Name: Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende NMR-Spektroskopie zur metabolomischen Analyse von Rattenhirnextrakten. Diese Methode ermöglicht die quantitative Erfassung von Metabolitenkonzentrationen für neurochemische Forschung.

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Unterstützung durch das Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 und 7339) wird dankbar gedankt.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

NMR-Spektroskopie ist eine effiziente Methode zur Messung der Konzentration von chemischen Verbindungen in Lösung in einem sehr reproduzierbare und genaue Weise. Allerdings ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten es notwendig, bestimmte Vorschriften für die Probenvorbereitung und Analyse halten. Bei der Bestimmung der Metaboliten-Konzentrationen durch NMR-Spektroskopie, weder die Erzeugung noch der Empfang des NMR-Signals dominiert die Quantifizierungsfehler, sofern die Intensität des beobachteten Signals näher...

Mausmodelle sind weitgehend in der Hirnforschung 1 verwendet worden. Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in Maus-und Rattenhirne durch das Studium der Genexpression auf RNA-und / oder Protein-Ebene auf der einen Seite auf die andere 2-6 untersucht und morphologischen, funktionellen, elektrophysiologischen und / oder Verhaltens Phänotypen. Um jedoch die Mechanismen der Verknüpfung von Genotyp-Phänotyp zu vollständig zu verstehen, ist es unerlässlich, die molekularen Ereignisse hinter der Protein-Expression, dh zu untersuchen. der Stoffwechsel der biochemischen Substrate, auf denen Enzyme wirken 7. Diese Anforderung führte in den vergangenen 10 bis 15 Jahren, zu einer Renaissance der Stoffwechselforschung in vielen Bereichen der Biologie 8,9. Während klassische Stoffwechselstudien haben oft auf Details der besonderen Fachrichtungen ausgerichtet ist, wird die neue Metabolomics Ansatz einer umfassenden Untersuchung der globalen Stoffwechselprofil des Gewebes unter Berücksichtigung ausgerichtet.Eine Folge dieses Konzepts besteht ein offensichtlicher Bedarf für analytische Werkzeuge, die Ausrichtung auf bestimmte Stoffwechselwege und / oder Klassen von Verbindungen zu minimieren. Jedoch ist eine klassische biochemische Assays auf eine bestimmte chemische Reaktion eines spezifischen Analyten festgelegt werden, bevor der Test durchgeführt wird, die Bedürfnissen. Im Gegensatz dazu werden spektroskopische Techniken, wie kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) (i) zu bestimmten molekularen (physikalischen) Eigenschaften von biochemischen Verbindungen, bezogen von denen jede zu einem oder mehreren verschiedenen Signale in einem Frequenz im Verlauf eines Experiments erfasst; und (ii) erkennen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verbindungen pro Experiment. So enthält jedes Spektrum die kombinierten Informationen über eine ganze Reihe von Stoffwechselprodukten. Aus diesem Grund, spektroskopische Verfahren sind geeignete Werkzeuge für metabolomics, da keine vorherige Selektion muss gemacht bezüglich der Art des Analyten zu messenden 8 </sup&gt;. Als Folge sind diese Techniken natürlich eignen sich für Vorstudien, weil sie den Nachweis von unerwarteten Stoffwechseländerungen erheblich erleichtern. Obwohl NMR und MS austauschbar für die Analyse von vielen Metaboliten verwendet werden, besitzt jedes Verfahren spezifische Vor-und Nachteile, die vor kurzem wurden bewertet 10. Kurz gesagt, können NMR-Spektroskopie üblicherweise aus Rohextrakten durchgeführt werden und erfordert keine chromatographische Trennung der Probenverbindungen vor der Analyse erfordert. Im Gegensatz dazu arbeitet MS mit Gas oder Flüssigkeits-Chromatographie (GC oder LC) Trennung, mit Ausnahme insbesondere die jüngsten Entwicklungen wie der Massenspektrometrie Bildgebung. In einigen speziellen Fällen, wie die Analyse von Zucker, kann LC-Trennung eine Notwendigkeit für die NMR-Spektroskopie als auch geworden, weil die Resonanzlinien aus verschiedenen Zuckerarten überschneiden sich in den Proton (1 H)-NMR-Spektren. Dennoch, 1 H-NMR-Spektroskopie ohne chromatographic Trennung bleibt die beliebteste, fast allgemein angewandte metabolomische NMR-Methode. Im Allgemeinen ist die Probenvorbereitung zeitaufwendig und komplex für MS, als es für NMR-Spektroskopie. Schwerwiegende Probleme auf Matrixeffekte sind viel in der NMR-Spektroskopie weniger verbreitet als in MS, wo sie deutlich gedämpften Signale führen. Metabolit Quantifizierung kann mit beiden Methoden erreicht werden. Jedoch werden mehrere Standardverbindungen für MS aufgrund von Variationen in Matrixeffekte und Ionisation Wirkungsgrade zwischen Metaboliten benötigt. Im Gegensatz dazu wird nur eine Standard pro Probe für ein NMR-spektroskopischen Analyse, weil unter geeigneten Messbedingungen erforderlich ist, ist das letztere Verfahren eigen quantitative dank der streng linearen NMR-Antwort von den Kernen beobachtet. Ein Hauptnachteil der NMR ist seine relativ geringe Empfindlichkeit. MS, insbesondere LC-MS, ist empfindlicher als NMR um mehrere Größenordnungen; Aus diesem Grund ist MS über NMR für das vorzuziehenAnalyse der Verbindungen in sehr geringen Konzentrationen auftreten. Andererseits ist die zerstörungsfreie