Name: Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit organotypischen Hirnschnittkulturen aus transgenen Mäusen die Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozyten-Liniezellen untersuchen. Diese Methode ermöglicht Langzeitbildgebung und post-hoc-Immunhistochemie zur Analyse zellulärer Dynamiken in intaktem Gewebe.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Multiple Sclerosis Society (RG4179 bis A.N.), der National Institutes of Health (NIH R01NS073425 und R01NS074870 to A.N.) und der National Science Foundation (A.N.) finanziert. Wir danken Dr. Frank Kirchhoff (Universität des Saarlandes, Homburg, Deutschland) für die Bereitstellung von PLPDsRed-transgenen Mäusen. Wir danken Youfen Sun für ihre Hilfe bei der Erhaltung der transgenen Mäusekolonie.

HINWEIS: Alle Tierverfahren werden nach den Richtlinien und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von Connecticut genehmigt worden. HINWEIS: Für diese Experimente konstitutive NG2cre 18 (JAX # 008533) und induzierbare NG2creER 16 (JAX # 008538) transgenen Mäusen gekreuzt, um Z / EG 19 (JAX # 003920) oder gtRosa26: YFP Reporter 20 (JAX # 006148) Leitungen, die jeweils verwendet wurden Bild zu NG2 Zellen und deren Nachkommen. Um das Bild zu reifen Oligodendrozyten wurden PLPDsRed transgenen Mäusen 21 verwendet. Für eine konsistente Überlebens, können Scheiben von Mäusen bis zu postnatalen Tag 10 sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn isoliert werden. 1. Scheibe Vorbereitung <ol><li> In einer Kultur, Haube, legen Gewebekulturplatten in sechs Well-Platten und 1 ml Scheibe Kulturmedium (Rezept in Reagenzien Abschnitt). Platzieren Sie die Platten in Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 bei mindestens 2 h vor der Sektion. </li><li> Sterilisieren alle Werkzeuge und Gewebe Chopper mit 70% Ethanol. </li><li> Blasen Dissektion Puffer (Rezept Reagenzien Schnitt) mit 95% O 2, 5% CO 2 auf Eis für mindestens 15 Minuten vor dem Beginn der Präparation. </li><li> Betäuben Maus Welpen, indem sie auf Eis für 5-10 min nach anerkannten Tier Protokolle. Ermitteln Sie die geeignete Narkosetiefe durch die Bestätigung, dass die Mäuse nicht bis zum Schwanz und Zehen Kneifen reagieren. </li><li> Enthaupten Tiere mit einer scharfen Schere folgenden Tier Protokolle. Entfernen Sie schnell den Schädel über dem Vorderhirn und Kleinhirn, indem zuerst eine sagittale Schnitt, gefolgt von seitlichen Schnitt, mit sterilisierten Werkzeugen. Geschnitten Hirnnerven von der ventralen Oberfläche des Gehirns und des Kleinhirns durch vorsichtiges Aufrollen des Gewebes an der Seite. </li><li> Zeigen Gewebe in einem sterilen 35 mm Schale mit eiskaltem sauerstoffhaltigen Dissektion Puffer. </li><li> Mit einer Rasierklinge, trennen das Kleinhirn und Vorderhirn. Dann machen Sie eine Mitte-Sagittalschnitt through das Vorderhirn und Kleinhirn, die Trennung der Hemisphären. </li><li> Schneiden Sie 300 um dicke koronale und sagittale Abschnitte des Vorderhirns und des Kleinhirns mit einem manuellen Gewebe Chopper. HINWEIS: Ein Handbuch Gewebe Chopper ermöglicht die schnelle Verarbeitung von Präparation zu Kultur Inkubation ohne die Notwendigkeit für Agarose-Einbettung. Ein Vibratom kann auch eingesetzt werden, wie zuvor 9 beschrieben. </li><li> Übertragen getrennt Scheiben in frisch sprudelte kalte Dissektion Puffer auf Eis. </li><li> Verwenden Sie kleine Sezieren oder einem Gewicht von Spachteln, einzelne Teile zu trennen und sie auf sechs und Gerichte mit Kultureinsätze vorinkubiert. </li><li> Überschüssiges Dissektion Puffer von der Oberfläche des Kultureinsatz mit einer Einwegübertragungspipette oder eine P 200 Pipettenspitze. Zwei bis drei Vorderhirn oder drei Kleinhirnscheiben können auf einem Kultureinsatz platziert werden. HINWEIS: Für die konsistente Ergebnisse mit Vorderhirn Kulturen, ist es ideal, um Scheiben nehmen überspannt den vorderen Drittel des Corpus callosum(1A), um die beiden grauen und weißen Substanz Regionen in der gleichen Schicht zu untersuchen. Jedes Tier erhält man in der Regel 6 Scheiben Vorderhirn und Kleinhirn 6 Scheiben schneiden. </li><li> Legen Sie die sechs Well-Platten im Brutschrank und mit 1 ml Medium Scheibe 1 Tag nach Schnittpräparat und dann jeden zweiten Tag, bis Scheibe Fixierung ersetzen Sie die Scheibe Medium. </li><li> Je nach Experiment, verwenden Scheiben nach 5-7 Tagen in Kultur. Verwenden Sie nur Scheiben, die transparent nach den ersten paar Tagen geworden, und entsorgen Sie die, die unebenen opaken Bereichen haben. HINWEIS: Opaque Regionen innerhalb Scheiben sind mit dem Auge sichtbar und erscheinen als ein Klumpen von dunklen Zellen unter Phasenkontrast. Nachdem die Technik bewältigt wurde, auftreten tot undurchsichtigen Scheiben selten, in weniger als 1-5% der Scheiben. </li></ol> 2. Time-Lapse-Imaging von NG2 Zellteilung