Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente In-vitro- Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine nicht-zelluläre HLA-IG-basierte Killer-Zelle mit künstlichem Antigen oder K-A-A-P-C für die Depletion autoreaktiver oder unerwünschter T-Zell-Populationen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst HLA-IG-Moleküle und monoklonale Antifa-Antikörper kovalent an zellgroße Eisen-Dextran-Partikel gebunden werden, um das funktionelle K-A-A-P-C zu erzeugen. Im zweiten Schritt werden die K-A-A-P-C durch Durchflusszytometrie charakterisiert, um ihre ordnungsgemäße Funktionalität sicherzustellen. Als nächstes werden die K-A-A-P-C mit verschiedenen Peptiden von Interesse beladen, um die unerwünschte antigenspezifische T-Zellpopulation anzugreifen.

Letztendlich kann eine zytrische Flow-Analyse durchgeführt werden, um die antigenspezifische Anti-Fett-vermittelte Abtötung der T-Zellen durch die beladenen verwandten Zellen zu messen. K-A-A-P-C. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir bei der Entwicklung einer zellbasierten Killerantigen-präsentierenden Zelle auf Probleme stießen, während wir gleichzeitig an der Entwicklung einer Beat-basierten Plattform arbeiten. Technologie zur Modulation von Immunzellen Um K-A-A-P-C zu erzeugen, geben Sie zunächst 250 Mikroliter Epoxidkügelchen aus einem Vorrat und 250 Mikroliter frisch zubereiteten Boratpuffer in ein steriles Glasfläschchen mit Schraubverschluss.

Stellen Sie das Fläschchen auf einen Magneten, damit die Kügelchen nach zwei Minuten haften können, saugen Sie den Puffer an und entfernen Sie das Fläschchen vom Magneten. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit einem weiteren Milliliter Achterpuffer und resuspendieren Sie sie dann in 550 Mikrolitern HLA A zwei IG und Anti-Human-CD 95 MAB. Schütteln Sie das Fläschchen vorsichtig, um die Kügelchen mit den Antikörpern zu vermischen, und inkubieren Sie die Kügelchen dann auf einem Rotator Ende über Ende bei vier Grad Celsius für 24 Stunden.

Drehen Sie die Kügelchen am nächsten Tag zwei Minuten lang bei 300 g und Raumtemperatur herunter und setzen Sie das Fläschchen wieder auf den Magneten. Nach zwei Minuten wird der Ladepuffer abgesaugt. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Magneten und waschen Sie die Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer unter vorsichtigem Schütteln.

Drehen Sie das Fläschchen nach dem dritten Waschgang in einem Milliliter frischem Bead-Wash-Puffer, um alle verbleibenden Proteinbindungsstellen zu blockieren. Am nächsten Tag drehen Sie die Kügelchen wieder herunter und setzen Sie das Fläschchen wieder auf den Magneten. Nach zwei Minuten den Waschpuffer absaugen.

Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Magneten und geben Sie einen Milliliter PBS in den KAPC. Um die Qualität der Kügelchen zu überprüfen, 1,5 mal 10 bis zum Fünftel des K-A-A-P-C in ein Faxrohr geben und mit einem Milliliter Fax-Waschpuffer Resus waschen. Suspendieren Sie das Bead-Pellet in 100 Mikrolitern des Waschpuffers und fügen Sie einen Mikroliter Anti-Maus-IgG, ein PE zum Nachweis des HLA A, zwei IG und einen Mikroliter Anti-Maus-IG MFI TC zum Nachweis des Anti-Human-CD 95 MAB hinzu.

Nach einer 15-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius waschen Sie die Kügelchen in einem Milliliter Fax-Waschpuffer Resus. Suspendieren Sie sie in 250 Mikrolitern Waschpuffer und lesen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer zur Peptidbeladung ab. Zweimal 10 auf die Siebte des K-A-A-P-C in ein neues steriles Glasfläschchen umfüllen.

Nachdem Sie die Kügelchen zwei Minuten lang auf den Magneten gelegt haben, aspirieren Sie das PBS und resuspendieren Sie die Kügelchen in 500 Mikrolitern frischem PBS, das fünf Mikrogramm Peptid enthält. Beschriften Sie das Fläschchen mit dem Datum und dem Namen des beladenen Peptids, K-A-A-P-C. Lagern Sie dann das beladene K-A-A-P-C mindestens drei Tage lang bei vier Grad Celsius, um eine ausreichende Peptidbeladung des HLA-A-Dimers mit zwei IG zu ermöglichen, um den A-K-A-A-P-C-In-vitro-Tötungsassay durchzuführen.

Waschen Sie das mit Peptid beladene K-A-A-P-C wie gezeigt mindestens sechsmal, um alle freien Peptide zu entfernen. Übertragen Sie dann K-A-A-P-C und zweimal 10 auf die fünften antigenspezifischen T-Zellen in eine Vertiefung pro Probe einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen in 200 Mikrolitern Co-Kulturmedium im Verhältnis eins zu eins nach 48 Stunden Kultur in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Übertragen Sie die Proben in die entsprechenden Faxröhren und waschen Sie sie in einem Milliliter eines Nexin-Fünf-Bindungspuffers.

Als nächstes resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern eines Nexin-Fünf-Bindungspuffers und inkubieren Sie die Proben dann in einem Mikroliter eines Nexin-Fünf-FITC und fünf Mikrolitern von sieben a a d bei Raumtemperatur. Nach 10 bis 15 Minuten waschen Sie die Proben mit einem Milliliter eines Nexin-Fünf-Bindungspuffers und resuspendieren Sie die Pellets in 250 Mikrolitern eines Nin-Fünf-Bindungspuffers. Anschließend werden die Proben sofort auf einem Durchflusszytometer abgelesen.

K-A-A-P-C zeigt gleichzeitig HLA A zwei IG und Antifa MAB an, das im Vergleich zu zellbasierten Ansätzen nicht durch Codierungs- oder Transduktionswirksamkeit verändert wird und während der Produktion leicht moduliert werden kann. K-A-A-P-C sind in der Lage, antigenspezifische T-Zellen in vitro zu depletieren, wenn sie mit verwandten Peptiden beladen sind, während sie nicht mit verwandten Peptiden beladen sind. K-A-A-P-C depletieren die T-Zellen nicht, so dass K-A-A-P-C die T-Zell-Apoptose auf antigenspezifische Weise induzierte.

Wenn K-A-A-P-C für die selektive Depletion von antigenspezifischen T-Zellen nur aus einer Mischung verschiedener T-Zell-Spezifitäten verwendet werden, tritt eine minimale Zytotoxizität in benachbarte T-Zellen ein. Somit stellt K-A-A-P-C ein exquisites Werkzeug für die in vitro Antigen-Depletion von humanen aktivierten antigenspezifischen T-Zellen dar, mit einer potenziellen klinischen Anwendbarkeit für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allotransplantatabstoßungen nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der zellulären Immunologie den Weg, neue Ansätze für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen zu erforschen.