Name: Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Telomerase-Aktivität in verschiedenen Regionen des Mausgehirns mit einem nicht-radioaktiven TRAP-Assay messen. Diese effiziente Methode ermöglicht den Vergleich zwischen männlichen und weiblichen Gehirnen.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch B.G. Negev Technologie und den Beitrag von Linda Powers.

Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche in der Ben-Gurion-Universität (IL-39-08-2010) zugelassen. 1. Maus Gehirn Proteinextraktion <ol><li> Bereiten Sie 3 Rohre von je 15 ml 5 ml Ringer-Lösung und Ort Röhrchen auf Eis enthält. </li><li> Opfern Sie die Maus mit Isofluran-Narkose (Achtung - chemische Haube) für 10-20 Sekunden, gefolgt von Genickbruch und sofortige Enthauptung. </li><li> Entfernen das Gehirn aus dem Schädel und gründlich für einige Sekunden mit eiskaltem Ringer-Lösung, um Schäden am Hirngewebe zu verhindern. </li><li> Verwendung einer chirurgischen Klinge, trennen das Cerebellum (CR) und Hirnstamm (BS) von dem frontalen Kortex. Als nächstes trennen das Kleinhirn aus dem Hirnstamm und schneiden den Frontallappen (FL) aus dem frontalen Kortex; entfernen Sie den Riechkolben aus der Frontallappen. Legen Sie die 3 Hirnregionen in den dafür vorgesehenen 15-ml-Röhrchen. </li><li> Homogenisieren des Gewebes in jedes Röhrchen. Fr hinzufügenesh eiskalt Ringer-Lösung, so dass jeder Röhre enthält das gleiche Volumen und Zentrifuge für 7 min bei 800 x g. </li><li> Entfernen des Überstandes und Zugabe von 100 ul Lysepuffer CHAPS in jedes Röhrchen. Gut mischen, indem die Lösung mehrmals (~ 10) durch ein 1-ml-Spritze mit einer 21 G-Nadel, und Inkubation auf Eis für 30 min. </li><li> Wird der Inhalt jedes Röhrchens in eine neue Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 30 min bei 13.000 x g. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmt die Proteinkonzentration unter Verwendung eines vorher festgelegten Verfahrens. Speichern die Proteinextrakte in Aliquots von 10 ul bei 80 ° C aufweist. </li></ol> 2. TRAP-Assay Vorbereitung der Instrumente, Reaktionslösungen und Protein Verdünnung Berechnungen <ol><li> Bereiten Sie entsprechende Anzahl von markierten Mikrozentrifugenröhrchen für Proteinextrakt Verdünnungen und Telomerase-Reaktionspuffer. Führen Sie alle Pipettieren im Protokoll mit Filterspitzen, um eine Verunreinigung zu verhindern. </li&gt; <li> Tauen die folgenden Lösungen auf Eis: TRAP-Reaktionsmischung 10x, TS-Primer, dNTPs, UPW und Proteinextrakte (siehe Tabelle der Werkstoffe für Reagenzien und Reagenzien Konzentrationen). </li><li> Verdünne die Lösung der Proteinextrakt in einer Endkonzentration von 1 ug / ul mit ultrareinem Wasser (UPW). </li></ol> 3. Telomerase-Reaktion <ol><li> Bereiten Telomerase Reaktionsmischung durch Hinzufügen der folgenden, um einen Mikrozentrifugenröhrchen: 2 ul TRAP-Mix (10x), 1 ul TS-Primer (0,1 ug), 1 ul dNTPs (10 mM) und 15 ul UPW. Für mehrere Proben, multiplizieren vorgenannten Volumina der Anzahl von Proben, plus 1. </li><li> Fügen 19 ul der Reaktionsmischung in jedes Reaktionsgefäß und mit 1 ul der verdünnten Proteinextrakt (1 ug Proteine) zu jedem Röhrchen für ein Endvolumen von 20 ul. </li><li> Zeigen