Name: In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution von Lichtsammelkomplexen aus Spinatblättern und E. coli. Diese Methode ermöglicht die Analyse spektroskopischer Eigenschaften und die Manipulation von Pigment-Protein-Komplexen.

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Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat durch einen ERC Starting/Consolidator Grant für RC und von der Dutch Foundation for research on matter (FOM) über ein FOM-Programm (10TM01) unterstützt.

1. Gesamtpigmentextraktion aus Spinatblättern <ol><li> Homogenisieren eine Handvoll Blattspinat (~ 20 g) in 100 ml kaltem Grinding-Puffer (siehe Tabelle 1) mit einem Mixer für 20 Sekunden. </li><li> Filtern der Lösung durch ein zwei Schichten aus Nylongewebe mit einem Porendurchmesser von 20 um und Zentrifuge das Filtrat bei 1500 g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Das Pellet, das die Chloroplasten mit einem weichen Pinsel Künstler malen in 1 ml kaltem Waschpuffer (siehe Tabelle 1). Sobald das Pellet resuspendiert, mit 50 ml Waschpuffer und Zentrifuge die Lösung bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet vorsichtig (Thylakoide) in 50 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 1). </li><li> Zentrifugieren der Lösung bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C vollständig zu entfernen, den Überstand. An dieser Stelle führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit, um Pigment Oxidation zu vermeiden. </li&gt; <li> Fügen ~ 20 ml 80% Aceton mit Na 2 CO 3 gepuffert (siehe Tabelle 1), um die Pigmente zu extrahieren. Verlassen Sie die Lösung auf Eis für 10 min, gelegentlich Vortexen. </li><li> Pellet die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. HINWEIS: Wenn die Pigmente nicht völlig extrahiert, wird der Pellet eine grüne Farbe haben und Schritt 1.6 sollte wiederholt werden. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit in einen Scheidetrichter. Fügen 0,4 Volumina Diethylether, kräftig schütteln und öffnen Sie das Ventil, um das Gas zu entlüften. </li><li> Fügen 0,8 Volumen von 0,33 M NaCl und kräftig mischen. ~ 10 min ermöglichen die Schichten zu trennen. Die Ether-Phase auf die extrahierten Pigmente enthält. Entfernen Sie die untere Phase. HINWEIS: Wenn die Trennung nicht klar ist, einfrieren und auftauen die Lösung, um die Phasentrennung zu verbessern. </li><li> Entfernen Sie den Äther durch Eingießen von der Oberseite der Scheidetrichter in einen geeigneten Glasbehälter. Trocken, indem Sie einen Löffel grandere wasserfreiem Natriumsulfat. Schwenken Sie die Lösung und lassen ~ 5 min für das Trockenmittel, um Wasser aus dem Äther zu absorbieren. HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Natriumsulfat erscheint völlig verklumpten; Es sollte auch frei schwebend sein, wenn die Kristalle Ether ausreichend getrocknet. Wenn eine Wasserschicht bildet, entfernen Sie diese mit einer Pasteur-Pipette, bevor zusätzliche wasserfreiem Natriumsulfat. </li><li> Dekantieren den Äther zu einem neuen Glas-Container, so dass das Natriumsulfat solide hinter sich. </li><li> Verdampft den Ether im Rotations Speedvac oder unter einem Strom von N 2. </li><li> Man löst die Pigmente vollständig in 10 ml 100% igem Aceton gewaschen. </li><li> Verdünnte eine kleine Menge (~ 3 ul) in 1 ml 80% Aceton und Messen der Absorptionsspektren und bestimmen den Chl a / b-Verhältnis und die Chl-Konzentration mit der durch Porra et al. (1989) 15. </li><li> Aliquoten und trocknen die Pigmente in einem Dreh Speedvac oder unter N 2-Strom, bis das Aceton istvollständig verdampft ist. Bewahren Sie die getrockneten Pigmente bei -80 ° C. </li></ol> 2. Extraktion der Carotinoide aus Spinat <ol><li> Führen Sie die Schritte 1.1 bis 1.5. An dieser Stelle führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit, um Pigment Oxidation zu vermeiden. </li><li> Resuspendieren thylakoid Pellet in ~ 50 ml 96% Ethanol mit Na 2 CO 3 (siehe Tabelle 1) zwischengespeichert, um die Pigmente zu extrahieren. Verlassen Sie die Lösung auf Eis für 5 min. </li><li> Pellet die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. HINWEIS: Wenn die Pigmente nicht völlig extrahiert, wird der Pellet eine grüne Farbe haben und Schritt 2.2 sollte wiederholt werden. </li><li> Sammeln des Überstandes und mit 0,1 Volumen von 80% KOH (w / v) einer Verseifung initiieren. </li><li> Verlassen Sie die Lösung bei 4 ° CO / N, fest verschlossen und vor Licht geschützt. </li><li> Sammeln Sie die Lösung in einen Scheidetrichter. 