrer Kolonie verbindet, und sich von ihr lösen, um als Individuen zu leben. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie die Mikrovermehrung von Korallen durch Bail-out mit hypersalinen oder kalziumfreien Meerwasserbehandlungen induziert werden kann.

Induktion der Polypenrettung in Korallenkolonien, um individualisierte Mikropropagate für den experimentellen Laboreinsatz zu erhalten

Festgemachte geodätische Strukturen in der Mitte des Wassers, die als Korallenarchen bezeichnet werden, bieten eine modulare, skalierbare und vertikal einstellbare Forschungsplattform, mit der Korallenriffgemeinschaften in zuvor nicht funktionierenden Gebieten, einschließlich Offshore, aufgebaut, überwacht und gestört werden können.

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Physiologische Charakterisierung des Korallenholobionten mit einem neuen Mikro-Respirometrie-Tool

Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.

Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben

Hier wird ein Protokoll für die Erfassung und Verarbeitung von Unterwasser-Photogrammetriedaten vorgestellt, einschließlich einer deutlich vereinfachten und vollautomatischen Bildverarbeitungspipeline, die zu georeferenzierten und zeitreihenausgerichteten Ausgaben führt, die für die Extraktion, Analyse und Anwendung ökologischer Daten bereit sind.

Reefshape: Ein System zur effizienten Erfassung und automatisierten Verarbeitung von Zeitreihen-Unterwasserphotogrammetriedaten für das Monitoring benthischer Lebensräume

Dieses Protokoll umfasst eine vierstufige großflächige bildgebende Erhebungsmethode, die zur Extraktion von Metriken der strukturellen Komplexität, der Zusammensetzung der Gemeinschaft und der Populationsdemografie für Korallenriffgemeinschaften verwendet wird. Die Qualität der erfassten Bilder und der integrierte Zugriff auf die Quellbilder werden in jedem Schritt des Protokolls priorisiert.

Messung der Struktur, Zusammensetzung und Veränderung von Unterwasserumgebungen mit großflächiger Bildgebung

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Entdecken Sie multimodale optische Mikroskopie zur Analyse der Gewebemorphologie von Korallenpolypen bei Montastraea annularis und M. faveolata. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Darstellung feiner Strukturen und Pigmentlokalisationen.

Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

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