Art der NMR-Experiment wird ein klarer Vorteil gegenüber MS; auf diese Weise NMR wiederholt an der gleichen Probe, beispielsweise für unterschiedliche NMR-aktiven Kernen, wie 1 H, 31-Phosphor (31 P), Kohlenstoff-13 (13 C), durchgeführt werden kann, Fluor-19 (F 19), etc., da kein Material durch NMR verbraucht im Gegensatz zu MS-Messungen. Sowohl NMR-und MS kann in verschiedenen Modi verwendet werden, wobei jeder eine optimal für den Nachweis von Verbindungen mit bestimmten chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ist 31 P NMR oft besser als 1 H-NMR für die Analyse der mäßig konzentrierten phosphorylierten Verbindungen, obwohl fast alle phosphorylierten Metaboliten Protonen enthalten. Jedoch kann ihre 1 H-NMR-Signale durch 1 H-NMR-Signale von anderen, nicht-phosphorylierten Verbindungen verdeckt werden, während die letzterenoffensichtlich nicht dazu führen, Hintergrundsignale in 31 P-NMR-Spektren. In einer analogen Situation ist 19 F-NMR-Analyse für fluorierte Verbindungen, beispielsweise fluorierte Medikamente (keine Hintergrundsignale von endogenen Metaboliten) bevorzugt werden, während der Spezialfall von 13 C-NMR von Interesse fast ausschließlich wenn das Schicksal von 13 C markierten exogenen metabolischen Vorstufen muss beachtet werden, aufgrund der extrem niedrigen natürlichen Häufigkeit des Isotops 13 C (ca. 1%). Viele Massenspektrometer arbeiten entweder in Negativ-Ionen-Modus oder positiven Ionenmodus. Daher ist es wichtig, vor der Analyse, ob die Ionen beobachtet werden negativ oder positiv geladen sein kennen. Wir konzentrieren uns hier auf ein Protokoll für die Analyse von Hirngewebe Metabolom durch 1 H-und 31 P-NMR-Spektroskopie, da dieses Verfahren ergibt sich eine große Anzahl von wichtigen Metaboliten-Konzentrationen bei niedrigen Kosten in Form von (i) der Zeit für die Probenvorbereitung eine benötigtend (ii) Aufwand für Metabolit Quantifizierung erforderlich. Alle Experimente können unter Verwendung der Ausrüstung eines Standard-Nasschemielabor und einen hochauflösenden NMR-Spektroskopie-Anlage werden. Weitere Anforderungen sind in dem Protokoll weiter unten beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>Virbac</td><td>Vetfluran</td><td>Anästhetikum für Tiere</td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Neueres Modell verfügbar: Isotec 4</td></tr><tr><td>Skalpell, Schere, Pinzette, Klemmen</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>diverse diverse</td><td>Chirurgische Geräte für Tiere</td></tr><tr><td>Freeze-Clamp-Werkzeug</td><td>selbst gebaut</td><td>n/a</td><td>Zange mit Aluminiumplatten, zum Einsetzen in flüssigen Stickstoff zum Abkühlen</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Luft Flüssig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>Luft Flüssig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffverdampfer</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Kann durch selbstgebautes Gerät</td></tr><tr><td>ersetzt werden Mörser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>Stößel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Gewebehomogenisator</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Mit Reagenzgläsern passend Homogenisator Schacht</td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen aus Glas</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml Röhrchen</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml Röhrchen; sollte das "Eppendorf"-Röhrchen ersetzen, wenn es mit dem Zentrifugenrotor kompatibel</td></tr> ist <tr><td>Polystyrolpipetten</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>5 und 10 ml</td></tr><tr><td>Volumen Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99,96 % deuteriert</td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96 % deuteriert</td></tr><tr><td>Deuteriumchlorid</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20 % in Deuteriumoxid</td></tr><tr><td>Natriumdeuteroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30 % in Deuteriumoxid</td></tr><tr><td>Lyophilisierer</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Kaltzentrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Cäsiumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988 NMR-Röhrchen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR-Schaft Koaxialeinsatz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By Wilmad</td></tr><tr><td>NMR-Pipetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Mit Tipps für Volumina von 0,5 bis 1.000 &mu; l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR-Spektrometer</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>inkl. Sonde und weiterem Zubehör</td></tr><tr><td>NMR-Software</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>neuere Version verfügbar: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Wasserlösliche Standardverbindungen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Phospholipid-Standardverbindungen</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>diverse diverse verschiedene</td><td>Quelle für Plasmalogene, kann aber < Methylendiphosphonat mit einer Reinheit von 70 - 80 %</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolomische analyse von rattenhirn hohe auflösung kernresonanzspektroskopie von gewebeextrakte