die Reaktionsrohre in einem 30 ° C vorgewärmten Wasserbad für 45 min. </li></ol> 4. PCR-Reaktion <ol><li> Fünfzehn min vor dem Ende der Telomerase-Reaktion, tauen die folgenden Lösungen: ACX Grundierung, Titanium Taq-Puffer, UPW. </li><li> Bereiten PCR-Reaktionsmischung durch Zugabe Folgendes in einer Mikrozentrifugenröhrchen: 2,5 ul Titanium Taq-Puffer (10x), 1 ul ACX-Primer (0,1 ug), 2 ul UPW (1 ul, wenn IC verwendet wird) und 0,5 ul Titanium Taq-Polymerase (50x). Für mehrere Proben, multiplizieren vorgenannten Volumina der Anzahl von Proben plus 2. </li><li> Sie 6 ul des PCR-Gemisches zu jeder PCR-Röhrchen und fügen das gesamte Volumen des Telomerase-Reaktion (20 ul) zu jedem Röhrchen für ein Endvolumen von 26 ul. </li><li> Setzen Sie die PCR-Röhrchen zu einem PCR-Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: - 90 ° C - 2 min. - 94 ° C - 30 Sek. * - 60 ° C - 30 sec. * - 72 ° C -. 45 s * - 72 ° C - 2 min. Speicher PCR-Produkte bei -20 ° C. * = 34 Zyklen </li></ol> 5. Agarose Mini-gel Vorbereitung, Proben Laufen, und Gelfärbung <ol><li> 25 ml gekühltes Elektrophorese-Puffer (TBE) und einen Rührstab in ein Becherglas, das 2-4 mal das Volumen des Pufferlösung ist und langsam in 1,125 g des hochauflösenden (HR) Agarose-Pulver bestreuen, während die Lösung schnell gerührt . Entfernen Sie den Rührstab, decken Sie den Becher mit einer Kunststofffolie und Pierce in einem kleinen Loch für die Belüftung. Heizen Sie den Becher in der Mikrowelle auf &quot;Low&quot; Macht für 3 min und wechseln Sie dann auf &quot;Hoch&quot; Macht und erwärmen die Lösung in kurzen Pulsen mit Sorgfalt Verschütten nicht verursachen. Beachten Sie, dass, wenn der Schaum erzeugt wird durch Erhitzen großen Blasen und verschwindet nach einigen Sekunden ist die Agarose bereit. </li><li> Guss das Gel auf einer horizontalen Mini Gel Vorrichtung, nachdem die Gel erstarrt bei Raumtemperatur zu ermöglichen, um das Gel für 20 min bei 4 ° C zu kühlen, bevor Gebrauch. </li><li> Laden Sie jeder Spur mit 25 ul TRAP Probe (20 ul TRAP PCR-Produkte und 5 ul 6x Gel-Ladefarbstoff) und 11 laufen0 V für 3 Stunden in einer 4 ° C kalten Raum. </li><li> Bereiten Nukleinsäurefarbstoff 3x Arbeitslösung durch Zugabe von 15 ul 10.000-Nukleinsäure-Färbung, Stammlösung zu 50 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW) mit 0,1 M NaCl (0,29 g). Färben Sie das Gel für 20 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Verwenden UV-Transilluminator mit 302 nm Wellenlänge, die Falle Leiter DNA-Banden zu sehen. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
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<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Analyse von Telomerase-Aktivität in Gehirn der Maus über die TRAP-Assay besteht aus 4 Schritten: 1) Extraktion von Proteinen spezifische Bereiche des Hirngewebes 2) TS Primerverlängerung durch Telomerase - Telomerasereaktion 3) Amplifikation der Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR 4 ) Auftrennung der PCR-Produkte mit hoher Auflösung Agarosegel. Diese modifizierte TRAP-Assay befasst sich mit zwei Hauptschwierigkeiten, die sich aus der traditionellen Assay steigen: die Verwendung von radioa...

