Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Gewinnung von Olink-Glykanen. Dies wird erreicht, indem zunächst Glykoproteine mit Hilfe der SDS-Seite aufgelöst werden. Der zweite Schritt besteht darin, Gelstücke zu waschen, die das gewünschte Glykoprotein enthalten.

Als nächstes werden die Olink-Glykane durch reduktive Beta-Eliminierung freigesetzt. Der letzte Schritt ist Glykan pro Methylierung mit Phasenteilung. Letztendlich werden perm-methylierte Glykane mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert, um Strukturen zu erkennen und Häufigkeiten zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie besteht darin, dass unsere Methode neutrale und geladene pro methylierte Glykane in einer schnellen Phasenverteilung trennt. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Glykowissenschaft zu beantworten, indem sie eine umfassende Charakterisierung von oder verknüpften Glykanen ermöglicht, die von aufgelösten Glykoproteinen freigesetzt werden. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, lösen Sie Glykoproteine mit Hilfe der Gelelektrophorese auf.

Nach der Elektrophorese legen Sie das Gel auf eine Glasplatte und schneiden Sie die interessierende Region mit einem sauberen Skalpell heraus, um die Ausbeute an OG-Glykanen zu erhöhen. Übertragen Sie das gewünschte Gelband auf eine andere Glasplatte und schneiden Sie das Stück in etwa zwei Millimeter große Würfel. Übertragen Sie die kleinen Gelstücke mit einem Mikrospatel aus Edelstahl in ein 13 x 100 Millimeter großes Glasröhrchen mit Schraubverschluss.

Geben Sie anschließend einen Milliliter 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat oder Ambi in das Probenröhrchen. Nachdem Sie die Tube mit einem Teflon-Leinen-Schraubverschluss verschlossen haben, mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie die Tube schnippen, bevor Sie sie 10 Minuten lang stehen lassen. Entfernen Sie dann vorsichtig den Ausschnitt aus dem Glasrohr.

Geben Sie mit einer Weide- oder Glaspipette einen Milliliter Acetonitril in das Glasröhrchen, um die Gelstücke vollständig zu bedecken. Nachdem Sie das Röhrchen verschlossen haben, mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie das Röhrchen schnippen, bevor Sie es 10 Minuten lang stehen lassen. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie das Acetonitril aus dem Glasrohr.

Nachdem Sie die vorherigen Schritte wiederholt haben, bis die hellblaue Farbe verschwunden ist, fügen Sie zwei Milliliter Ethylacetat hinzu und verschließen Sie die Tube wieder. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius unter durchgehendem Rühren auf. Nachdem die Ethylacetat-Waschung entfernt wurde, führen Sie drei Waschgänge mit zwei Millilitern entionisiertem Wasser durch.

Sobald die Gelstücke getrocknet sind, fügen Sie 500 Mikroliter einer 100 millimolaren Natronlauge hinzu. Und lassen Sie uns drei bis fünf Minuten auf Eis stehen, um das Gel auf die Grundbedingungen auszugleichen, die die Glykanrückgewinnung verbessern. Anschließend fügen Sie 500 Mikroliter zwei molare Natriumborhydrid in 100 millimolare Natriumhydroxid hinzu, was zu Endkonzentrationen von einem molaren Natriumborhydrid in 100 millimolaren Natriumhydroxid führt.

Nachdem Sie das Röhrchen vorsichtig gemischt haben, inkubieren Sie die Probe 18 Stunden lang bei 45 Grad Celsius. Mischen Sie das Röhrchen während der ersten Stunde der Inkubation alle 15 Minuten vorsichtig. Nachdem die Beta-Eliminationsreaktion abgeschlossen ist und das Röhrchen auf Eis gestellt wurde, fügen Sie langsam 10% Essigsäure tropfenweise hinzu.