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Studien zur Genexpression auf RNA- und Proteinebene werden seit langem verwendet, um biologische Prozesse zu erforschen, die Krankheiten zugrunde liegen. In jüngerer Zeit wurden Genomik und Proteomik durch eine umfassende quantitative Analyse des in biologischen Systemen vorhandenen Metabolitenpools ergänzt. Diese Strategie, die als Metabolomik bezeichnet wird, zielt darauf ab, eine globale Charakterisierung des am Stoffwechsel beteiligten niedermolekularen Komplements zu ermöglichen. Während das Genom und das Proteom die Aufgaben definieren, die Zellen ausführen können, ist das Metabolom Teil des eigentlichen Phänotyps. Unter den derzeit in der Metabolomik verwendeten Methoden sind spektroskopische Techniken von besonderem Interesse, da sie es ermöglichen, eine große Anzahl von Metaboliten gleichzeitig zu analysieren, ohne zuvor auf spezifische biochemische Signalwege zu selektieren, was einen breiten, unvoreingenommenen Ansatz ermöglicht. Hier wird ein optimiertes experimentelles Protokoll für die metabolomische Analyse mittels hochauflösender NMR-Spektroskopie vorgestellt, welches die Methode der Wahl für die effiziente Quantifizierung von Gewebemetaboliten ist. Wichtige Stärken dieser Methode sind (i) die Verwendung von Rohextrakten, ohne dass die Probe gereinigt und/oder Metaboliten getrennt werden müssen; ii) der intrinsische quantitative Charakter der NMR, der die Quantifizierung aller Metaboliten ermöglicht, die durch ein NMR-Spektrum mit nur einer Referenzverbindung repräsentiert werden; und (iii) die zerstörungsfreie Natur der NMR, die die wiederholte Verwendung derselben Probe für mehrere Messungen ermöglicht. Der dynamische Bereich der Metabolitenkonzentrationen, der abgedeckt werden kann, ist aufgrund der linearen Reaktion von NMR-Signalen beträchtlich, obwohl Metaboliten, die in extrem niedrigen Konzentrationen auftreten, schwer zu erkennen sein können. Für die am wenigsten vorkommenden Verbindungen kann die hochempfindliche Massenspektrometrie-Methode von Vorteil sein, obwohl diese Technik kompliziertere Probenvorbereitungs- und Quantifizierungsverfahren erfordert als die NMR-Spektroskopie. Wir stellen hier ein NMR-Protokoll vor, das an die Analyse des Gehirns von Ratten angepasst ist; Das gleiche Protokoll kann jedoch mit geringfügigen Modifikationen auf andere Gewebe angewendet werden.