Telomerase ist ein Ribonukleoprotein-Telomerase zusammen Reverse Transkriptase (TERT), der katalytischen Untereinheit der Telomerase-RNA-Komponente und eine (TERC). Die kanonische Funktion der Telomerase ist, um die richtige Länge der Telomere durch Zugabe von repetitiven Sequenzen (TTAGGG) an die telomeren Enden, damit die Förderung der genomischen Integrität und Zellproliferation 1 erhalten. Weitere Rollen wurden in TERT-Zellen zurückzuführen, dh Resistenz gegen Apoptose durch verschiedene schädigende Mittel induziert 2 schützt humanen mesenchymalen Stammzellen vor oxidativer Beanspruchung 3, und spielt eine überlebens Rolle vollständig differenzierten Neuronen durch seine Verbindung zum positiven RNA TIA1 Granulat 4. TERT exprimiert wird, und vor allem in Körperteilenden Zellen und in den meisten Krebsarten aktiv ist, während die Enzymexpression und Aktivität sind fest in nicht-teilenden Zellen 5,6 geregelt. Studien haben gezeigt, dass das ROdent Gehirn, wird die Telomerase-Aktivität nicht nachweisbar durch postnatalen Tag 10, während TERT mRNA wird auf den unteren Ebenen bis ins Erwachsenenalter 7 gehalten. Andere Studien zeigten, Telomeraseaktivität in der Erwachsenenunter ventrikulären Zone, dem Riechkolben, dem Hippocampus und im Cortex und Cerebellum Erwachsenen 8. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass neue Verbindungen, die Telomerase-Expression und Aktivität im Gehirn und Rückenmark zu erhöhen ausgeübt neuroprotektive Effekte in N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) - injizierten Mäusen, verzögert die Entstehung und das Fortschreiten der Krankheit Amyotrophe Lateralsklerose in SOD1 transgenen Mäuse und erhöhte das Überleben von Motoneuronen im Rückenmark von diesen Mäusen 9. Um die überlebens Rolle der Telomerase in Neuronen im Gehirn zu verstehen, ist es wichtig, ein einfaches und relativ empfindlich schnelle Methode zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Bereichen des Gehirns zu entwickeln. Die Telomer-repeat Amplifikationsprotokoll (TRAP) ist eine bekannte empfindliche Assays Kombinieren des kanonischen Aktivität der Telomerase und der Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Assay fügt Telomerase TTAGGG Wiederholungen für eine Telomerase-Substrat (TS-Primer) Oligonukleotid, gefolgt von PCR-Amplifikation mit 6 Basenpaaren (bp)-DNA-Leiter mit der TS Rückwärtsprimer erzeugt -. ACX 32 P markiertem dCTP werden verwendet, um die Erfassungs geringe Menge an PCR-Produkten. Die DNA-Leiter wird durch Sequenzierung Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gelöst. Sowohl die Intensität der DNA-Banden und die Länge der DNA-Leiter spiegeln die Menge an aktiven Enzymmolekülen und ihre Prozessivität bzw. 10. Das traditionelle Test hält einige größere Schwierigkeiten: Die Gefahr der Belastung durch radioaktive Stoffe, groß und schwer, Sequenzierung PAGE und der Zeitaufwand des Gels Laufen und Filmbelichtung des radioaktiven Produkt (über Nacht in beiden Fällen) zu behandeln. </p&gt; Dieses Protokoll bietet eine verbesserte nicht-radioaktiven Agarose-Gel-Mini-basierte Assays. Die DNA 6 bp-Leiter wird mit 4,5% hochauflösende Agarose-Gel aufgetrennt und die Detektion erfolgt mittels hochempfindlicher Nukleinsäure Fleck. Die Kombination von hoher Auflösung mit Agarose-Gel-Mini und empfindliche Nukleinsäurefärbung bietet einfach zu hand Assay, beseitigt die Gefahr der Radioaktivität ausgesetzt sind und die Gesamtdauer Assay 3 Tagen deutlich verkürzen, um mehrere Stunden.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Manuell hergestellt, mischen Sie Folgendes in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (von Sigma gekauft). Aliquots werden bei -20 °C eingefroren.</td></tr><tr><td>Ringer-Lösung</td><td></td><td></td><td>Manuell hergestellt, mischen Sie Folgendes in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4&middot; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-Glukose wasserfrei.