und Differenzierung der Oligodendrozyten HINWEIS: Um Zeitraffer Bildgebung von NG2 Zellproliferation und Differenzierung führen wir verwenden NG2cre: ZEG-Mäusen 16die EGFP exprimieren in NG2 Zellen und deren Nachkommen (1C-E). Reporterexpression in dieser Zeile ist ausreichend robust, um Live-Bilder der GFP +-Zellen in Scheiben unmittelbar nach Schneiden für einen Zeitraum von mindestens vier Wochen erhalten. Die deutlichsten Bilder werden nach der ersten Durchforstung Zeit der Scheibe, die sich in den ersten 3-5 Tagen in Kultur anfällt. <ol><li> Während des Experiments halten die Scheiben in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C, und entfernen Sie nur für kurze Zeit (weniger als 15 min pro Scheibe), halten den Deckel auf die sechs Well-Platte, während Bildgebung. </li><li> Mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalkamera ausgerüstet ist, zu erfassen Bilder von dem ersten Zeitpunkt mit einem 10X-Objektiv. HINWEIS: Zum ersten Mal Punkte werden durch das Experiment variieren und können den Tag, wenn die Scheiben hergestellt wurden oder einen Zeitpunkt nach sein. </li><li> Machen Sie Bilder von mehreren Regionen zum Zeitpunkt einer in beiden grauen und weißen Substanz Bereiche der Scheibe. Hinweis the Region durch spezifische Sehenswürdigkeiten innerhalb der Scheibe und durch die Abbildung die Lage des Bildes auf einem Schema, das für nachfolgende Imaging-Sitzungen verwendet werden können, abgebildet. Nützlich Sehenswürdigkeiten können Kanten der Scheiben und / oder Orientierung von der weißen Substanz enthalten. Bild vier Minuten vor acht Stellen auf jeder Scheibe zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Erfassung nachfolgender Bilder in einem Intervall von 4-6 Stunden, wenn die Prüfung NG2 Zellteilung und Differenzierung Oligodendrozyten, idealerweise über 5-7 Tage. </li><li> Nehmen Sie ein endgültiges Bild von allen Regionen und fixieren die Scheiben sofort. 1 ml der Fixierlösung (4% PFA mit 0,1 M L-Lysin 0,01 M Natriummetaperiodat), um den Boden des Kultureinsatz, dann fügen Sie eine weitere 1 ml oben auf den Scheiben. Achten Sie darauf, die direkt auf dem Fixiermittel Scheibe spritzen, wie es aus der Membran zu lösen. Befestigen Sie das Gewebe für 30 Minuten und fahren Sie mit der Immunhistochemie mit Entwicklungsstadium spezifische Marker, wie in Kapitel 4 beschrieben. </li><li> Wasch Scheiben mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer 3 x 10 m. Wenn nötig, speichern Scheiben bei 4 ° C in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer für 1-3 Tage vor Immunfärbung durchzuführen, sondern im Idealfall innerhalb von 24 Stunden. Fahren Sie mit der Immunhistochemie, wie unten in Abschnitt 4 beschrieben, den Anteil der Zellen, die in Oligodendrozyten (2D-F) differenziert sind, zu bestimmen. </li></ol> 3. Fate Mapping von NG2 Zelle Nachkommen Mit induzierbare Reporter transgenen Mäusen in Schnittkulturen HINWEIS: Um das Schicksal von NG2 Zellen aus einem bestimmten Zeitpunkt in der Kultur zu verfolgen, induzierbare NG2creER: kann YFP transgenen Mäusen verwendet werden. <ol><li> Cre die Rekombination zu induzieren und Reporter-Expression durch Zugabe von 100 nM 4OHT in Ethanol zu dem Kulturmedium gelöst. HINWEIS: Reporter-positiven Zellen sollte innerhalb von 1-2 Tagen bei einem Induktionseffizienz von ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 +-Zellen und zu diesem Zeitpunkt erscheinen alle Zellen an der NG2-Zell-Stadium (Abbildung 2a-c) </li><li> Fix und waschen Sie die Scheibeen zu verschiedenen Zeitpunkten nach unterschiedlichen Manipulationen (in den Abschnitten 2.5 und 2.6 beschrieben). </li></ol> 4. Scheibe Immunhistochemie <ol><li> Schneiden Sie die Membranen mit den Scheiben aus den Einsätzen mit einem Skalpell angebracht. </li><li> Übertragen Scheiben auf einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem Satz von Pinzetten, kümmert sich nicht um die Zusammensetzung der Scheibe stören bei der Abholung der Membran. </li><li> Transfer der Scheiben zu einer Platte mit 24 Vertiefungen mit Blockierungslösung, die 5% normales Ziegenserum (NGS) und 0,1% Triton-X100 in PBS für 1 Stunde. </li><li> Die Scheiben in primären Antikörper inkubieren O / N in 5% NGS in PBS bei 4 ° C ist. Zur Identifizierung von Zellen in der Zellstadium NG2, verwenden Sie Antikörper gegen NG2 und PDGFRα. Zur Identifizierung von differenzierten Oligodendrozyten, verwenden Sie ein Antikörpers an die adenomatöse Polyposis coli-Antigen (APC; Klon CC1). </li><li> Am zweiten Tag waschen Scheiben in PBS 3 x15 min, dann im Sekundär Antibo inkubierenstirbt in 5% NGS in PBS für 1 h bei RT. Scheiben waschen in PBS 3 x15 min und montieren auf Folien. Halterung mit Scheiben und Membran mit Blick auf den Objektträger, so dass die Membran nicht zwischen dem Ziel und dem Gewebe sein. </li></ol>