Um beste Auflösung bei Stoffwechsel NMR-Spektren von Gehirn und anderen Gewebeextrakten zu erhalten, ist es schon lange üblich, zu entfernen oder Maske Metallionen (vor allem: paramagnetischen Ionen) in Extraktlösungen vorhanden. Dies wurde entweder durch Zugabe eines Chelatbildners wie EDTA oder CDTA dem Extrakt 19, oder indem der Extrakt durch ein Ionenaustauschharz, wie Chelex-100 20 erreicht. Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser Schritt nicht für <sup...

Die Neurochemie des Gehirns von Säugetieren ist bei vielen neurologischen und systemischen Erkrankungen verändert. Charakteristische Profile von zerebralen Metaboliten können effizient auf der Grundlage von Rohextrakten aus Hirngewebe erhalten werden. Zu diesem Zweck wird die hochauflösende NMR-Spektroskopie eingesetzt, die eine detaillierte quantitative Analyse der Metabolitenkonzentrationen ermöglicht (Metabolomik).

Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochauflösende Metabolitenprofile aus Rattenhirnextrakten zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zuerst Rattengehirne geerntet und diese in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Der zweite Schritt besteht darin, Gehirnmetaboliten zu extrahieren, indem Gewebe in Methanol-Chloroform-Wasser homogenisiert wird, gefolgt von der Entfernung von denaturierten Proteinen und organischen Lösungsmitteln.Anschließend werden die wässrigen Proben lyophilisiert und alle Proben in genau definierten Lösungsmitteln wiederhergestellt. Für eine optimale NMR-spektroskopische Analyse besteht der letzte Schritt darin, metabolomische NMR-Experimente sorgfältig einzurichten und zu optimieren. Letztendlich werden NMR-Spektren unter genau definierten experimentellen Bedingungen benötigt und mit optimierten Datenverarbeitungsprotokollen evaluiert.Obwohl diese Methode Einblicke in den Gehirnstoffwechsel geben kann, kann sie auch auf andere Weichteile wie Tumore, Leber, Niere und andere Organe angewendet werden. Entnehmen Sie zunächst eine zuvor vorbereitete gefrorene Hirngewebeprobe aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Anschließend wird die Gewebeprobe sofort in einen teilweise mit flüssigem Stickstoff gefüllten Mörser überführt.Verwenden Sie einen kalten Stößel mit flüssigem Stickstoff, um das gefrorene Hirngewebe in kleinere Stücke zu brechen, die leicht in die Reagenzgläser passen, die für die Gewebehomogenisierung verwendet werden. Nach dieser Mischung wiegen die kleinen Stücke gefrorenen Hirngewebes 250 bis 350 Milligramm des Gewebes gründlich ab und geben es in ein Reagenzglas, das mit insgesamt vier Millilitern eiskaltem Methanol gefüllt ist. Jedes Mal, wenn Stücke von gefrorenem Gewebe in das Reagenzglas gegeben werden, homogenisieren Sie diese sofort mit dem Gewebehomogenisator.Nachdem das letzte Stück der gefrorenen Rattenhirnprobe in das Reagenzglas gegeben und homogenisiert wurde, überführen Sie das Homogenat in ein Glasfläschchen mit einem Fassungsvermögen von mindestens 20 Millilitern. Schließen Sie den Schraubverschluss und legen Sie das Homogenat 15 Minuten lang auf Eis. Als nächstes fügen Sie dem Homogenat vier Milliliter eiskaltes Chloroform hinzu und wirbeln Sie es gründlich ein.Wenn Sie fertig sind, legen Sie das Homogenat 15 Minuten lang auf Eis. Geben Sie vier Milliliter Wasser in das Homogenat, nachdem Sie es gründlich vortexiert haben, lassen Sie das Homogenat über Nacht bei minus 20 Grad Celsius stehen. Für eine vollständige Phasentrennung überführen Sie die Homogenatlösung des Gehirngewebes in ein chloroformbeständiges Zentrifugenröhrchen mit einem Durchmesser von mehr als oder gleich einem Röhrchen und zentrifugieren Sie die Probe 40 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation wird die obere Phase mit einer Pasterpipette in ein geeignetes 15-Milliliter-Methanol-beständiges Röhrchen überführt. Verwenden Sie dann eine frische Pasterpipette, um die untere Phase in ein geeignetes, größer/gleich großes 15-Milliliter-chloroformbeständiges Röhrchen zu übertragen, und legen Sie es auf Eis, während Sie das Röhrchen mit der Wasser-Methanol-Phase auf Eis halten. Verdampfen Sie das Methanol, indem Sie einen trockenen Stickstoffstrom in die Extraktlösung leiten.Beenden Sie den Verdampfungsprozess, wenn Stickstoff sprudelt. Verursacht keine Volumenverringerung mehr in der Extraktlösung. Nachdem Sie das Röhrchen mit der Methanol-Chloroform-Phase auf Eis gelegt haben, verdampfen Sie das Methanol, indem Sie einen trockenen Stickstoffstrom auf die Oberfläche der Extraktlösung richten.Wenn das gesamte Lösungsmittel verdampft ist, schließen Sie das Röhrchen und halten Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die