Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein bis zwei Millimeter dicke Korallenpolypen in 3D abzubilden, um die Feinstruktur sowie die Korallenpigmente und deren Lokalisierung zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Probe zuerst in Wachs eingebettet und dann mit einem Mikrotom in Ein-Mikrometer-Abschnitte geschnitten wird. Als nächstes wird eine speziell entwickelte serielle Blockflächentechnik verwendet, um die Korallenpolypen abzubilden und das 3D-Bild zu rekonstruieren.

Unter Verwendung mehrerer 2D-Bilder werden Ergebnisse erzielt, die die Fähigkeit der Technik zeigen, feine strukturelle Details des Korallengewebes aufzulösen, ohne seine strukturelle Integrität zu beeinträchtigen. Demonstration des Verfahrens. Heute wird Dr. Maunde Siva Guru sein, ein Mitarbeiter meiner Forschungsgruppe.

Zur Herstellung des Vorfiltrationswachses 3,6 Gramm Ochse in Flocken in einem Glasbecherglas auf einer heißen Platte schmelzen. Als nächstes fügen Sie 400 Milligramm Sudan hinzu. Vier, um die Fluoreszenz des Wachshintergrunds zu minimieren, gut mischen und warten, bis eine rote durchscheinende Lösung erreicht ist.

Dann 81 Gramm Paraffin hinzufügen und gut vermischen. Anschließend 15 Gramm weißen körnigen VI-Riegel hinzufügen und im selben Becherglas vollständig schmelzen. Sobald es geschmolzen ist, mischen Sie es erneut, um eine vollständig gemischte Wachslösung zu erhalten.

Nun die Mischung in eine Glasflasche geben und locker mit einem Deckel verschließen. Stellen Sie die Glasflasche in einen 60 Grad Celsius heißen Heißluftofen, um die Zutaten in einem flüssigen Zustand zu halten und alle Infiltrationen stattfinden zu lassen. Diese Lösung kann auf 200 Milliliter hergestellt und in zwei 100-Milliliter-Flaschen aufgeteilt werden.

Eine für die Infiltration und eine für die endgültige Einbettung von karibischen Riffen bildenden Korallenproben wurden aus AU entnommen und im Feld in para-Formaldehyd fixiert. Um das Korallengewebe für SBFI einzubetten, waschen Sie zunächst die auf dem Feld gesammelten Korallenpolypen und lagern sie bei vier Grad Celsius in para-Formaldehyd. Waschen Sie sie anschließend jeweils fünf Minuten lang in PB S3, wenn sie bereit sind, abgebildet zu werden.

Entkalken Sie die Polypen in einer Ex-Cal-Zwei-Lösung für 24 Stunden oder bis die Polypen vollständig frei von Kalziumkarbonat sind. Inkubieren Sie mehrere entkalkte Korallenpolypen als einen Block in einer Serie von 25, 50, 75 und 100 % Ethanol, gefolgt von einem x Xylol. Ersetzen Sie die Probe für 30 Minuten pro Sitzung, um sie zu dehydrieren.

Legen Sie anschließend die verarbeiteten Polypen in 100%iges Xylol. Im 65 Grad Celsius heißen Ofen für 30 Minuten ersetzen. Danach durch frische Lösung ersetzen und weitere 30 Minuten inkubieren.

Richten Sie die Polypen mit den Spitzen nach unten und der Oberfläche so flach wie möglich aus. Erstellen Sie Lösungen von zwei zu eins, eins zu eins und eins zu zwei. Xylolersatz und Vorfiltrationswachs.

In 50 Milliliter Falcon-Röhrchen werden die Korallenpolypen mit diesen drei ansteigenden Konzentrationen von Vorfiltrationswachs inkubiert, gefolgt von drei Inkubationen in 100%igem Vorfiltrationswachs für jeweils 30 Minuten bis eine Stunde. Übertragen Sie nun die Probe auf das Einbettwachs. Entfernen Sie das Einbettwachs nach 30 Minuten, ersetzen Sie es durch frisches Einbettwachs und setzen Sie die Inkubation für mindestens vier Stunden bei 65 Grad Celsius fort.

Fotografieren Sie anschließend den Block. Dies ist notwendig, da die Position der Probe, sobald sie in das Wachs eingebettet ist, unsichtbar wird, da das einbettende rote Wachs undurchsichtig ist. Geben Sie anschließend kleine Tropfen Wachs mit hohem Schmelzpunkt um die neue vorgewärmte Einbettform aus Edelstahl und lassen Sie sie abkühlen.