<ol><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li>
<li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235(2007).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices%3A+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li>
<li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li>
<li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z%2FEG%2C+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRA%2FNG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li>
<li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775(2012).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li>
<li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3%CE%B2+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li>
<li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+in+culture%2C+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li>
<li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li>
<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben

Myelinisierung im zentralen Nervensystem ist wesentlich für eine effiziente Kommunikation und neuronalen Axonen Überleben 22. NG2-Zellen zu generieren kontinuierlich myelinisierenden Oligodendrozyten in das Erwachsenenalter, während eine Wohnbevölkerung in den meisten Hirnregionen 16,23 - 25. Einige genetische und molekulare Mechanismen die Differenzierung dieser Zellen beschrieben worden, aber es bleibt noch viel zu entdecken. Organotypischen Kulturen sind ein geeignetes Mittel, um diese Mechanism...

Organoytpic Schnittkulturen des zentralen Nervensystems haben sich als sehr nützlich für das Studium Neuron und Glia Zellbiologie in semiintact System 1 - 4. Diese Kulturen sind relativ einfach zu übernehmen und behalten viele Vorteile der primären dissoziierten Zellkulturen, wie Manipulationen der die extrazelluläre Umgebung und einfachen Zugang für wiederholte langfristige Live Cell Imaging und elektrophysiologischen Ableitungen 5-9. Außerdem Schnittkulturen pflegen 3-dimensionalen Gewebe Zellarchitektur, regionalen neuronalen Konnektivität, und die meisten großen Zelltypen in dem System vorhanden sind. Diese Eigenschaften machen diese Kulturen ein einzigartiges und bequemes System zur Einzelzellverhalten und Physiologie mit zellulären und Umweltwechselwirkungen zu untersuchen. NG2 Zellen eine Population von Gliazellen im Zentralnervensystem von Säugetieren, die zur Proliferation und erzeugen weiterhin myelinating Oligodendrozyten während der embryonalen und postnatalen Entwicklung 10. Sie sind ausführlich in dissoziierten primären Zellkulturen untersucht, und die jüngsten Entwicklung transgener Mauslinien mit NG2 zellspezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen in vivo Schicksal Mapping und elektrophysiologische Ableitungen im spitzen Schnittpräparate erleichtert. Auch bei diesen Studien ist wenig über die zeitliche Dynamik der NG2 Zellproliferation und Differenzierung Oligodendrozyten bekannt. Obwohl dissoziierten Zellkultur in großem Umfang zur relativen Anlage in pharmakologischen und genetischen Manipulationen verwendet werden, ist es nicht geeignet für die Abfragefunktionsunterschiede dieser Zellen in verschiedenen Hirnregionen insbesondere wenn es wünschenswert ist, den Rahmen der zellulären Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Schnittkulturen bieten eine einfache Alternative, die zugänglich für pharmakologische Manipulationen ist und verwendet worden, um Oligodendrozyten Myelinisierung 11,12 untersuchen, Zelldere Reaktion nach Lysolecithin (LPC) oder Antikörper-induzierte Demyelinisierung 13,14, und die Induktion von Remyelinisierung über pharmakologische Behandlung 15. Ein Verfahren zur Untersuchung und Analyse von NG2 führen Zellproliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten organotypischen Schnittkulturen sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn getroffen wird beschrieben Live-Bildgebung und fixiertem Gewebe (oder Nachfixierung). Dies ist eine leistungsfähige Methode, die verwendet werden können, um die Zelle Schicksal der einzelnen Zellen nach NG2 Abteilung 16 zu studieren und regionale und altersabhängige Unterschiede in der Wachstumsfaktor induzierte Proliferation NG2 17 entdecken. Diese relativ einfache Technik ist allgemein zugänglich, weiter zu untersuchen Zelle intrinsischen und / oder Umweltregulierungsmechanismen die Physiologie dieser Gliazellen und ihre Reaktion auf die neuronale Aktivität oder Myelinschäden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essentielles Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s ausgewogene Salzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0,4 mM</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Hyklon</td><td>SH30074,03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">Titrieren auf pH 7,22 mit NaOH, filtrieren mit Flaschenfilter und lagern bei 4 Grad Celsius</td></tr><tr><td colspan="4">Dissection Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (wasserfrei)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4,004 mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2,0 mM</td></tr><tr><td>Adenosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0,075 mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filter mit Flaschenaufsatz und bei 4 Grad Celsius lagern, mit 95%O2 5%CO2 vor Gebrauch</td></tr><tr> sauerstoffreich<td colspan="4">Andere Reagenzien und Zubehör</td></tr><tr><td>4-hydroxytamoxifen (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0,1M</td></tr><tr><td>Natriummetaperiodat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0,01M</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-NG2 Antikörper</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Maus Anti CC1 Antikörper</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Maus-Anti-Ki67-Antikörper</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Maus-Anti-NeuN-Antikörper</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Speziesspezifische Sekundärantikörper</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS)</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0,10%</td></tr><tr><td>Einbettmedium mit DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Kulturmembraneinsätzen 0,45 μm; Mio. Porengröße</td><td>Fisher Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenaufsatzfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95 % O2 5 % CO2Gasgemisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Sechs-Well-Platten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Spatel <td></td><td></td><td></td><td>zum Präparieren (Hippocampus) oder Wiegen</td></tr><tr><td>Manueller oder automatischer Gewebezerkleinerer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm und 60 mm sterile Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invertierte Phase Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypischen kulturen zu oligodendrozyten dynamik und myelinisierung studieren

