Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Proliferation und Differenzierung von Zellen der Oligodendrozytenlinie in einer Umgebung zu untersuchen, die der in vivo sehr ähnlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Schnittkulturen von vier Gehirnen und Kleinhirn von frühen postnatalen transgenen Mäusen hergestellt werden. Einzelne Zellen in den Schnitten werden dann über Zeiträume von Stunden bis Tagen abgebildet, um die zelluläre Dynamik ihrer Proliferation und Differenzierung zu visualisieren.

Nach der Bildgebung wird die post-hoc-Immunhistochemie der Zellen verwendet, um verschiedene zelluläre Eigenschaften zu bestimmen. Letztendlich können die Ergebnisse die Dynamik der Zellproliferation und -differenzierung unter normalen Bedingungen und nach pharmakologischer oder genetischer Manipulation zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dissoziierter Kohle, Kulturen von Neuronen und Zellen der Liga-Inzyten-Linie besteht darin, dass Schnittkulturen die Manipulation der azellulären Umgebung ermöglichen, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

Alle Verfahren an Tieren entsprechen den Richtlinien und wurden mindestens zwei Stunden vor der Sektion vom institutionellen Animal Care and Use Committee an der University of Connecticut genehmigt. Bereiten Sie Gewebekultureinsätze in jeweils sechs Well-Platten vor. Nun, fügen Sie einen Milliliter Scheibenkulturmedium hinzu und geben Sie dann die Platten mindestens 15 Minuten vor der Dissektion bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Zellkultur-Inkubator.

Legen Sie den Sezierpuffer auf Eis und beginnen Sie, ihn mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxidgas zu sprudeln. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle Werkzeuge und der Gewebezerkleinerer mit 70 % Ethanol sterilisiert sind. Übertragen Sie das Gewebe in eine sterile 35-Millimeter-Schale mit eiskaltem, sauerstoffreichem Dissektionspuffer

Als nächstes durchtrennen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn und das Vorderhirn, gefolgt von einem sagittalen Schnitt durch das Vorderhirn und das Kleinhirn, der die Hemisphären trennt. Machen Sie nun mit dem manuellen Zerkleinerer 300 Mikrometer dicke koronale und sagittale Abschnitte der vier Gehirne und des Kleinhirns. Jedes Tier liefert in der Regel sechs, vier Gehirnscheiben und sechs Kleinhirnscheiben.

Idealerweise werden Schnitte genommen, die sich über das vordere Drittel des Corpus callosum erstrecken, um sowohl die Bereiche der grauen als auch der weißen Substanz in derselben Schicht zu untersuchen. Übertragen Sie die getrennten Scheiben mit einem kleinen Präparier- oder Wiegespatel in einen frisch gesprudelten Kaltdissektionspuffer auf Eis im Puffer. Trennen Sie die einzelnen Abschnitte und überführen Sie sie in die Vorinkubation.

Sechs Brunnenschalen mit Kultivierungseinsätzen. Zwei bis drei Scheiben können auf eine Kultur gelegt werden. Führen Sie die Pipette von überschüssigem Dissektionspuffer von der Oberfläche der Kultur ein.

Setzen Sie die Platten ein und legen Sie sie in den Inkubator, bis sie fixiert sind. Das Scheibenmedium sollte einen Tag nach der Scheibenvorbereitung und dann jeden zweiten Tag bis zur Scheibenfixierung wie im Protokoll angegeben ausgetauscht werden. Je nach Experiment verwenden Sie die Scheiben nach fünf bis sieben Tagen.

In der Kultur. Verwenden Sie nur die Scheiben, die nach den ersten Tagen transparent werden, und entsorgen Sie diejenigen, die unebene, undurchsichtige Bereiche aufweisen, die mit bloßem Auge sichtbar sind. Im Gesichtskontrast erscheinen diese undurchsichtigen Bereiche als ein Klumpen dunkler Zellen.

Bei korrekter Ausführung treten undurchsichtige Bereiche in nicht mehr als einem bis 5 % der Schichten auf. Um eine Zeitrafferbildgebung der NG-Zwei-Zell-Proliferation und -Differenzierung durchzuführen, verwenden Sie drei bis fünf Tage alte Schnitte von Mäusen, die EGFP in NG-Zwei-Zellen exprimieren. Lassen Sie die Objektträger nicht länger als 15 Minuten unter 37 Grad Celsius fallen.

Verwenden Sie pro Bildgebungssitzung bei geschlossener Platte das 10-fache Objektiv eines inversen Fluoreszenzmikroskops, um zum ersten Mal Bilder aufzunehmen. Punkt der Kultur. Stellen Sie vier bis acht Positionen auf jeder Schicht sowohl aus den Bereichen der grauen als auch der weißen Substanz der Schicht dar.

