Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochauflösende Metabolitenprofile aus Rattenhirnextrakten zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zuerst Rattengehirne geerntet und diese in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Der zweite Schritt besteht darin, Gehirnmetaboliten zu extrahieren, indem Gewebe in Methanol-Chloroform-Wasser homogenisiert wird, gefolgt von der Entfernung von denaturierten Proteinen und organischen Lösungsmitteln.

Anschließend werden die wässrigen Proben lyophilisiert und alle Proben in genau definierten Lösungsmitteln wiederhergestellt. Für eine optimale NMR-spektroskopische Analyse besteht der letzte Schritt darin, metabolomische NMR-Experimente sorgfältig einzurichten und zu optimieren. Letztendlich werden NMR-Spektren unter genau definierten experimentellen Bedingungen benötigt und mit optimierten Datenverarbeitungsprotokollen evaluiert.

Obwohl diese Methode Einblicke in den Gehirnstoffwechsel geben kann, kann sie auch auf andere Weichteile wie Tumore, Leber, Niere und andere Organe angewendet werden. Entnehmen Sie zunächst eine zuvor vorbereitete gefrorene Hirngewebeprobe aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Anschließend wird die Gewebeprobe sofort in einen teilweise mit flüssigem Stickstoff gefüllten Mörser überführt.

Verwenden Sie einen kalten Stößel mit flüssigem Stickstoff, um das gefrorene Hirngewebe in kleinere Stücke zu brechen, die leicht in die Reagenzgläser passen, die für die Gewebehomogenisierung verwendet werden. Nach dieser Mischung wiegen die kleinen Stücke gefrorenen Hirngewebes 250 bis 350 Milligramm des Gewebes gründlich ab und geben es in ein Reagenzglas, das mit insgesamt vier Millilitern eiskaltem Methanol gefüllt ist. Jedes Mal, wenn Stücke von gefrorenem Gewebe in das Reagenzglas gegeben werden, homogenisieren Sie diese sofort mit dem Gewebehomogenisator.

Nachdem das letzte Stück der gefrorenen Rattenhirnprobe in das Reagenzglas gegeben und homogenisiert wurde, überführen Sie das Homogenat in ein Glasfläschchen mit einem Fassungsvermögen von mindestens 20 Millilitern. Schließen Sie den Schraubverschluss und legen Sie das Homogenat 15 Minuten lang auf Eis. Als nächstes fügen Sie dem Homogenat vier Milliliter eiskaltes Chloroform hinzu und wirbeln Sie es gründlich ein.

Wenn Sie fertig sind, legen Sie das Homogenat 15 Minuten lang auf Eis. Geben Sie vier Milliliter Wasser in das Homogenat, nachdem Sie es gründlich vortexiert haben, lassen Sie das Homogenat über Nacht bei minus 20 Grad Celsius stehen. Für eine vollständige Phasentrennung überführen Sie die Homogenatlösung des Gehirngewebes in ein chloroformbeständiges Zentrifugenröhrchen mit einem Durchmesser von mehr als oder gleich einem Röhrchen und zentrifugieren Sie die Probe 40 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation wird die obere Phase mit einer Pasterpipette in ein geeignetes 15-Milliliter-Methanol-beständiges Röhrchen überführt. Verwenden Sie dann eine frische Pasterpipette, um die untere Phase in ein geeignetes, größer/gleich großes 15-Milliliter-chloroformbeständiges Röhrchen zu übertragen, und legen Sie es auf Eis, während Sie das Röhrchen mit der Wasser-Methanol-Phase auf Eis halten. Verdampfen Sie das Methanol, indem Sie einen trockenen Stickstoffstrom in die Extraktlösung leiten.

Beenden Sie den Verdampfungsprozess, wenn Stickstoff sprudelt. Verursacht keine Volumenverringerung mehr in der Extraktlösung. Nachdem Sie das Röhrchen mit der Methanol-Chloroform-Phase auf Eis gelegt haben, verdampfen Sie das Methanol, indem Sie einen trockenen Stickstoffstrom auf die Oberfläche der Extraktlösung richten.

Wenn das gesamte Lösungsmittel verdampft ist, schließen Sie das Röhrchen und halten Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die NMR-Analyse bereit ist. Um die wässrige Phase für die Gefriertrocknung vorzubereiten, wird die wässrige Probe in ein gründlich gespültes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Dann frieren Sie die Extraktlösung ein, indem Sie das Zentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff so drehen, dass die innere Oberfläche des Röhrchens nach und nach von der gefrorenen Flüssigkeit bedeckt wird.