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2-exprimierenden Zellen (polydendrocytes, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen) sind die vierte große glialen Zellpopulation im zentralen Nervensystem. Während der embryonalen und postnatalen Entwicklung sie aktiv vermehren und erzeugen myelinisierenden Oligodendrozyten. Diese Zellen haben häufig in der Grund dissoziiert Kulturen, Neuron Kokulturen untersucht worden, und in fixiertem Gewebe. Mit neu verfügbaren transgenen Mauslinien schneiden Kultursysteme können verwendet werden, um die Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozyten-Linie Zellen in beiden grauen und weißen Substanz Regionen des Vorderhirns und des Kleinhirns zu untersuchen. Schnittkulturen sind aus der frühen postnatalen Mäusen hergestellt und in Kultur für bis zu 1 Monat gehalten. Diese Scheiben kann mehrfach über die Kulturzeit abgebildet werden, um das Zellverhalten und Wechselwirkungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von NG2 Zellteilung und die Schritte, die zu Oligodendrozyten-Differenzierung und ermöglichen detaillierte Analyse der Region-abhängigent NG2 Zelle und Oligodendrozyten funktionelle Heterogenität. Dies ist eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden können, um die innere und äußere Signale in einer zellulären Umgebung, die sehr ähnlich, die in vivo gefunden Beeinflussung dieser Zellen mit der Zeit zu untersuchen.

Beispiele für repräsentative Daten sind unten angegeben, die mit Schnittkulturen sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn der P8 NG2cre erhalten worden sind: ZEG, NG2creER: YFP und PLPDsRed transgenen Mauslinien. NG2 Zellen über Tage in Vorderhirn und Kleinhirn Scheiben (1B-D, Video 1) und der Phänotyp dieser Zellen abgebildet werden kann, nach der Fixierung bestimmt und Immunfärbung mit NG2 und CC1 Antikörper (1E). Neben der Echtzeit-Bildgebung kann die Zellproliferation auch mit immunh...