</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Vorsichtig handhaben in einer Chemikalienhaube</td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS Primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')Sigma</td><td></td><td></td> <td>DNA-Oligos im DRY-Format bestellt und UPW entsprechend der geforderten Konzentration hinzugefügt</td></tr><tr><td>ACX Primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA-Oligos im DRY-Format bestellt und UPW nach Bedarf hinzugefügt Konzentration</td></tr><tr><td>Titan Taq Polymerase/Puffer</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>Hochauflösende</td><td>Agarose Sigma</td><td>A4718</td><td>Jede hochwertige hochauflösende Agarose kann geeignet sein</td></tr><tr><td>Mini-Gel-Gerät</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Nukleinsäure-Färbung (GEL-RED)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC-Primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA-Oligos, bestellt im DRY-Format und Zugabe von UPW entsprechend der erforderlichen Konzentration</td></tr><tr><td>CHAPS-Lysepuffer</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9852S</td><td>Zugabe von PMSF (Proteaseinhibitor) zu einer Endkonzentration von 1 mM</td></tr><tr><td>Reinstwasser (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 Mäuse</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

telomerase-aktivität in den verschiedenen regionen der maus gehirn: nicht-radioaktive telomerase repeat amplification protocol (trap)-assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, ein ribonucleoprotein, ist für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge und damit die Förderung der genomischen Integrität, Proliferation und Lebensdauer verantwortlich. Darüber hinaus schützt die Telomerase Mitochondrien aus oxidativem Stress und verleiht Resistenz gegenüber Apoptose, was seine mögliche Bedeutung für das Überleben der nicht-mitotischen hochaktive Zellen, wie Neuronen. Wir haben bereits gezeigt, die Fähigkeit der neuen Telomerase-Aktivatoren, um die Telomerase-Aktivität und Expression in den verschiedenen Hirnregionen der Maus zu erhöhen und die motorischen Nervenzellen Zellen vor oxidativem Stress zu schützen. Diese Ergebnisse stärken die Vorstellung, dass die Telomerase in den Schutz von Neuronen vor verschiedenen Läsionen beteiligt. Um die Rolle der Telomerase im Gehirn unterstreichen, hier vergleichen wir die Aktivität der Telomerase in männlichen und weiblichen Maus Gehirn und seine Abhängigkeit vom Alter. TRAP-Assay ist ein Standardverfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in verschiedenen Geweben oder Zelllinien. Die Analy Hier zeigen wirsis der Telomerase-Aktivität in drei Regionen des Mäusehirns durch nicht-denaturierenden Protein-Extraktion unter Verwendung von CHAPS Lysepuffer gefolgt von Modifikation der Standard-TRAP-Assay. In diesem 2-Schritt-Assay, verlängert endogenen Telomerase eine bestimmte Telomerasesubstrat (TS-Primer) durch Zugabe von 6 bp TTAGGG Wiederholungen (Telomerase-Reaktion). Die Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR-Reaktion die Schaffung einer DNA-Leiter mit 6 bp-Schritten amplifiziert. Die Analyse der DNA-Leiter wird durch 4,5% Agarose hochauflösende Gelelektrophorese, gefolgt von Anfärben mit hochempfindlichen Nucleinsäure-Färbung. Im Vergleich zu den traditionellen TRAP-Assay, nutzen 32 P markierten radioaktiven dCTP für DNA-Detektion und-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Lösung des DNA-Leiter, bietet das Protokoll eine nicht-toxische Zeitersparnis TRAP-Assay zur Auswertung der Telomeraseaktivität im Gehirn der Maus, demonstrieren die Fähigkeit, erkennen Unterschiede in telomerasE-Aktivität in den verschiedenen weiblichen und männlichen Gehirn der Maus Region.