1 Volumen Diethylether und vorsichtig mischen. </li><li> 0,8 vol hinzufügenmengen von 0,33 M NaCl und vorsichtig mischen. ~ 10 min ermöglichen die Schichten zu trennen. Die orange Ether-Phase auf verseiften enthält die Carotinoide. Entfernen Sie die grüne untere Phase durch Ablassen durch den Hahn des Trichters. </li><li> Hinzufügen 3 Volumen Wasser und vorsichtig mischen, um das Kaliumhydroxid zu entfernen. Lassen Sie die Schichten zu trennen. HINWEIS: Wenn die obere Phase trübe erscheint, fügen Sie eine kleine Menge von NaCl (zB 3 g NaCl in 200 ml Lösung) und vorsichtig schwenken, sich aufzulösen. </li><li> Entfernen Sie die untere Phase durch Ablassen durch den Hahn des Trichters. </li><li> Folgen Sie den Schritten von 1,10 bis 1,13. </li><li> Verdünnte eine kleine Menge (~ 3 ul) in 1 ml 80% Aceton und Messen der Absorptionsspektren bei 440 nm in 80% Aceton. Um die Konzentration zu bestimmen, verwenden Sie die Durchschnittskoeffizient Aussterben der Carotinoide (ε 440 = 255) 16 in der folgenden Formel: Auto [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (Strahlengang) = 1 cm. </li><li> Aliquoten und trocknen Sie die carotenoids in einem Speedvac oder unter N 2-Strom, bis alle Diethylether wurde verdampft. Bewahren Sie die getrockneten Pigmente bei -80 ° C. </li></ol> 3. Gesamt Pigment und Carotinoid-Extraktion aus Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Wachsen C. reinhardtii auf festen TAP Medium 17 in einer Petrischale durch die Verbreitung eine kleine Menge Flüssigkultur auf die Oberfläche. Wachsen unter ständiger Beleuchtung Strom von 20 mmol Fotos PSA m -2 s -1 bis eine grüne Schicht von Zellen sichtbar ist. </li><li> Verwendung einer sterilen Impföse ernten eine kleine Menge von C reinhardtii vom festen TAP Medium und setzen Sie die Zellen in 500 ml Leitungsmedium 17 in einem 1 l-Kolben. Die Kultur bei 25 ° C mit 170 Upm unter Rühren unter kontinuierlicher Beleuchtung Fluß von 20 umol Fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Nach 5-6 Tagen ist die Kultur am Ende der logarithmischen Phase erreicht (6 x 10 6 Zellen / mloder 2-2,5 optische Dichte bei 750 nm). Zentrifugieren der Kultur bei 4000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> Für Gesamtpigment-Extraktion, befolgen Sie die Schritte 1,6 bis 1,15. </li><li> Die Ausbeute an Gesamtpigmentextrakt ab 500 ml Vollwachstumskultur von C. reinhardtii ist etwa 5 ml Lösung mit einer Konzentration von 0,5 mg Chl a + b / ml. </li><li> Carotinoide für Extraktion, befolgen Sie die Schritte 2,2 bis 2,12. </li></ol> 4. Reinigung von Inclusion Bodies <ol><li> Klonierung der kodierenden Sequenz des LHC Protein von Interesse in einen Expressionsvektor, der in einem kondensierten C-terminalen His-Tag unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren ergibt. Verwandeln, die dieses Konstrukt in E. coli-Wirtsstamm wie BL21 (DE3). </li><li> Vorbereitung Lysepuffer, Wasch-Puffer, Triton-Puffer TE (Tabelle 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und LB-Medium 18 mit den entsprechenden Antibiotika. </li><li> Wählen Sie eine einzE E. coli-Kolonie, enthaltend den Expressions Klon aus einer frisch ausgestrichenen Platte in ~ 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika unter Verwendung von Standardverfahren 6. Wachsen bei 37 ° C mit 220 Upm Rühren für mindestens 16 Stunden. </li><li> Hinzufügen von 2,5 ml des O / N-Kultur in einen 1 l-Erlenmeyerkolben mit 250 ml LB mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. </li><li> Wachsen die Zellen für 2-3 Stunden (oder bis die OD 600 ~ 0,6) bei 37 ° C bei 220 UpM. </li><li> Hinzufügen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C mit 220 Upm 3-4 h wachsen. </li><li> Zentrifugieren der Kultur für 10 min bei 5.000 × g bei 4 ° C in einem vorgewogenen Zentrifugenglas. Überstand verwerfen und gründlich Bestimmen Sie das Gewicht des Pellets durch Wiegen wieder und Subtraktion der Zentrifugenröhrchen Gewicht. </li><li> Resuspendieren E. coli-Zellpellet in 0,8 ml / g Lysepuffer durch kräftiges Vortexen. HINWEIS: Alternativ kann das Zellpellet bei -80 eingefrorenC für die spätere Verwendung. Wenn die mit einem gefrorenen Pellets, lassen Sie sie vollständig vor der Zugabe des Lyse-Puffer auftauen. </li><li> Add 2 mg Lysozym pro Gramm Zellen und Inkubation auf nassem Eis mit gelegentlichem Vortexen für 30 min. </li><li> Mit 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 ug / ml RNAse. Wirbel und auf Eis für 30 Minuten setzen. </li><li> 2 ml kaltem Detergenspuffer pro Gramm Zellen. Gut mischen und halten RT für 5 min. </li><li> Übertragung auf 2 ml Zentrifugenröhrchen (aufgeteilt in zwei Röhren, wenn nötig). Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> 1 ml kaltem Triton-Puffer und die Pellets durch Sonifikation (3 x 5 sec Impulse x 50% Leistung mit 20 Sekunden-Intervallen) vollständig zu suspendieren. HINWEIS: Haben Sie den Schlauch in einem kleinen Becherglas mit Eis Wasser umgeben, um sie während der Sonifikation kalt zu halten. Im Falle von Mehrfachrohren, verbinden die resuspendiert Einschlußkörper in eine Röhre nach Resuspendierung. </li><li> Zentrifugieren für 10 min bei 12.000× g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.13 und 4.14 zwei Mal. </li><li> Resuspendieren der Einschlusskörper in 1 ml kaltem TE mit Sonifikation für einen letzten Wasch die Triton-Puffer zu entfernen. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> Das Pellet in 1 ml kaltem TE durch Beschallung. </li><li> Beurteilung der Proteinkonzentration durch Standardverfahren, wie dem Bradford-Assay 19. Speicher Aliquots der Einschlusskörper bei -20 ° C. </li></ol> 5. Rekonstitution Dieses Protokoll liefert typischerweise 1-2 ml der rekonstituierten Protein mit einem Außendurchmesser von 4, wenn die Absorption in der Region Qy (600-750 nm) gemessen. Menge kann nach Wunsch eingestellt werden, wobei darauf zu achten ist, um die richtigen Verhältnisse während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: 2x Rekonstitutionspuffer, 20% OG, 2 M KCl, TE. Führen Sie das folgende sTEPs bei schwachem Licht. </li><li> Resuspendieren 800 ug LHC Inclusion Bodies in insgesamt 400 ul TE in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 400 ul der 2x Rekonstitutionspuffer und kurz vortexen. </li><li> Fügen 0,6 ul β-Mercaptoethanol (14,8 M stock), um eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten. Wärme, die das Protein für 1 min bei 98 ° C aufweist. Wirbel kurz und Ort bei RT für 3 min. </li><li> Resuspendieren 500 g Gesamt-Chlorophyll-Pigmente getrocknet plus 80 ug Carotinoidpigmente in 30 ul 100% EtOH durch kräftiges Vortexen für 1 min oder in einem Ultraschallbad für 1-2 min. </li><li> Drehen Sie das Pigment-Mix ~ 30 sec bei 15.800 xg bei 4 ° C und bestätigen, dass es keine Pellets. Wenn es ein Pellet, wiederholen Verwirbelung und / oder Ultraschallbehandlung. WICHTIG: Nach der Aufwirbelung und Spin, sofort Pigment in den das Protein, oder es kann zu aggregieren und müssen wieder suspendiert werden. </li><li> Langsam das Pigment-Mix zu dem gekühlten Protein unter Vortexen. Weiterhin Wirbel 5-10 sec und das Röhrchen auf nassem Eis. Seien Sie vorsichtig, nicht zu kräftig vortexen, wie das Protein die Spitze des Rohres überlaufen. </li><li> Fügen Sie 94 ul 20% Octyl β-D-glucopyranosid (OG) (Endkonzentration 2%), kurz vortexen und auf Eis 10 min halten. </li><li> Fügen Sie 90 ul von KCl 2 M (Endkonzentration 150-200 mM), kurz vortexen und auf Eis 20 min halten. HINWEIS: Säulenvorbereitung (Abschnitt 6) kann zu diesem Zeitpunkt eingeleitet werden. </li><li> Spin für 10 min bei 15.800 × g bei 4 ° C ist. Überstand entfernen, ohne das Pellet (gefälltes LDS) in einen 10-ml-Röhrchen stören. Halten Kälte und vor Licht geschützt. </li></ol> 6. Nickel Säulenreinigung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: OG-Puffer, OG Spülpuffer, Elution Puffer. </li><li> Verbinden einer Ni-Sepharose-Säule (1 ml) oder äquivalent zu einer Schlauchpumpe gewährleistet, dass keine Luft in der Säule wird bei diesem Schritt und die nachfolgenden Schritte. </li><li> Stellen Sie die Geschwindigkeit von ter zu pumpen, um 1 ml / min und spülen Sie die Säule mit 5-10 ml Wasser, um die Storage-Lösung zu entfernen. </li><li> Ins Gleichgewicht der Säule mit 3-4 ml OG-Puffer. </li><li> Zusatz von 3-4 ml OG-Puffer zu der Proteinprobe und der Last auf die Säule. Hinweis: Wenn das Protein wurde auf Eis nach der Entfernung des LDS sitzen länger als 10 min, wieder drehen sich mit 15.800 g bei 4 ° C für 1 min, um zusätzliche LDS Niederschlag zu entfernen. </li><li> Spülen der Säule mit 5 ml OG-Puffer. </li><li> Mit 2 ml OG Spülpuffer Spülen der Säule. </li><li> Elution des gebundenen Proteins mit 3 ml Elutionspuffer. Sammeln Sie die grüne Eluat, das die wiederhergestellten Protein enthält. Hinweis: Dies ist in der Regel etwa 1 ml insgesamt. </li></ol> 7. Saccharosegradientenzentrifugation <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: Saccharose-Lösung, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6. </li><li> Füllen Ultrazentrifuge Rohre mit der Saccharose-Lösung und bei -20 ° CO / N or -80 ° C für mindestens 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch aus dem Gefrierschrank und lassen Sie bei 4 ° C auftauen ungestört. HINWEIS: Die Frost / Tau-Verfahren erzeugt einen Gradienten von 0,1 bis 1 M Saccharose. Eine 15-ml-Tube taut in der Regel in etwa 3 Stunden. </li><li> Sorgfältig von oben zu entfernen das gleiche Volumen wie die grüne Fraktion aus der Nickel-Sepharose-Säule in Schritt 6.8 eluiert. Dann laden Sie die rekonstituierte Probe langsam auf, um zu vermeiden das Gefälle zu stören. </li><li> Balance Rohren und Spin bei 200.