Eine Technik zur Untersuchung von NG2-Zellen und Oligodendrozyten unter Verwendung eines Schnittkultursystems des Vorderhirns und des Kleinhirns wird beschrieben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Proliferation und Differenzierung von Zellen innerhalb der Oligodendrozytenlinie, bei der die extrazelluläre Umgebung leicht manipuliert werden kann, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Proliferation und Differenzierung von Zellen der Oligodendrozytenlinie in einer Umgebung zu untersuchen, die der in vivo sehr ähnlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Schnittkulturen von vier Gehirnen und Kleinhirn von frühen postnatalen transgenen Mäusen hergestellt werden. Einzelne Zellen in den Schnitten werden dann über Zeiträume von Stunden bis Tagen abgebildet, um die zelluläre Dynamik ihrer Proliferation und Differenzierung zu visualisieren.Nach der Bildgebung wird die post-hoc-Immunhistochemie der Zellen verwendet, um verschiedene zelluläre Eigenschaften zu bestimmen. Letztendlich können die Ergebnisse die Dynamik der Zellproliferation und -differenzierung unter normalen Bedingungen und nach pharmakologischer oder genetischer Manipulation zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dissoziierter Kohle, Kulturen von Neuronen und Zellen der Liga-Inzyten-Linie besteht darin, dass Schnittkulturen die Manipulation der azellulären Umgebung ermöglichen, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.Alle Verfahren an Tieren entsprechen den Richtlinien und wurden mindestens zwei Stunden vor der Sektion vom institutionellen Animal Care and Use Committee an der University of Connecticut genehmigt. Bereiten Sie Gewebekultureinsätze in jeweils sechs Well-Platten vor. Nun, fügen Sie einen Milliliter Scheibenkulturmedium hinzu und geben Sie dann die Platten mindestens 15 Minuten vor der Dissektion bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Zellkultur-Inkubator.Legen Sie den Sezierpuffer auf Eis und beginnen Sie, ihn mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxidgas zu sprudeln. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle Werkzeuge und der Gewebezerkleinerer mit 70 % Ethanol sterilisiert sind. Übertragen Sie das Gewebe in eine sterile 35-Millimeter-Schale mit eiskaltem, sauerstoffreichem Dissektionspuffer.Als nächstes durchtrennen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn und das Vorderhirn, gefolgt von einem sagittalen Schnitt durch das Vorderhirn und das Kleinhirn, der die Hemisphären trennt. Machen Sie nun mit dem manuellen Zerkleinerer 300 Mikrometer dicke koronale und sagittale Abschnitte der vier Gehirne und des Kleinhirns. Jedes Tier liefert in der Regel sechs, vier Gehirnscheiben und sechs Kleinhirnscheiben.Idealerweise werden Schnitte genommen, die sich über das vordere Drittel des Corpus callosum erstrecken, um sowohl die Bereiche der grauen als auch der weißen Substanz in derselben Schicht zu untersuchen. Übertragen Sie die getrennten Scheiben mit einem kleinen Präparier- oder Wiegespatel in einen frisch gesprudelten Kaltdissektionspuffer auf Eis im Puffer. Trennen Sie die einzelnen Abschnitte und überführen Sie sie in die Vorinkubation.Sechs Brunnenschalen mit Kultivierungseinsätzen. Zwei bis drei Scheiben können auf eine Kultur gelegt werden. Führen Sie die Pipette von überschüssigem Dissektionspuffer von der Oberfläche der Kultur ein.Setzen Sie die Platten ein und legen Sie sie in den Inkubator, bis sie fixiert sind. Das Scheibenmedium sollte einen Tag nach der Scheibenvorbereitung und dann jeden zweiten Tag bis zur Scheibenfixierung wie im Protokoll angegeben ausgetauscht werden. Je nach Experiment verwenden Sie die Scheiben nach fünf bis sieben Tagen.In der Kultur. Verwenden Sie nur die Scheiben, die nach den ersten Tagen transparent werden, und entsorgen Sie diejenigen, die unebene, undurchsichtige Bereiche aufweisen, die mit bloßem Auge sichtbar sind. Im Gesichtskontrast erscheinen diese undurchsichtigen Bereiche als ein Klumpen dunkler Zellen.Bei korrekter Ausführung treten undurchsichtige Bereiche in nicht mehr als einem bis 5 % der Schichten auf. Um eine Zeitrafferbildgebung der NG-Zwei-Zell-Proliferation und -Differenzierung durchzuführen, verwenden Sie drei bis fünf Tage alte Schnitte von Mäusen, die EGFP in NG-Zwei-Zellen exprimieren. Lassen Sie die Objektträger nicht länger als 15 Minuten unter 37 Grad Celsius fallen.Verwenden Sie pro Bildgebungssitzung bei geschlossener Platte das 10-fache Objektiv eines inversen Fluoreszenzmikroskops, um zum ersten Mal Bilder aufzunehmen. Punkt der Kultur. Stellen