Gießen Sie eine kleine Menge frisch geschmolzenes und Bettwachs aus dem zweiten Aliquot und positionieren Sie den Korallenpolypen mit der Vorderseite nach unten schnell über dem weißen Wachspunkt. Setzen Sie dann einen Probenhalter aus Kunststoff auf die Edelstahlschale und gießen Sie mehr Einbettwachs ein, sodass das Wachs an die Oberfläche der Kunststoffform gelangt. Nehmt nun das gesamte Setup aus dem 65 Grad Celsius heißen Ofen und lasst es auf einer Bank oder einer kühlen Oberfläche abkühlen, bis das Wachs vollständig ausgehärtet ist.

Legen Sie danach den getrockneten Block in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht, um ihn langfristig zu lagern, um den Block zu teilen. Schneiden Sie es zuerst ab und schneiden Sie ein Mikrometer große Stücke ab. Nehmen Sie mit einem Mikrotom das Bild der glatten Blockfläche auf, die die Probe enthält.

Jedes Mal. Wenn ein Abschnitt entfernt wird, erscheint die Probe, wenn das weiße Wachs zu verschwinden beginnt. Nehmen Sie dann die Bilder mit einer Schwarzweißkamera auf, indem Sie einen fitzy Fluoreszenzfilter verwenden, um die Autofluoreszenz des Chromatophoren- oder Korallenpolypenbildes aufzunehmen, drei bis vier entkalkte Kerne von jeder Probe.

Um eine Zwei-Photonen-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen, platzieren Sie die gewaschenen Korallenpolypenkerne in 4%-para-Formaldehyd kopfüber in einer abgedeckten Glasbodenschale mit einem Zwei-Photonen-Laser bei 780 Nanometern Anregungsbild, drei bis vier Polypen bei zwei verschiedenen Vergrößerungen mit einem 10-fachen Objektiv. Verwenden Sie als Nächstes den Kachelscan-Modus, um ca. 25 bis 100 Bilder pro Fokusebene in XY in Intervallen von 10 oder 20 Mikrometern zu erfassen. Sammeln Sie dann 50 bis 100 Bilder über die Z-Achse in Abständen von 10 oder 20 Mikrometern, was insgesamt etwa 5.000 bis 10.000 Bildern pro Korallenpolyp entspricht.

Nach diesem Bild drei bis vier Polypenbereiche, die einen Kern und eine Korallenart darstellen. Speichern Sie dann alle Bilder im Rohdatenformat auf der Festplatte des Systems. Schneiden Sie in diesem Verfahren die 2D-Daten zu, um die Dateigröße zu reduzieren, indem Sie sich mit dem quadratischen Zuschneidewerkzeug auf einen einzelnen Polypen konzentrieren und ihn als einzelne TIF-Datei kompilieren.

In der Akquisitionssoftware. Öffnen Sie die assemblierten Dateien der SBFI-Daten oder die gekachelten mehreren Z-Stapel von zwei optischen Photonenabschnitten im EMERIS surpass-Programmmodul unter dem Volumenalgorithmus-Projekt, die SBFI-Daten werden in 3D gerendert. Erstellen Sie mithilfe einer Schattenprojektion einen ISOSURFACE-Modus, in dem die Voxel einen Schwellenwert darstellen, um ein Volumenkörperoberflächenmuster zu erstellen.

Visualisieren Sie die 3D-Projektionen mit einem Clipping-Plain-Algorithmus in den orthogonalen Modi XY, xz und YZ, um die 3D-Struktur und -Form der Korallen anzuzeigen. Animieren Sie dann die Projektionen mit einem Keyframe-Animationsmodul. Generieren Sie im selben Irris-Programm Videodateien mit 5% Komprimierung und Movieclips im VI-Format unter Verwendung von Volumen-3D und Isosurface-Modalitäten.

Hier sind die beiden Photonenfluoreszenz-3D-Bilder von Korallenpolypen von M Anis und M fa Lata. Diese beiden Bilder wurden ohne spektrale Trennung der Komponenten unter Verwendung einer 780-Nanometer-Anregung des Zwei-Photonen-Lasers mit dem von 450 bis 700 Nanometern gesammelten optischen Signal aufgenommen, und diese beiden Bilder wurden mit der gleichen Anregung aufgenommen, aber zwei Photomultiplier-Röhrendetektoren wurden gleichzeitig verwendet, um die Daten von zwei Komponenten zu sammeln. einer von 500 bis 550 Nanometern und der andere von 650 bis 720 Nanometern. Dabei handelt es sich um tiefenbeschichtete Bilder.

Rot sind die flachsten und Blau sind die tiefsten Komponenten in 2D. ja. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die in rotes Wachs eingebettete Probe richtig vorzubereiten. Die Kombination aus serieller Block-Gesichtsbildgebung und Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Analyse der Korallenpigmentierung und der Zellstruktur auf einer Vielzahl von Linsenskalen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit riffbildenden Korallen und ihren spektralen Eigenschaften in drei Dimensionen umgeht und diese abbildet.