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge mit einem SW-41 oder SW-60 Ausschwingrotor für 18 Stunden, eingestellt, um die Beschleunigung und Stoppen ohne Bremsen verlangsamen. </li><li> Sie vorsichtig die Gradienten von der Rohrhalter mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine Spritze mit langer Nadel, die eine stumpfe Öffnung, um den Anteil von der Spitze zu sammeln hat. HINWEIS: Alternativ sammeln Fraktionen von unten durch Anstechen des Röhrchens mit einer Nadel und Sammeln Tropfen. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht

Membranproteine ​​sind nicht so leicht zu untersuchen. Isolierung von nativen Membranproteine ​​wird durch die Notwendigkeit, die Lipid-Doppelschicht mit Detergenzien solubilisieren, die das Protein beschädigen und zu entfernen wesentlichen Kofaktoren kompliziert. Diese Proteine ​​können auch in geringen Mengen vorhanden sein, die in biologischen Membranen oder mit eng verwandten Proteinen gemischt werden, wie im Fall der Lichtsammelkomplexe, die die Reinigung der einzelnen Komplexe erschwert. Heterologe Proteinexpression in E. coli und in vitro Rekonstitution bietet die Möglichkeit, diese Probleme zu vermeiden. In vitro Rekonstitution und Reinigung von gefalteten Proteinen führt zu Komplexen, die Eigenschaften sehr ähnlich denen des nativen Komplexe 20,21,23 und besitzen somit verwendet werden, um Komplexe, die nicht bis zur Homogenität gereinigt werden können, 24 zu untersuchen - 27. Dieses Verfahren verwendet Spinat, die leicht ist attainable ganze Jahr über, als Quelle für den Gesamtpigment und Carotinoid-Zubereitungen. Für einige Rekonstruktionen von Proteinen stammt aus Algen ist die Verwendung von Pigmenten aus Algen gereinigt aufgrund unterschiedlicher Pigmentzusammensetzungen bevorzugt. Das Chl a / b-Verhältnis und Chl / Auto Verhältnis gleich bleibt, unabhängig von Pigmentquelle. Es ist wichtig zu erkennen, dass der Wirkungsgrad der Rekonstitution ist in der Regel rund 35% 28. Somit ist es erforderlich, die nicht-gebundene Pigmente und das entfaltete Apoprotein aus der Lösung nach dem Auflösen zu entfernen. Ein Zwei-Schritt-Reinigungsprotokoll wird in diesem Protokoll vorgestellt (siehe Ergebnisse). Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Saccharose-Gradienten Schritt nicht die vollständige Trennung der Apo-und Holo-Protein zu ermöglichen. Bei den meisten Analysen ist dies kein Problem, da das Apoprotein keine Pigmente enthalten und somit nicht mit den funktionellen Messungen stören. In dem Fall ist es jedoch notwendig, die Apoprotein vollständig entfernen aus der FRAktion mit dem rekonstituierten Komplexes (zum Beispiel, um das Pigment zu Protein-Stöchiometrie berechnen), kann eine anionische Austauschsäule verwendet werden (siehe Passarini et al. 2009 29 für Details). Die Fähigkeit zur rekombinanten Lichtsammelproteine ​​mit isolierten Pigmente in vitro Rückfaltung bietet die Möglichkeit, &quot;manipulieren&quot; die Komplexe durch Änderung der Rekonstitution &quot;Umwelt&quot; in verschiedener Weise, wodurch sich die Eigenschaften des resultierenden Komplexes. Zum Beispiel kann die Änderung der Pigmentzusammensetzung bei der Rekonstitution in einem Komplex mit veränderten Pigmentzusammensetzung führen. Diese Funktion kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Pigmente auf der Struktur und Stabilität des Komplexes zu untersuchen. Regel die Pigmentzubereitung aus Spinat erhalten wird, eine Chl a / b-Verhältnis von 3: 1 und einen Chl / Auto-Verhältnis von 2,9: 1 liegt. Dieses Verhältnis typischerweise eine rekonstituierte Protein mit den gleichen Eigenschaften wie der nAtive einem. 