NMR-Analyse bereit ist. Um die wässrige Phase für die Gefriertrocknung vorzubereiten, wird die wässrige Probe in ein gründlich gespültes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Dann frieren Sie die Extraktlösung ein, indem Sie das Zentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff so drehen, dass die innere Oberfläche des Röhrchens nach und nach von der gefrorenen Flüssigkeit bedeckt wird.Wenn die gesamte Flüssigkeit gefroren ist, decken Sie das Rohr mit einem durchstochenen Schraubverschluss ab, damit der Dampf entweichen kann, und legen Sie das Rohr in eine Weithals-Vakuumfilterflasche. Nachdem Sie die Flasche an den Gefriertrockner angeschlossen haben, starten Sie die Gefriertrocknung und beenden Sie den Gefriertrocknungsprozess. Wenn die Probe vollständig trocken ist, bewahren Sie sie in einem geschlossenen Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie für die NMR-Analyse verwendet wird.Für die Phosphor-NMR-Analyse von Phospholipiden lösen Sie die getrockneten Lipide in 700 Mikrolitern einer Mischung aus deuteriertem Chloroform-Methanol und einer wässrigen CDTA-Lösung von 200 Millimola. Übertragen Sie die Probe mit einer Mikroverdränger-Mikropipette mit einer chloroformresistenten Spitze in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie an dieser Stelle die Temperaturregelung der NMR-Sonde auf den gewünschten Zielwert ein, der in der Regel bei 25 Grad Celsius liegt.Die Phospholipid-Extraktlösung bei vier Grad Celsius und 11.000 g für 30 Minuten, um die festen Rückstände in der Probe zu schleudern. Wenn Sie fertig sind, geben Sie 600 Mikroliter des Super Natin in ein hochwertiges NMR-Röhrchen mit einem Außendurchmesser von fünf Millimetern. Bereiten Sie den entsprechenden koaxialen Einsatzstiel vor, der mit einer wässrigen 20 Millimolar-Methylendiphosphatlösung bei einem pH-Wert von 7,0 gefüllt ist, um die chemische Verschiebungsreferenzierung und Quantifizierung zu ermöglichen.Legen Sie diesen Einsatz in das mit der Phospholipid-Extraktlösung gefüllte NMR-Röhrchen. Setzen Sie als Nächstes das NMR-Rohr mit dem entsprechenden Spinner ein und übertragen Sie es auf den NMR-Magneten. Schleudern Sie die Probe mit 15 bis 20 Hertz, nachdem Sie gewartet haben, bis sich die Probe an die eingestellte Temperatur angepasst hat.Minimieren Sie vorsichtig die Homogenität des Magnetfelds in der gesamten Probe, indem Sie die Shim-Spulenströme auf der Achse und außerhalb der Achse anpassen und die Erfassungsparameter des NMR-Spektrums auf die optimalen Werte einstellen, die in Abhängigkeit von der Magnetfeldstärke variieren können. Sobald die Spektrenerfassung abgeschlossen ist, verarbeiten Sie den freien Induktionszerfall mit optimierten Parametern, um die besten Ergebnisse für den gesamten Bereich der Phospholipidresonanzen zu erzielen. Wiederholen Sie die Verarbeitung mit mindestens zwei verschiedenen Filterverfahren.Schließlich werden sehr schwache und breite Signale ohne signifikante Überlappung gefiltert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. In diesem Experiment wurden extrem schmale Spektrallinien für alle analysierten Spektralbereiche auch in sehr dicht besiedelten Bereichen erhalten. Peaks in einem Abstand von weniger als 0,01 P PP M sind bei 400 Megahertz nahezu vollständig trennbar.Als Konsequenz kann eine qualitative und quantitative Analyse der zahlreichen kleinen, aber derzeit nicht zugeordneten Peaks in der zukünftigen Linienverengung durch die Wahl von 1000 Millimolar anstelle von 200.Millimolar ins Auge gefasst werden. CDTA war erwünscht, führte aber zu einer Überlagerung der Phospholipid-Signallinienverengung, indem 277 Kelvin anstelle von 297 gewählt wurde. Kelvin war erwünscht, führte aber auch zu einer Überlagerung von Phospholipidsignalen.Eine Abnahme der CDTA-Konzentration von 200 Millimolar auf 50 Millimolar führt nur zu einer moderaten Zunahme der Linienbreite und zu fast keiner Änderung der chemischen Verschiebungen. Beachten Sie jedoch, dass die Gewebekonzentration im 50 Millimolaren CDTA-Extrakt halb so hoch ist wie im 200 Millimolar CDTA-Extrakt. Zur Erklärung der relativ schmalen Linien wurde eine große Anzahl quantifizierbarer Phospholipide nachgewiesen, die einen beträchtlichen Konzentrationsbereich abdecken.Die spektrale Auflösung ist sogar ausreichend, um routinemäßig eine partielle Aufspaltung bestimmter Peaks zu detektieren. In der Konsequenz kann in Zukunft eine qualitative und quantitative Analyse weiterer Phospholipid-Untergruppen ins Auge gefasst werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, jeden einzelnen Schritt mit äußerster Sorgfalt durchzuführen, um eine optimale Metabolitenanalyse zu gewährleisten.

