In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Rekonstitution von in vitro lichterntenden Pigmentproteinkomplexen von Pflanzen oder Algen. Dies wird durch die Extraktion der Pigmente aus Spinatblättern oder Algenkulturen und die Überexpression des APA-Protes in E. coli erreicht. In einem zweiten Schritt wird das APA-Prote mit den Pigmenten vermischt, um einen rekonstituierten Komplex zu erhalten.

Als nächstes wird der rekonstituierte Pigmentproteinkomplex von den überschüssigen Pigmenten gereinigt und die entfalteten Proteinergebnisse erhalten, die ähnliche spektroskopische Eigenschaften des rekonstituierten Pigmentproteinkomplexes und des nativen Komplexes auf der Grundlage von Absorptionsspektren, Fluoreszenzspektren und zirkulärem Deismus aufweisen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es uns ermöglicht, eine relativ hohe Menge an Pigmentproteinkomplexen zu erhalten und die Komplexe auch mit Hilfe von mutierten Protein- und Pigmentmischungen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen zu manipulieren. Das Verfahren wird Alberto na, ein Doktorand im Labor, um das Verfahren zur Extraktion des Gesamtpigments aus Spinatblättern zu beginnen. Verwenden Sie einen Mixer, um eine Handvoll Spinat zu homogenisieren, lassen Sie etwa 20 Gramm in 100 Millilitern Kaltmahlpuffer für 20 Sekunden übrig.

Filtrieren Sie die Lösung durch zwei Schichten Nylongewebe mit einem schlechten Durchmesser von 20 Mikrometern und zentrifugieren Sie das Filtrat 10 Minuten lang bei 1.500 g. Bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Kaltwaschpuffer hinzu.

Suspendieren Sie das Pellet mit den Chloroplasten mit einem weichen Künstlerpinsel. Sobald das Pellet resuspendiert ist, fügen Sie 50 Milliliter Waschmittel, Puffer und Zentrifuge hinzu, eine Lösung mit 10.000 g für 10 Minuten. Entfernen Sie bei vier Grad Celsius den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 50 Millilitern Waschpufferzentrifuge, einer Lösung bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie den Überstand ab diesem Zeitpunkt vollständig.

Dieser Vorgang muss im Dunkeln durchgeführt werden. Um eine Pigmentoxidation zu vermeiden, fügen Sie etwa 20 Milliliter 80%iges Aceton hinzu, das mit Natriumcarbonat gepuffert ist, um die Pigmente zu extrahieren, und lassen Sie die Lösung 10 Minuten lang auf Eis. Gelegentlich werden die zellulären Bestandteile durch Vortexen durch Zentrifugation bei 12.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius paletten.

vollständige Pigmentextraktion sollte zu einem weißen Pellet führen. Sammle die Schlinge in einem Scheidetrichter. Fügen Sie 0,4 Volumen Dathylether hinzu.

Schütteln Sie kräftig und achten Sie darauf, die Ventile zu öffnen, um das Gas abzulassen. 0,8 Volumen molares Natriumchlorid (Punkt 33) zugeben und kräftig mischen. Warten Sie ca. 10 Minuten, bis sich die Schichten getrennt haben.

Die Etherphase auf der Oberseite enthält die extrahierten Pigmente. Entfernen und entsorgen Sie die klare untere Phase. Entfernen Sie den Äther, indem Sie ihn von der Oberseite des Scheidetrichters in einen geeigneten Glasbehälter gießen.

Trocknen Sie den Äther, indem Sie einen Löffel körniges wasserfreies Natriumsulfat hinzufügen. Schwenken Sie die Lösung und lassen Sie das Trockenmittel etwa fünf Minuten lang Wasser aus dem Äther aufnehmen. Wenn der Äther ausreichend getrocknet ist.

Es sollten einige frei schwebende Kristalle vorhanden sein und das Natriumsulfat sollte nicht verklumpen. Dekantieren Sie den Äther in einen neuen Glasbehälter, lassen Sie den Natriumsulfatfest hinter sich, aliquotieren Sie die Pigmente und trocknen Sie sie in einem Vakuum mit Drehzahl, bis das Aceton vollständig verdampft ist. Lagern Sie die getrockneten Pigmente bei minus 80 Grad Celsius.

Die Extraktion von Keratinoid aus Spinat ist in diesem Video nicht zu sehen, aber die getrockneten Pigmente werden ebenfalls bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Der Light Harvesting Complex oder LHC für die Rekonstitution wurde in Form von Einschlusskörpern exprimiert und von E. coli gereinigt. Für den Erfolg der Rekonstitution ist das Verhältnis zwischen Pigmentproteinen und der Menge des Puffereinsatzes entscheidend.

Dieser Vorgang sollte bei schwachem Licht durchgeführt werden. Resuspendieren Sie 800 Mikrogramm LHC-Einschlusskörper in insgesamt 400 Mikrolitern te. In ein Zwei-Milliliter-Fuge-Röhrchen werden 400 Mikroliter mit zwei x Rekonstitution, Puffer und Vortex gegeben.

Geben Sie kurz 0,6 Mikroliter einer 14,8 molaren Beta-Mar-CAPTA-Ethanolbrühe hinzu. Um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erhalten, erhitzen Sie das Protein eine Minute lang auf 98 Grad Celsius. Kurz einreiben und drei Minuten bei Raumtemperatur aufstellen.