Gesamtzellproteinextrakte wurden aus dem Frontallappen (FL), Hirnstamm (BS) und Cerebellum (CR) hergestellt aus 3 CD-1 und 3 weibliche CD-1 männliche Mäuse im Alter von 1 und 3 Monaten für die abgeleitete TRAP-Assay modifiziert und 3 CD-1 männliche Mäuse im Alter von 2 Monate alt für die radioaktive TRAP-Assay. Telomerase-Aktivität wurde in 1 pg Proteine ​​festgestellt wurden unter Verwendung der modifizierten TRAP-Assay und 2 pg Proteine ​​zu extrahieren für die radioaktive TRAP-Assay. Nachweis von Telomerase-Aktivität...

Telomerase wird im Gehirn von Neugeborenen und auch in verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns exprimiert. Wir präsentieren einen ungiftigen, zeitsparenden TRAP-Assay zur Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen Regionen des Mäusegehirns und zum Nachweis von Unterschieden in der Telomeraseaktivität zwischen männlichen und weiblichen Mäusegehirnen.

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Telomeraseaktivität in normalem Hirngewebe zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Ganzzellproteinextrakte aus verschiedenen Hirngeweben als Quelle für ein aktives Telomerase-Enzym hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, äquivalente Mengen der Proteinextrakte zu einem spezifischen Telomerase-Reaktionsgemisch hinzuzufügen, das das für die Telomeraseaktivität benötigte Substrat und die Nukleotide enthält.Anschließend werden die Telomerase-Reaktionsprodukte mittels PCR amplifiziert und mittels hochauflösender Arous-Gel-Elektrophorese analysiert. Der letzte Schritt besteht darin, die amplifizierten Telomerase-Reaktionsprodukte zu visualisieren, indem das Arous-Gel mit einem hochempfindlichen DNA-Färbemittel gefärbt wird, das letztendlich aus diesem Thomastrahl-Repeat-Amplifikationsprotokoll-Assay resultiert, das sechs Basenpaar-Inkremente zeigt, DNA-Leitern, die der Aktivität des Thomastrahls in verschiedenen Hirngeweben entsprechen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. einem radioaktiven Trap-Assay oder kommerziellen Trap-Assay-Kits, besteht darin, dass dieses Protokoll eine relativ zeit- und kosteneffiziente Alternative bietet.Obwohl diese Methode einen Einblick in Tausende von Aktivitäten im Gehirngewebe geben kann, kann sie auch auf jedes andere lebende Gewebe oder jede Zellkultur angewendet werden. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens drei 15-Milliliter-Röhrchen mit jeweils fünf Millilitern Ringerlösung vor. Legen Sie die Schläuche auf Eis, nachdem Sie das Gehirn einer euthanasierten Maus entnommen haben.Spülen Sie das Gehirn einige Sekunden lang mit eiskalter Klingellösung aus, um Schäden am Gehirngewebe zu vermeiden. Trennen Sie mit einer chirurgischen Klinge das Kleinhirn und den Hirnstamm von der frontalen Rinde. Trennen Sie als Nächstes das Kleinhirn vom Hirnstamm.Entferne den Riechkolben aus dem Frontallappen und schneide den Frontallappen aus der frontalen Rinde ab. Legen Sie die drei Hirnregionen in die dafür vorgesehenen 15-Milliliter-Röhrchen, homogenisieren Sie das Gewebe in jedem Röhrchen. Fügen Sie dann frische eiskalte Ringerlösung hinzu, so dass jedes Röhrchen das gleiche Volumen enthält, und zentrifugieren Sie sieben Minuten lang bei 800 mal G, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter Chap-Scheiben hinzu.Puffer zu jedem Röhrchen. Mischen Sie gut, indem Sie die Lösung etwa 10 Mal