33 - jedoch kann die Einstellung der Chl a / b-Verhältnis durch Zugabe von gereinigtem Chl a oder b die Bindung von verschiedenen Pigmenten aufgrund der unterschiedlichen Selektivität der Bindungsstellen 30 zu beeinflussen. Dies ist möglich, weil die meisten der Pigmentbindungsstellen sind nicht vollständig selektiv für Chl a und Chl b, kann aber auch unterzubringen, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität 10,30,34. In ähnlicher Weise wurden die Carotinoid-Bindungsstellen auch gezeigt in der Lage, mehr als eine Art Xanthophyll 8,35 aufzunehmen - 38. Verschiedene Rekonstruktionen von CP26, ein anderes Pigment-Protein-Komplex höherer Pflanzen mit verschiedenen Pigmentzusammensetzungen werden in Tabelle 2 gezeigt, 39. Diese Rekonstruktionen wurden verwendet, um die Affinität der Bindungsstellen für bestimmte Pigmente 39 zu beurteilen. Es ist interessant zu bemerken, dass, um einen Komplex mit dem gleichen Pigment c erhalten1: usammensetzung wie das native einen muss der Chl a / b-Verhältnis von Pigmentmischung 3 sein. Dies scheint der Fall für alle LHC-Komplexe der höheren Pflanzen 20,40 sein. Die Kombination der Molekularbiologie mit der Rekonstitution Technik können die Eigenschaften eines Chl-bindenden Komplexes näher zu untersuchen. 44 - die Bedeutung der verschiedenen Proteindomänen auf die Stabilität und Faltung der Komplexe oder deren Einbindung in die Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden durch Abschneiden des Apoprotein oder Führen Zufallsmutagenese 8,41 bestimmt. 52 - einzelne Aminosäurereste die für die Koordinierung der verschiedenen Pigmente können durch ortsgerichtete Mutagenese, um die Eigenschaften der einzelnen Pigmente zu analysieren oder zu beurteilen, deren Beitrag zu der Funktion und Stabilität des Komplexes 10,28,29,45 verändert werden. Figur 6 zeigt rekonstituiert Lhcb4 (CP29) miteine Mutation von Histidin an Position 216, 53. Ein Vergleich der Pigmentzusammensetzung von Wildtyp-und Mutanten-Komplexen zeigt, dass die Mutation induziert den Verlust eines Chl ein Molekül, das anzeigt, dass die Zielstelle nimmt eine Chl a im WT-Komplex. Die Unterschiede der Absorptionsspektren von WT und Mutanten, bei Normierung auf den Pigmentgehalt, zeigt auch die Absorptionseigenschaften des verlorenen Pigment. In diesem Fall kann der Unterschied in der Hauptpeak bei 680 nm zu erkennen, was darauf hinweist, dass der Chl a von His216 koordiniert bei dieser Wellenlänge absorbiert (für weitere Details zu diesem Mutante und die spektroskopischen Eigenschaften sehen Mozzo et al., 2008 53). Mutationsanalyse kann auch verwendet werden, um die Wirkung der Umgebung auf die spektroskopischen Eigenschaften der Pigmente 54 zu bestimmen. Abschließend kann Lichtsammelproteine ​​leicht in vitro rekonstituiert werden, was zu Pigment-protein-Komplexe mit sehr ähnlichen Eigenschaften wie Mutterkomplexen. Auf diese Weise werden die Schwierigkeiten bei der Isolierung von nativen Proteinen eliminiert, während auch die Bereitstellung Proteinpräparat mit hoher Ausbeute und Reinheit zur weiteren Untersuchung. Die Bedeutung einer 3: 1 Chl a / b-Verhältnis bei der Herstellung eines authentischen Komplex wird hervorgehoben, und Beispiele von rekonstituierten Wildtyp und Mutante LHCs sind vorgesehen, um Anwendungen der Technik veranschaulichen.

Die Photosyntheseapparat von Pflanzen und Algen umfassen integrale Membranproteine, binden Chlorophyll (Chl a), b (Chl b) und Carotinoide (Auto). Diese Pigment-Protein-Komplexe sind in der Erntelichtenergie und übertragen diese Anregungsenergie zu den Reaktionszentren, in denen es verwendet wird, um die Ladungstrennung 2 fördern aktiv. Sie sind auch in regulatorischen Rückkopplungsmechanismen, die den Photosyntheseapparat von hoher Lichtschäden schützen 3,4 beteiligt. Die Lichtsammelkomplexe (LHCs) aus einer großen Familie von verwandten Proteinen in Pflanzen und Algen 5 besteht. Die homogene Reinigung jedes Mitglied der Familie von den hoch ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der Komplexe erschwert. Darüber hinaus führen Reinigungsverfahren oft zu einem Verlust der Pigmente oder andere potenzielle Kofaktoren wie Lipide. In-vitro-Rekonstitution Vertrets eine leistungsfähige Methode, um diese Probleme zu überwinden. Der LHC mit Photosystem II (LHC-II) zugeordnet wurde in vitro durch Plumley und Schmidt 1987 1 rekonstituiert. Die Forscher extrahiert entfetteten Protein und Pigmente getrennt von Chloroplasten, und dann kombiniert, die Hitze denaturierten Proteins mit Pigmenten in Gegenwart von Lithium Natriumdodecylsulfat (LDS), gefolgt von drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen 1. Sie zeigten, dass die spektralen Eigenschaften des rekonstituierten LHC-Komplexe sehr ähnlich waren, um Komplexe aus Pflanzen gereinigt. Die Leichtigkeit der Rekonstitution LHC Pigment-Protein-Komplexe, wahrscheinlich aufgrund