Resuspendieren Sie insgesamt 500 Mikrogramm getrockneter Chlorophyllpigmente plus 80 Mikrogramm Keratinoidpigmente in 30 Mikrolitern 100%igem Ethanol durch kräftiges Vortexen. Eine Minute lang. Schleudern Sie die Pigmentmischung bei 15.800 g bei vier Grad Celsius für etwa 30 Sekunden und bestätigen Sie, dass unmittelbar nach dem Schleudern kein Pellet vorhanden ist. Geben Sie die Pigmentmischung langsam zum abgekühlten Protein, während Sie wirbeln.

Achte darauf, dass du nicht zu stark wirbelst, da das Protein den oberen Teil des Röhrchens überlaufen kann. Fahren Sie mit dem Vortexen für fünf bis 10 Sekunden fort und legen Sie dann das Rohr auf nasses Eis. Fügen Sie 94 Mikroliter 20%Oktal, Beta-D-Glukozid oder og hinzu, um eine Endkonzentration von 2%Vortex kurz zu erhalten und 10 Minuten auf Eis zu halten, fügen Sie 90 Mikroliter zweimolares Kaliumchlorid hinzu, um eine Endkonzentration von 150 bis 200 Mikromolaren zu erhalten.

Kurz vortexen und 20 Minuten auf Eis halten. Schleudern Sie bei 15.800 GS bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Füllen Sie das SUP-Natant in ein 10-Milliliter-Röhrchen um, ohne das Pellet zu stören.

Halten Sie das Natin kalt und vor Licht geschützt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Ein-Milliliter-Nickel-SROs-Säule vorbereiten, wie im Protokolltext beschrieben. Geben Sie drei bis vier Milliliter OG-Puffer in die Proteinprobe und laden Sie die Probe auf die Säule.

Spülen Sie die Säule mit fünf Millilitern OG-Puffer, gefolgt von zwei Millilitern OG-Spülpuffer. Eluieren Sie das gebundene Protein mit drei Millilitern Elu-Puffer. Sammeln Sie das grüne Ellu, das das rekonstituierte Protein enthält.

Der Saccharosegradient wird, wie im Protokolltext beschrieben, sorgfältig vom oberen Rand des Gradienten entfernt, und zwar mit dem gleichen Volumen wie das der grünen Fraktion, die aus der Spalte der Nickel-SROs angedeutet wird. Laden Sie die rekonstituierte Probe langsam darauf, wobei Sie darauf achten müssen, den Gradienten nicht zu stören. Setzen Sie das Rohr und eine Waage in einen Schwenkrotor S SW 41 oder SW 60 ein und drehen Sie sich in einer Ultrazentrifuge bei 200.000 G bei vier Grad Celsius für 18 Stunden mit langsamer Beschleunigung und Stopp ohne Pausen.

Wenn die Ultrazentrifuge fertig ist, nehmen Sie den Gradienten vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Röhrchenhalter. Das grüne Band ist ein Bruchteil, der gesammelt werden soll. Das Absorptionsspektrum von CP 24.

Ein in vitro rekonstituiertes Chlorophyll-AB-bindendes Protein wird mit dem Spektrum des nativen Komplexes verglichen. Die identischen Spektren deuten auf eine praktisch identische Pigmentzusammensetzung und -organisation hin. Die Qualität des rekonstituierten Komplexes kann auch durch Fluoreszenzspektroskopie beurteilt werden.

Da die Pigmente bei Anregung bei unterschiedlichen Wellenlängen Fluoreszenz emittieren, Chlorophyll A bei 440 Nanometern, Chlorophyll B bei 475 Nanometern und zils bei 500 Nanometern. Die Fluoreszenzemissionsspektren eines rekonstituierten CP 24-Wildtyp-Komplexes und auf das Maximum normiert zeigen einen effizienten Energietransfer von Chlorophyll B und XANTHE-Füllungen zu Chlorophyll A. Das Vorhandensein von Chlorophyll B, das nicht auf das Protein abgestimmt ist, ist an einer zusätzlichen Schulter um 650 Nanometer zu erkennen. Das Vorhandensein von freiem Chlorophyll A führt stattdessen zu einer zusätzlichen Emission um 675 Nanometer.

Die Fluoreszenzemissionsspektren bei 475 Nanometern sowohl des rekonstituierten als auch des nativen CP 24-Komplexes zeigen einen einzelnen Peak bei 681 Nanometern, was darauf hinweist, dass der rekonstituierte Komplex korrekt gefaltet ist. Auch das rekonstituierte CP 24 und der native Komplex zeigen sehr ähnliche zirkuläre Charismaspektren. Einzelne Aminosäurereste, die für die Koordination verschiedener Pigmente wichtig sind, können verändert werden, um die Eigenschaften einzelner Pigmente zu analysieren oder ihren Beitrag zur Funktion und Stabilität des Komplexes zu bewerten.

Hier sind die Absorptionsspektren eines Wildtyps und mutiertem CP 29 dargestellt. Die grüne Linie zeigt die Unterschiede zwischen den beiden Diagrammen. Wenn diese Technik den SUSE-Gradienten einschließt, könnte die Ultrazentrifugation innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.