Stellen Sie auch nützliche Orientierungspunkte wie die Kanten der Scheiben, bestimmte Zellen oder die Ausrichtung von Trakten der weißen Substanz für Verlagerungszwecke dar. Das vorherige Zeitpunktbild kann als Referenzbild während des Relocations für die NG-Zweizellteilung und die Oligodendrozytendifferenzierung verwendet werden. Nehmen Sie alle vier bis sechs Stunden Bilder auf, idealerweise fünf bis sieben Tage lang.

Wenn der induzierbare Marker NG two cre, ER YFP verwendet wird, ist die Reporterexpression unter Verwendung eines Kulturmediums mit 100 Nanomolaren zu induzieren. Vier Hydroxytamoxifen, die in der Ethanol-Reporteraktivität gelöst sind, sollten innerhalb von ein bis zwei Tagen auftreten. Zur Fixierung gibst du einen Milliliter Fixiermittel auf den Boden der Kultur.

Einen weiteren Milliliter auf die Scheiben geben und darauf geben. Spritzen Sie das Fixiermittel nicht direkt auf die Scheiben, da sie sich sonst ablösen können. Fixieren Sie das Taschentuch 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und verwenden Sie dann ein Skalpell.

Schneiden Sie die Membranen mit den daran befestigten Scheiben aus. Übertragen Sie die Scheiben mit einer Pinzette vorsichtig in einzelne Vertiefungen einer mit PBS beladenen 24-Well-Platte. Übertragen Sie anschließend die Scheiben auf eine zweite 24-Well-Platte, die mit Blockierungslösung beladen ist, die 5 % normales Ziegenserum und 0,1 % Tritton X 100 in PBS enthält.

Lassen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Blockierlösung inkubieren. Nach der Blockierung werden die Scheiben auf eine Platte gelegt, die mit Primärantikörpern in PBS mit 5 % NGS beladen ist. Lassen Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius brüten.

Die Scheiben in PBS waschen. Dann inkubieren Sie die Scheiben mit Sekundärantikörpern in PBS mit 5%NGS. Lassen Sie die Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur laufen.

Lassen Sie dies mit drei weiteren Waschgängen in PBS wie zuvor folgen und montieren Sie die Scheiben mit der Membran zum Objektträger hin, so dass sie nicht zwischen dem Objektiv und dem Gewebe liegt. Um die zeitliche Dynamik der Oligodendrozytendifferenzierung zu analysieren, wurden Bilder der NG-Zwei-Zellteilung aus Schnittkulturen des Vorderhirns von P 8 NG zwei Creeg-transgenen Mäusen über mehrere Tage und Zeitraffersequenzen über 122 Stunden aufgenommen. Der Phänotyp der geteilten Zellen wurde mit NG zwei und CC 1 Antikörpern bestimmt.

Die Zellproliferation wurde auch mittels immunhistochemischer Färbung des Zellproliferationsmarkers bestimmt. Die KI 67-Köderkartierung von NG zwei Zellen wurde nach Induktion der CRE-Rekombination in Schnitten von NG zwei CRE YFP-Mäusen durchgeführt. Zwei Tage nach Zugabe von vier Hydroxytamoxifen.

In den Kulturen wurden zwei positive Zellen gefunden, die NG exprimieren. Vier Tage später differenzierte sich ein Teil dieser Zellen zu CC-1-positiven Oligodendrozyten-Zyten. Reife Oligodendrozyten wurden in Kleinhirnschnittkulturen von P-L-P-D-S abgebildet.

Myelinisierte Perkin-Neuronen von roten Mäusen waren in diesen Kulturen vorhanden. Wiederholte Bildgebung zeigte die Zugabe von myelinisierendem DS-Rot, das Oligodendrozyten exprimiert; die Immunhistochemie in diesen Schnitten zeigte eine erhebliche Expression des basischen Myelinproteins. Schließlich zeigte die Bildgebung mit höherer zeitlicher Auflösung stabile Oligodendrozyten-Zellkörper mit einigen geringfügigen Bewegungen in distalen Fortsätzen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Schnittkulturen aus dem vier Gehirn und dem Kleinhirn vorbereiten, wiederholt einzelne Zellen über Tage bis Stunden abbilden und das Schicksal von Bildzellen mit Hilfe der Post-Ho-Immunhistochemie analysieren können. Neben der Bildgebung ermöglichen diese Scheiben auch die Manipulation der zellulären Umgebung unter Verwendung von Fate-Mapping-Techniken, wie z. B. der induzierbaren Cremerekombination in einer vorbereiteten Scheibe.