Um die Basis zu neutralisieren, wirbeln Sie das Probenröhrchen vorsichtig zwischen der Zugabe von Essigsäure vor, zentrifugieren Sie das Röhrchen, um Blasen zu beseitigen und ein Überlaufen zu verhindern, falls erforderlich. Um eine kleine Glassäule herzustellen, zerkratzen und brechen Sie die Spitze einer Weide- oder Glaspipette mit einem Keramikschneider, so dass die Verjüngung der Pipettenspitze etwa einen Zentimeter lang ist. Nachdem du einen Stöpsel aus Glaswolle auseinandergezogen hast, schiebe ihn in Richtung Spitze, um eine Stütze für das Harzbett zu bilden.

Befestigen Sie die Pipettensäule mit einer Wäscheklammer und legen Sie sie über ein Glasreagenzglas. Waschen Sie anschließend die leere Pipette mit Glaswolle mit einem Milliliter Methanol und drei Millilitern 5%iger Essigsäure. Nach dem Schwenken von Dow X Wasserstoff-Kationenaustauscherharz in 5%iger Essigsäure aufschlämmen.

Übertragen Sie so viel davon, dass ein Milliliter Bettvolumen in der Weidepipettensäule entsteht, spülen Sie die Säule mit fünf Volumina 5%iger Essigsäure und überprüfen Sie den Durchfluss auf das Auftreten von Harzpartikeln. Nachdem Sie die Säule auf ein neues 16 x 125 Millimeter großes Glasröhrchen mit Schraubverschluss gesetzt haben, laden Sie die Probe auf die Säule. Sobald der Durchfluss aufgefangen wurde, eluieren Sie Glykane mit mindestens drei Volumina 5%iger Essigsäure in dasselbe Röhrchen.

Nach der Lyophilisierung werden 300 Mikroliter 10%ige Essigsäure in Methanol in das getrocknete Probenröhrchen gegeben. Nach dem Vortexen wird das entstandene Trimethylbat durch Verdampfen unter einem Stickstoffstrom bei 37 Grad Celsius entfernt. Nachdem die Resuspensions- und Trocknungsschritte mindestens viermal wiederholt wurden, wird die Probe in 5%iger Essigsäure rekonstituiert.

Nachdem die Probe auf eine äquilibrierte C 18-Säule geladen wurde, wird der Durchfluss in ein 13 x 100 Millimeter großes Glasröhrchen mit Schraubverschluss gefüllt. Eluieren Sie die OOG-Glykane mit drei Millilitern 5%iger Essigsäure in dasselbe Röhrchen. Anschließend wird die Probe lyophilisiert, um das Basisreagenz für die Dauerwellenmethylierung vorzubereiten.

Geben Sie 400 Mikroliter 50%iges Natriumhydroxid in ein sauberes 13 x 100 Millimeter großes Glasschraubrohr. Geben Sie dann 800 Mikroliter wasserfreies Methanol in dasselbe Röhrchen. Fügen Sie vier Milliliter wasserfreies Dimethylsulfoxid hinzu und wirbeln Sie es vortexen, um einen weißen Niederschlag zu erzeugen.

Die Probe wird eine Minute lang bei 600 mal G zentrifugiert, um den Niederschlag zu pelletieren. Nach dem Verwerfen des Überstands und der Zugabe von vier Millilitern wasserfreiem Dimethylsulfoxid zum Pelletwirbel des Reagenzes: Wiederholen Sie dies noch viermal, bis die Basisaufschlämmung durchscheinend wird. Die pelletierte Base wird in drei Millilitern wasserfreiem Dimethylsulfoxid aufgelöst und durch Auf- und Abpipettieren mit einer sauberen Weidepipette vorsichtig gemischt.

Geben Sie anschließend 200 Mikroliter wasserfreies Dimethylsulfoxid in die getrocknete Probe und wirbeln Sie sie ein. Um es wieder zu suspendieren, fügen Sie der Probe 300 Mikroliter der resuspendierten Basisaufschlämmung hinzu und fügen Sie sofort 100 Mikroliter ITOM-Methan hinzu. Verschließen Sie die Tube mit einer mit Teflon ausgekleideten Kappe und mischen Sie sie fünf Minuten lang kräftig durch Vortexen.