Wenn die gesamte Flüssigkeit gefroren ist, decken Sie das Rohr mit einem durchstochenen Schraubverschluss ab, damit der Dampf entweichen kann, und legen Sie das Rohr in eine Weithals-Vakuumfilterflasche. Nachdem Sie die Flasche an den Gefriertrockner angeschlossen haben, starten Sie die Gefriertrocknung und beenden Sie den Gefriertrocknungsprozess. Wenn die Probe vollständig trocken ist, bewahren Sie sie in einem geschlossenen Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie für die NMR-Analyse verwendet wird.

Für die Phosphor-NMR-Analyse von Phospholipiden lösen Sie die getrockneten Lipide in 700 Mikrolitern einer Mischung aus deuteriertem Chloroform-Methanol und einer wässrigen CDTA-Lösung von 200 Millimola. Übertragen Sie die Probe mit einer Mikroverdränger-Mikropipette mit einer chloroformresistenten Spitze in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie an dieser Stelle die Temperaturregelung der NMR-Sonde auf den gewünschten Zielwert ein, der in der Regel bei 25 Grad Celsius liegt.

Die Phospholipid-Extraktlösung bei vier Grad Celsius und 11.000 g für 30 Minuten, um die festen Rückstände in der Probe zu schleudern. Wenn Sie fertig sind, geben Sie 600 Mikroliter des Super Natin in ein hochwertiges NMR-Röhrchen mit einem Außendurchmesser von fünf Millimetern. Bereiten Sie den entsprechenden koaxialen Einsatzstiel vor, der mit einer wässrigen 20 Millimolar-Methylendiphosphatlösung bei einem pH-Wert von 7,0 gefüllt ist, um die chemische Verschiebungsreferenzierung und Quantifizierung zu ermöglichen.

Legen Sie diesen Einsatz in das mit der Phospholipid-Extraktlösung gefüllte NMR-Röhrchen. Setzen Sie als Nächstes das NMR-Rohr mit dem entsprechenden Spinner ein und übertragen Sie es auf den NMR-Magneten. Schleudern Sie die Probe mit 15 bis 20 Hertz, nachdem Sie gewartet haben, bis sich die Probe an die eingestellte Temperatur angepasst hat.

Minimieren Sie vorsichtig die Homogenität des Magnetfelds in der gesamten Probe, indem Sie die Shim-Spulenströme auf der Achse und außerhalb der Achse anpassen und die Erfassungsparameter des NMR-Spektrums auf die optimalen Werte einstellen, die in Abhängigkeit von der Magnetfeldstärke variieren können. Sobald die Spektrenerfassung abgeschlossen ist, verarbeiten Sie den freien Induktionszerfall mit optimierten Parametern, um die besten Ergebnisse für den gesamten Bereich der Phospholipidresonanzen zu erzielen. Wiederholen Sie die Verarbeitung mit mindestens zwei verschiedenen Filterverfahren.

Schließlich werden sehr schwache und breite Signale ohne signifikante Überlappung gefiltert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. In diesem Experiment wurden extrem schmale Spektrallinien für alle analysierten Spektralbereiche auch in sehr dicht besiedelten Bereichen erhalten. Peaks in einem Abstand von weniger als 0,01 P PP M sind bei 400 Megahertz nahezu vollständig trennbar.

Als Konsequenz kann eine qualitative und quantitative Analyse der zahlreichen kleinen, aber derzeit nicht zugeordneten Peaks in der zukünftigen Linienverengung durch die Wahl von 1000 Millimolar anstelle von 200.Millimolar ins Auge gefasst werden. CDTA war erwünscht, führte aber zu einer Überlagerung der Phospholipid-Signallinienverengung, indem 277 Kelvin anstelle von 297 gewählt wurde. Kelvin war erwünscht, führte aber auch zu einer Überlagerung von Phospholipidsignalen.

Eine Abnahme der CDTA-Konzentration von 200 Millimolar auf 50 Millimolar führt nur zu einer moderaten Zunahme der Linienbreite und zu fast keiner Änderung der chemischen Verschiebungen. Beachten Sie jedoch, dass die Gewebekonzentration im 50 Millimolaren CDTA-Extrakt halb so hoch ist wie im 200 Millimolar CDTA-Extrakt. Zur Erklärung der relativ schmalen Linien wurde eine große Anzahl quantifizierbarer Phospholipide nachgewiesen, die einen beträchtlichen Konzentrationsbereich abdecken.

Die spektrale Auflösung ist sogar ausreichend, um routinemäßig eine partielle Aufspaltung bestimmter Peaks zu detektieren. In der Konsequenz kann in Zukunft eine qualitative und quantitative Analyse weiterer Phospholipid-Untergruppen ins Auge gefasst werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, jeden einzelnen Schritt mit äußerster Sorgfalt durchzuführen, um eine optimale Metabolitenanalyse zu gewährleisten.