eines inhärenten Selbstorganisation kennzeichnen, zusammen mit der Schwierigkeit bei der Isolierung von gereinigten Komplexe aus Organismen, führte zur schnellen Einführung des Verfahrens von anderen Forschern. Die Rekonstitution der photo Proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) überexprimiert wurde von Paulsen et al 1990 6 erreicht. In E.coli, überexprimiert Membranproteine ​​sind in der Regel in Einschlusskörpern enthalten sind, die Einrichtungen ihre Reinigung. Rekonstitution durch Hitzedenaturierung der Einschlusskörper, die rekombinantes Protein in Gegenwart von LDS, gefolgt von der Zugabe von Pigmenten, die die Proteinfaltung initiiert erreicht. Faltung des LHCII-Komplex ist ein zweistufiges Verfahren: Zunächst wird Chlorophyll a in weniger als 1 min gebunden; zweite, Chlorophyll b gebunden und über mehrere Minuten 7 stabilisiert. Zusätzlich zur Bereitstellung Einblick in die Faltungsdynamik in vitro Rekonstitution in Verbindung mit ortsgerichteter Mutagenese wurde die Identifizierung von spezifischen Aminosäuren wichtig für die Stabilität (zB 8,9) oder Pigmenten Abstimmung erlaubt (zB 10). Manipulation der Rückfaltungsbedingungen durch Anpassung der Parameter wie Pigmentzusammensetzung oder Reinigungsmittel haben auch Elemente Critica identifiziertl für die richtige Faltung, wie die Forderung der Xanthophylle für die LHCII-Komplex (zB 1,11). Zusätzlich Untersuchung der Eigenschaften des in den Komplexen gebundenen einzelnen Pigmente ist möglich unter Verwendung von Komplexen in vivo rekonstituiert (zB 10). Das hier beschriebene Verfahren beginnt mit der Isolierung der Pigmente (Chlorophylle und Carotinoid) aus Spinat und der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Die Expression und Reinigung eines LHC-Protein aus E. coli in Form von Einschlusskörpern wird dann beschrieben, gefolgt von der Wiederherstellung des LHC und anschließender Reinigung durch Ni-Affinitätssäule. Im letzten Schritt werden die rekonstituierten Komplexen durch Saccharose-Gradienten-Zentrifugation gereinigt, um freien Pigmente und ungefalteten Apoprotein entfernen. Dieses Protokoll stellt eine optimierte Verfahren, das mehrere Änderungen, die von verschiedenen Labors über eingeführt wurdenZeit 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Nylontuch</td><td></td><td></td><td>20 &mu; m poren</td></tr><tr><td>Soft Artists Pinsel&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &beta;- D-Glucopyranosid</td><td>Sigma</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>siehe Referenz 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>siehe Referenz 19</td></tr></tbody></table>

in-vitro-rekonstitution der lichtsammelkomplexe der pflanzen und grünalgen

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Pflanzen und Grünalgen, wird von den Lichtsammelkomplexe (LHCs), eine Familie von integralen Membranproteinen, die Chlorophylle und Carotinoide koordinieren gefangen genommen. In vivo werden diese Proteine ​​mit Pigmenten gefaltet, um Komplexe, die in der Thylakoidmembran eingefügt sind, bilden des Chloroplasten. Die hohe Ähnlichkeit in der chemischen und physikalischen Eigenschaften der Mitglieder der Familie, zusammen mit der Tatsache, dass sie leicht Pigmente während der Isolierung zu verlieren, macht die Reinigung in einem nativen Zustand schwierig. Ein alternativer Ansatz zur homogenen Zubereitungen von LHCs erhalten wurde durch Plumley und Schmidt 1987 1 entwickelt, die zeigten, dass es möglich war, diese Komplexe in vitro ausgehend von gereinigten Pigmente und ungefalteten Apoproteine ​​wiederherzustellen, was zu Komplexen mit Eigenschaften sehr ähnlich zu der von nativem Komplexe. Dies eröffnet den Weg zur Verwendung von bakteriell exprimierten rekombinanten Proteinen in vitro </em&gt; Rekonstitution. Die Rekonstitution Verfahren ist leistungsfähig aus verschiedenen Gründen: (1) reine Präparate von Einzelkomplexe erhalten werden kann, (2) Pigmentzusammensetzung gesteuert werden, um ihren Beitrag zu bewerten Aufbau und Funktion werden, (3) rekombinante Proteine ​​mutierte die Funktions zu studieren Rolle der einzelnen Reste (beispielsweise Pigment-Bindungsstellen) oder Proteindomäne (zB Protein-Protein-Wechselwirkung, Falten). Dieses Verfahren wurde in verschiedenen Laboratorien optimiert und die meisten der Lichtsammelkomplexe angewendet. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren zur Wiederlichtsammelkomplexe in vitro noch in unserem Labor verwendet wird, und Beispiele beschreiben Anwendungen des Verfahrens sind vorgesehen.