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Ein Verfahren zur Extraktion aus mikrobiellen Metaboliten planktonischen Gemeinden vorgestellt. Ganze Gemeinde Probenahme durch Filtration auf speziell präparierten Filter erreicht. Nach der Gefriertrocknung sind wasserlösliche Metaboliten extrahiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine Anwendung des Umweltrechts Metabolomik zu trans-omik Untersuchungen von natürlichen oder experimentellen mikrobiellen Gemeinschaften.

Konzentration der Metabolite von Low-Density-Planktonic Gemeinschaften für Umweltforschung Metabolomics mit Kernresonanzspektroskopie

Wir beschreiben ein Rattenmodell der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD), die die anhaltenden Veränderungen im neuroendokrinen Funktion und die verzögerte langfristige, übertriebene Angstreaktion, die charakteristisch für PTBS-Patienten zeigt. Das Tiermodell und hier beschriebenen Methoden sind nützlich zum Korrelieren Biomarkern in Gehirnkernen, die mechanistische sind, aber nicht bei Patienten gemessen werden, wobei Biomarkern in peripheren weißen Blutzellen, welches kann.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Eine progressive Kolonisierung Verfahren wird beschrieben, weitere Beurteilung ihrer Auswirkungen auf den Host Leberstoffwechsel. Colonization wird überwacht nicht-invasiv durch die Auswertung der Ausscheidung von mikrobiellen Co-Metaboliten durch NMR-basierte Metabolic Profiling während Leberstoffwechsel von High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS)-NMR-Profiling von intakten Biopsie beurteilt wird.