Um die Perm-Methylierungsreaktion zu stoppen, stellen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie zwei Milliliter 5%ige Essigsäure hinzu. Nach dem Vortexen pipettieren Sie die Lösung fünfmal auf und ab, um das verbleibende Volumen an ITOM-Methan durch Verdampfung zu reduzieren. Zu diesem Zeitpunkt werden der Probe nach dem Vortexen und Zentrifugieren zwei Milliliter Dichlormethan zugesetzt.

Übertragen Sie die oberste wässrige Schicht in ein neues 13 x 100 Millimeter großes Glasrohr. Nach Wiederholung der wässrigen Waschung der Dichlormethanschicht wird die zweite wässrige Phase mit der ersten wässrigen Schicht kombiniert. Nachdem die Wasserwäsche der Di-Chlormethan-Phase zwei- bis dreimal wiederholt wurde, wird die Di-Chlormethan-Phase mit einer sauberen Weidepipette in ein sauberes Glasröhrchen überführt.

Anschließend trocknen Sie die organische Phase unter einem Stickstoffstrom bei 42 Grad Celsius. Nach dem Aufäquilibrieren einer C 18-Säule und dem Laden der wässrigen Schicht auf diese. Waschen Sie die C 18-Säule mit Wasser und eluieren Sie dann die perm methylierten sulfatierten O-Glykane in ein neues Glasröhrchen mit zwei Millilitern 50 % Aceto-Nitril, analysieren Sie perm methylierte OG-Glykane durch direkte Infusion in ein geeignetes Massenspektrometer unter Verwendung einer Nano-Elektrosprayquelle bei einer Spritzenflussrate von 0,4 bis 0,6 Mikrolitern pro Minute bei 210 Grad Celsius.

Die Kapillartemperatur für die Fragmentierung durch kollisionsinduzierte Dissoziation in MSM S und multidimensionaler MS eines Ionenfallen-Instruments wird auf 30 bis 40 % Kollisionsenergie angewendet. Repräsentative Massenspektren von perm-methylierten Olink-Glykanproben, die aus Rindermuzin unter Verwendung von reduktiver Beta-Eliminierung freigesetzt werden, sind hier im oberen Bild dargestellt. Das Spektrum wird von einer polydispersen Verunreinigung dominiert, die vom Polyacrylamidgel abgeleitet ist. Die Unterseite zeigt, dass die Ethylacetat-Waschung der Gelstücke vor der Beta-Eliminierung dieses Problem beseitigt.

Oinkierte Glykane wurden aus dem Muzin des Rindersubmaxillars durch reduktive Ingel-Beta-Eliminierung unter Verwendung von Gelstücken freigesetzt, die entweder klein oder groß geschnitten wurden. Die Rückgewinnung von eingeknickten Glykanen aus kleinen Gelstückchen war fast zehnmal größer als aus großen Gelscheiben. Methylierte Glykane mit neutraler Dauerwelle werden in der organischen Dichlormethanphase zurückgewonnen.

Während onic perm methylierte Glykane quantitativ in die Wasserphase aufgeteilt werden. Die Effizienz und Einfachheit der Phasenteilungsmethode erleichtert den Probendurchsatz und die anschließenden analytischen Ansätze erheblich. Nicht sulfatierte perm-methylierte O-Glykane wurden aus der organischen Phase gewonnen, und alle perm-methylierten Sulglykane wurden aus der wässrigen Phase zurückgewonnen, was die Identifizierung und Charakterisierung von nahezu isobaren, sulfatierten und nicht-sulfatierten Glykanen erleichtert.

Diese Glykane unterscheiden sich nur um 0,1 Masseneinheiten und wären schwer aufzulösen, ohne die beiden Spezies nach ihrer Entwicklung physisch durch Phasenteilung zu trennen. Diese Technik hat eine gründliche Untersuchung der Glykandiversität in Gewebeproben, kultivierten Zellen, Modellsystemen und Patientenproben ermöglicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie alle verknüpften Glykane, die von den Gly-Proteinen freigesetzt werden, erfolgreich handhaben und verteilen können.

Aufgelöst durch die SDS-Seite.