Sie vier bis acht Positionen auf jeder Schicht sowohl aus den Bereichen der grauen als auch der weißen Substanz der Schicht dar.Stellen Sie auch nützliche Orientierungspunkte wie die Kanten der Scheiben, bestimmte Zellen oder die Ausrichtung von Trakten der weißen Substanz für Verlagerungszwecke dar. Das vorherige Zeitpunktbild kann als Referenzbild während des Relocations für die NG-Zweizellteilung und die Oligodendrozytendifferenzierung verwendet werden. Nehmen Sie alle vier bis sechs Stunden Bilder auf, idealerweise fünf bis sieben Tage lang.Wenn der induzierbare Marker NG two cre, ER YFP verwendet wird, ist die Reporterexpression unter Verwendung eines Kulturmediums mit 100 Nanomolaren zu induzieren. Vier Hydroxytamoxifen, die in der Ethanol-Reporteraktivität gelöst sind, sollten innerhalb von ein bis zwei Tagen auftreten. Zur Fixierung gibst du einen Milliliter Fixiermittel auf den Boden der Kultur.Einen weiteren Milliliter auf die Scheiben geben und darauf geben. Spritzen Sie das Fixiermittel nicht direkt auf die Scheiben, da sie sich sonst ablösen können. Fixieren Sie das Taschentuch 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und verwenden Sie dann ein Skalpell.Schneiden Sie die Membranen mit den daran befestigten Scheiben aus. Übertragen Sie die Scheiben mit einer Pinzette vorsichtig in einzelne Vertiefungen einer mit PBS beladenen 24-Well-Platte. Übertragen Sie anschließend die Scheiben auf eine zweite 24-Well-Platte, die mit Blockierungslösung beladen ist, die 5 % normales Ziegenserum und 0,1 % Tritton X 100 in PBS enthält.Lassen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Blockierlösung inkubieren. Nach der Blockierung werden die Scheiben auf eine Platte gelegt, die mit Primärantikörpern in PBS mit 5 % NGS beladen ist. Lassen Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius brüten.Die Scheiben in PBS waschen. Dann inkubieren Sie die Scheiben mit Sekundärantikörpern in PBS mit 5%NGS. Lassen Sie die Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur laufen.Lassen Sie dies mit drei weiteren Waschgängen in PBS wie zuvor folgen und montieren Sie die Scheiben mit der Membran zum Objektträger hin, so dass sie nicht zwischen dem Objektiv und dem Gewebe liegt. Um die zeitliche Dynamik der Oligodendrozytendifferenzierung zu analysieren, wurden Bilder der NG-Zwei-Zellteilung aus Schnittkulturen des Vorderhirns von P 8 NG zwei Creeg-transgenen Mäusen über mehrere Tage und Zeitraffersequenzen über 122 Stunden aufgenommen. Der Phänotyp der geteilten Zellen wurde mit NG zwei und CC 1 Antikörpern bestimmt.Die Zellproliferation wurde auch mittels immunhistochemischer Färbung des Zellproliferationsmarkers bestimmt. Die KI 67-Köderkartierung von NG zwei Zellen wurde nach Induktion der CRE-Rekombination in Schnitten von NG zwei CRE YFP-Mäusen durchgeführt. Zwei Tage nach Zugabe von vier Hydroxytamoxifen.In den Kulturen wurden zwei positive Zellen gefunden, die NG exprimieren. Vier Tage später differenzierte sich ein Teil dieser Zellen zu CC-1-positiven Oligodendrozyten-Zyten. Reife Oligodendrozyten wurden in Kleinhirnschnittkulturen von P-L-P-D-S abgebildet.Myelinisierte Perkin-Neuronen von roten Mäusen waren in diesen Kulturen vorhanden. Wiederholte Bildgebung zeigte die Zugabe von myelinisierendem DS-Rot, das Oligodendrozyten exprimiert; die Immunhistochemie in diesen Schnitten zeigte eine erhebliche Expression des basischen Myelinproteins. Schließlich zeigte die Bildgebung mit höherer zeitlicher Auflösung stabile Oligodendrozyten-Zellkörper mit einigen geringfügigen Bewegungen in distalen Fortsätzen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Schnittkulturen aus dem vier Gehirn und dem Kleinhirn vorbereiten, wiederholt einzelne Zellen über Tage bis Stunden abbilden und das Schicksal von Bildzellen mit Hilfe der Post-Ho-Immunhistochemie analysieren können. Neben der Bildgebung ermöglichen diese Scheiben auch die Manipulation der zellulären Umgebung unter Verwendung von Fate-Mapping-Techniken, wie z. B. der induzierbaren Cremerekombination in einer vorbereiteten Scheibe.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Dieses Video demonstriert eine ex vivo Technik zur Induktion des Zelltods im Gehirn, vermittelt durch zytotoxische CD8+ T-Zellen. Nach der Gewinnung von Hirnschnitten werden aktivierte Oligodendrozyten-gerichtete CD8+ T-Zellen auf die Schnitte übertragen, um die Myelinscheide und die Oligodendrozyten anzugreifen. Nach der Inkubation können die Schädigung des Myelins und der neuronale Tod in den interessierenden Regionen histologisch beurteilt werden.