Die Beurteilung der Leber metabolischen Veränderungen während Progressive Colonization von Keimfrei Maus durch 1 H-NMR-Spektroskopie

Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Quelle: Blanc, J., et al. Funktionelle Magnetresonanzspektroskopie bei 7 T im Rattenfasskortex während der Whisker-Aktivierung. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Methode zur Analyse metabolischer Veränderungen im Rattenfasskortex mit Hilfe der funktionellen Magnetresonanzspektroskopie während der Whisker-Stimulation. Die Metabolitenspektren zu Studienbeginn werden mit stimulierten Spektren verglichen, um einen Laktatanstieg im Fasskortex zu detektieren und eine erfolgreiche neuronale...

Funktionelle Magnetresonanzspektroskopie des Rattenfasskortex während der Whisker-Stimulation

Die Positronen-Emissions-Tomographie für Kleintiere ermöglicht die Beurteilung der beiden Hauptenergiesubstrate des Gehirns: Glukose und Ketone. Bei dem vorliegenden Verfahren werden 11C-Acetoacetat und 18F-Fluordesoxyglukose nacheinander in jedes Tier injiziert, und ihre Aufnahme wird quantitativ in spezifischen Gehirnregionen gemessen, die aus den Magnetresonanzbildern bestimmt werden.

Ein duales Tracer-PET-MRT-Protokoll zur quantitativen Messung der Aufnahme regionaler Energiesubstrate im Gehirn bei der Ratte

Nach der Überprüfung durch Blut-Sauerstoff-Niveau-abhängigen funktionelle Magnetresonanztomographie (BOLD fMRT), die der entsprechenden somatosensorischen Fass Feld Kortex Bereich (genannt S1BF) korrekt aktiviert, die wichtigsten Ziel dieser Studie ist es, Laktat Inhalt zu quantifizieren Schwankungen in den aktivierten Ratte Gehirnen von lokalisierten Proton Magnetische Resonanzspektroskopie (1H-MRS) bei 7 T.

Funktionelle Magnet-Resonanz-Spektroskopie bei 7 T in der Ratte Barrel Cortex während der Whisker-Aktivierung

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung stabiler Ruhezustandsdaten der funktionellen Magnetresonanztomographie (rs-fMRT) von einer Ratte, die niedrig dosiertes Isofluran in Kombination mit niedrig dosiertem Dexmedetomidin verwendet.

Erfassung von funktionellen Magnetresonanztomographiedaten im Ruhezustand bei ratten

Dieser Artikel stellt die Verwendung von PSYCHE und SAPPHIRE-PSYCHE bei der metabolischen Profilerstellung von Pflanzen vor und enthält detaillierte Verfahren zur Probenvorbereitung und optimalen Aufzeichnung von Pure Shift NMR-Spektren. Es werden Beispiele diskutiert, anhand derer der durch die homonukleare Entkopplung erzielte Auflösungsgewinn ein umfassenderes Verständnis des Systems ermöglicht.

Reine Shift-Kernspinresonanz: ein neues Werkzeug für die pflanzliche Metabolomik

Die Erfassung von Daten der dynamischen Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und die Rekonstruktion in Zeitrahmen ermöglicht die Analyse der metabolischen Hirnkonnektivität auf der Ebene eines einzelnen Probanden. Wir beschreiben eine Methode zur Erfassung von [18F]FDG-dynamischen PET-Daten des Rattengehirns und erhalten eine Konnektivitätsmatrix durch die Extraktion von Zeit-Aktivitäts-Kurven der interessierenden Volumina.

Untersuchung der metabolischen Konnektivität des Gehirns mit Hilfe der dynamischen Positronen-Emissions-Tomographie von 2-Desoxy-2-[18F]Fluoro-D-Glukose auf Einzelprobenebene

Lernen Sie die hochauflösende NMR-Spektroskopie zur metabolomischen Analyse von Rattenhirnextrakten. Diese Methode ermöglicht die quantitative Erfassung von Metabolitenkonzentrationen für neurochemische Forschung.

Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte

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