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Lichtsammelkomplexen in vitro. Diese integralen Membranproteine koordinieren Chlorophylle und Carotinoide und sind für die Lichternte in höheren Pflanzen und Grünalgen verantwortlich.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Rekonstitution von in vitro lichterntenden Pigmentproteinkomplexen von Pflanzen oder Algen. Dies wird durch die Extraktion der Pigmente aus Spinatblättern oder Algenkulturen und die Überexpression des APA-Protes in E. coli erreicht. In einem zweiten Schritt wird das APA-Prote mit den Pigmenten vermischt, um einen rekonstituierten Komplex zu erhalten.Als nächstes wird der rekonstituierte Pigmentproteinkomplex von den überschüssigen Pigmenten gereinigt und die entfalteten Proteinergebnisse erhalten, die ähnliche spektroskopische Eigenschaften des rekonstituierten Pigmentproteinkomplexes und des nativen Komplexes auf der Grundlage von Absorptionsspektren, Fluoreszenzspektren und zirkulärem Deismus aufweisen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es uns ermöglicht, eine relativ hohe Menge an Pigmentproteinkomplexen zu erhalten und die Komplexe auch mit Hilfe von mutierten Protein- und Pigmentmischungen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen zu manipulieren. Das Verfahren wird Alberto na, ein Doktorand im Labor, um das Verfahren zur Extraktion des Gesamtpigments aus Spinatblättern zu beginnen. Verwenden Sie einen Mixer, um eine Handvoll Spinat zu homogenisieren, lassen Sie etwa 20 Gramm in 100 Millilitern Kaltmahlpuffer für 20 Sekunden übrig.Filtrieren Sie die Lösung durch zwei Schichten Nylongewebe mit einem schlechten Durchmesser von 20 Mikrometern und zentrifugieren Sie das Filtrat 10 Minuten lang bei 1.500 g. Bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Kaltwaschpuffer hinzu.Suspendieren Sie das Pellet mit den Chloroplasten mit einem weichen Künstlerpinsel. Sobald das Pellet resuspendiert ist, fügen Sie 50 Milliliter Waschmittel, Puffer und Zentrifuge hinzu, eine Lösung mit 10.000 g für 10 Minuten. Entfernen Sie bei vier Grad Celsius den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 50 Millilitern Waschpufferzentrifuge, einer Lösung bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie den Überstand ab diesem Zeitpunkt vollständig.Dieser Vorgang muss im Dunkeln durchgeführt werden. Um eine Pigmentoxidation zu vermeiden, fügen Sie etwa 20 Milliliter 80%iges Aceton hinzu, das mit Natriumcarbonat gepuffert ist, um die Pigmente zu extrahieren, und lassen Sie die Lösung 10 Minuten lang auf Eis. Gelegentlich werden die zellulären Bestandteile durch Vortexen durch Zentrifugation bei 12.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius paletten.Die vollständige Pigmentextraktion sollte zu einem weißen Pellet führen. Sammle die Schlinge in einem Scheidetrichter. Fügen Sie 0,4 Volumen Dathylether hinzu.Schütteln Sie kräftig und achten Sie darauf, die Ventile zu öffnen, um das Gas abzulassen. 0,8 Volumen molares Natriumchlorid (Punkt 33) zugeben und kräftig mischen. Warten Sie ca. 10 Minuten, bis sich die Schichten getrennt haben.Die Etherphase auf der Oberseite enthält die extrahierten Pigmente. Entfernen und entsorgen Sie die klare untere Phase. Entfernen Sie den Äther, indem Sie ihn von der Oberseite des Scheidetrichters in einen geeigneten Glasbehälter gießen.Trocknen Sie den Äther, indem Sie einen Löffel körniges wasserfreies Natriumsulfat hinzufügen. Schwenken Sie die Lösung und lassen Sie das Trockenmittel etwa fünf Minuten lang Wasser aus dem Äther aufnehmen. Wenn der Äther ausreichend getrocknet ist.Es sollten einige frei schwebende Kristalle vorhanden sein und das Natriumsulfat sollte nicht verklumpen. Dekantieren Sie den Äther in einen neuen Glasbehälter, lassen Sie den Natriumsulfatfest hinter sich, aliquotieren Sie die Pigmente und trocknen Sie sie in einem Vakuum mit Drehzahl, bis das Aceton vollständig verdampft ist. Lagern Sie die getrockneten Pigmente bei minus 80 Grad Celsius.Die Extraktion von Keratinoid aus Spinat ist in diesem Video nicht zu sehen, aber die getrockneten Pigmente werden ebenfalls bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Der Light Harvesting Complex oder LHC für die Rekonstitution wurde in Form von Einschlusskörpern exprimiert und von E. coli gereinigt. Für den Erfolg der Rekonstitution ist das Verhältnis zwischen Pigmentproteinen und der Menge des Puffereinsatzes entscheidend.Dieser Vorgang sollte bei schwachem Licht durchgeführt werden. Resuspendieren Sie 800 Mikrogramm LHC-Einschlusskörper in insgesamt 400 Mikrolitern te. In ein Zwei-Milliliter-Fuge-Röhrchen werden 400 Mikroliter mit zwei x Rekonstitution, Puffer