Eine ex vivo Technik zur Induktion des neuronalen Todes über Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen

Quelle: Kennedy, L. H., et. al. Visualisierung und Live-Bildgebung von Oligodendrozyten-Organellen in organotypischen Hirnschnitten mittels Adeno-assoziierter Virus- und Konfokalmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Bildgebung von Oligodendrozyten-Mitochondrien in organotypischen Schnitten des Gehirns von Mäusen. Die Scheibe wird in eine Badekammer mit kontinuierlicher Flüssigkeitszirkulation und kontrollierter Temperatur gelegt. Nach dem Einstellen verschiedener Parameter des...

Konfokale Bildgebung der mitochondrialen Bewegung in Oligodendrozyten in organotypischen Hirnschnittkulturen

Um die Mechanismen der Demyelinisierung und der neuronalen Apoptose in kortikalen Läsionen von entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet. Wir beschreiben hier einen ex vivo Ansatz, bei dem Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen auf Hirnschnitten verwendet werden, was zum oligodendroglialen und neuronalen Tod führt. Mögliche Anwendungen und Grenzen des Modells werden diskutiert.

Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

Erfahren Sie, wie Sie mit organotypischen Hirnschnittkulturen aus transgenen Mäusen die Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozyten-Liniezellen untersuchen. Diese Methode ermöglicht Langzeitbildgebung und post-hoc-Immunhistochemie zur Analyse zellulärer Dynamiken in intaktem Gewebe.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

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