und Vortex gegeben.Geben Sie kurz 0,6 Mikroliter einer 14,8 molaren Beta-Mar-CAPTA-Ethanolbrühe hinzu. Um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erhalten, erhitzen Sie das Protein eine Minute lang auf 98 Grad Celsius. Kurz einreiben und drei Minuten bei Raumtemperatur aufstellen.Resuspendieren Sie insgesamt 500 Mikrogramm getrockneter Chlorophyllpigmente plus 80 Mikrogramm Keratinoidpigmente in 30 Mikrolitern 100%igem Ethanol durch kräftiges Vortexen. Eine Minute lang. Schleudern Sie die Pigmentmischung bei 15.800 g bei vier Grad Celsius für etwa 30 Sekunden und bestätigen Sie, dass unmittelbar nach dem Schleudern kein Pellet vorhanden ist. Geben Sie die Pigmentmischung langsam zum abgekühlten Protein, während Sie wirbeln.Achte darauf, dass du nicht zu stark wirbelst, da das Protein den oberen Teil des Röhrchens überlaufen kann. Fahren Sie mit dem Vortexen für fünf bis 10 Sekunden fort und legen Sie dann das Rohr auf nasses Eis. Fügen Sie 94 Mikroliter 20%Oktal, Beta-D-Glukozid oder og hinzu, um eine Endkonzentration von 2%Vortex kurz zu erhalten und 10 Minuten auf Eis zu halten, fügen Sie 90 Mikroliter zweimolares Kaliumchlorid hinzu, um eine Endkonzentration von 150 bis 200 Mikromolaren zu erhalten.Kurz vortexen und 20 Minuten auf Eis halten. Schleudern Sie bei 15.800 GS bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Füllen Sie das SUP-Natant in ein 10-Milliliter-Röhrchen um, ohne das Pellet zu stören.Halten Sie das Natin kalt und vor Licht geschützt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Ein-Milliliter-Nickel-SROs-Säule vorbereiten, wie im Protokolltext beschrieben. Geben Sie drei bis vier Milliliter OG-Puffer in die Proteinprobe und laden Sie die Probe auf die Säule.Spülen Sie die Säule mit fünf Millilitern OG-Puffer, gefolgt von zwei Millilitern OG-Spülpuffer. Eluieren Sie das gebundene Protein mit drei Millilitern Elu-Puffer. Sammeln Sie das grüne Ellu, das das rekonstituierte Protein enthält.Der Saccharosegradient wird, wie im Protokolltext beschrieben, sorgfältig vom oberen Rand des Gradienten entfernt, und zwar mit dem gleichen Volumen wie das der grünen Fraktion, die aus der Spalte der Nickel-SROs angedeutet wird. Laden Sie die rekonstituierte Probe langsam darauf, wobei Sie darauf achten müssen, den Gradienten nicht zu stören. Setzen Sie das Rohr und eine Waage in einen Schwenkrotor S SW 41 oder SW 60 ein und drehen Sie sich in einer Ultrazentrifuge bei 200.000 G bei vier Grad Celsius für 18 Stunden mit langsamer Beschleunigung und Stopp ohne Pausen.Wenn die Ultrazentrifuge fertig ist, nehmen Sie den Gradienten vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Röhrchenhalter. Das grüne Band ist ein Bruchteil, der gesammelt werden soll. Das Absorptionsspektrum von CP 24.Ein in vitro rekonstituiertes Chlorophyll-AB-bindendes Protein wird mit dem Spektrum des nativen Komplexes verglichen. Die identischen Spektren deuten auf eine praktisch identische Pigmentzusammensetzung und -organisation hin. Die Qualität des rekonstituierten Komplexes kann auch durch Fluoreszenzspektroskopie beurteilt werden.Da die Pigmente bei Anregung bei unterschiedlichen Wellenlängen Fluoreszenz emittieren, Chlorophyll A bei 440 Nanometern, Chlorophyll B bei 475 Nanometern und zils bei 500 Nanometern. Die Fluoreszenzemissionsspektren eines rekonstituierten CP 24-Wildtyp-Komplexes und auf das Maximum normiert zeigen einen effizienten Energietransfer von Chlorophyll B und XANTHE-Füllungen zu Chlorophyll A. Das Vorhandensein von Chlorophyll B, das nicht auf das Protein abgestimmt ist, ist an einer zusätzlichen Schulter um 650 Nanometer zu erkennen. Das Vorhandensein von freiem Chlorophyll A führt stattdessen zu einer zusätzlichen Emission um 675 Nanometer.Die Fluoreszenzemissionsspektren bei 475 Nanometern sowohl des rekonstituierten als auch des nativen CP 24-Komplexes zeigen einen einzelnen Peak bei 681 Nanometern, was darauf hinweist, dass der rekonstituierte Komplex korrekt gefaltet ist. Auch das rekonstituierte CP 24 und der native Komplex zeigen sehr ähnliche zirkuläre Charismaspektren. Einzelne Aminosäurereste, die für die Koordination verschiedener Pigmente wichtig sind, können verändert werden, um die Eigenschaften einzelner Pigmente zu analysieren oder ihren Beitrag zur Funktion und Stabilität des Komplexes zu bewerten.Hier sind die Absorptionsspektren eines Wildtyps und mutiertem CP 29 dargestellt. Die grüne Linie zeigt die Unterschiede zwischen den beiden Diagrammen. Wenn diese Technik den SUSE-Gradienten einschließt, könnte die Ultrazentrifugation innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

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