durch eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 21-Gauge-Nudel geben und 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Übertragen Sie nach 30 Minuten den Inhalt jedes Röhrchens in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 30 Minuten lang.Bei 13.000 Mal G wird das Supinat auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration mit einer zuvor etablierten Methode lagern Sie die Proteinextrakte in Aliquoten von 10 Mikrolitern bei minus 80 Grad Celsius. Beginnen Sie diesen Teil des Protokolls, indem Sie die entsprechende Anzahl markierter Mikrozentrifugenröhrchen für die Proteinextraktverdünnungen und den Telomerase-Reaktionspuffer für die folgenden Lösungen auf Eis vorbereiten.10 x Trap Reaktionsmix DS Primer dn tps, Reinstwasser und Proteinextrakte verdünnen die Lösung des Proteinextrakts auf eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter. Verwenden Sie Reinstwasser und führen Sie das Pipettieren mit Filterspitzen durch, um eine Kontamination oder die Telomerreaktion zu verhindern. Jede Probe erfordert eine Telomer-Reaktionsmischung, die aus zwei Mikrolitern Trap-Mix, einem Mikroliter TS-Primer, einem Mikroliter DN-NTPs und 15 Mikrolitern Reinstwasser für mehrere Proben besteht.Multiplizieren Sie diese Volumina mit der Anzahl der Proben plus eins, geben Sie 19 Mikroliter des MASE-Reaktionsgemisches in jedes Reaktionsröhrchen, gefolgt von einem Mikroliter des verdünnten Proteinextrakts. Für ein Endvolumen von 20 Mikrolitern legen Sie die Reaktionsgefäße für 45 Minuten in ein 30 Grad Celsius vorgewärmtes Wasserbad. Bereiten Sie sich 15 Minuten vor dem Ende der Thres-Reaktion auf die Amplifikation der Thres-Reaktionsprodukte vor, indem Sie die folgenden Lösungen, einen CX-Primer, einen Titan-Tack-Puffer und Reinstwasser zupfen.Jede Probe benötigt einen PCR-Reaktionsmix, der aus 2,5 Mikrolitern Titan-Tech-Puffer, einem Mikroliter eines CX-Primers, zwei Mikrolitern Reinstwasser und 0,5 Mikrolitern Titan-Tech-Polymerase für mehrere Proben besteht. Multiplizieren Sie diese Volumina mit der Anzahl der Samples plus zwei. Geben Sie sechs Mikroliter der PCR-Reaktionsmischung in jedes PCR-Röhrchen und geben Sie das gesamte Volumen mit der Mase-Reaktion in jedes Röhrchen.Für ein Endvolumen von 26 Mikrolitern setzen Sie die PCR-Röhrchen in einen PCR-Thermocycler ein und führen Sie das folgende Programm durch: 90 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 34 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 30 Sekunden, 60 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für 45 Sekunden. Und noch zwei Minuten bei 72 Grad Celsius.Wenn die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, lagern Sie die PCR-Produkte bei minus 20 Grad Celsius. Um die Eierrosen für den Guss des Minigels vorzubereiten, geben Sie zunächst 25 Milliliter gekühlten FSME-Elektrophoresepuffer und einen Rührstab in ein Becherglas, das das zwei- bis vierfache Volumen der Pufferlösung hat, und beginnen Sie zu rühren. Streuen Sie dann langsam 1,125 Gramm des hochauflösenden aros Pulvers hinein.Während die Lösung schnell rührt, entfernen Sie den Sternstab. Decken Sie den Becher mit Frischhaltefolie ab und stechen Sie ein kleines Loch zur Belüftung. Beim Erreichen des Agros ist es entscheidend, den Siedepunkt zu erreichen, um den Agros vollständig aufzulösen.Achten Sie darauf, dem Becherglas in der Mikrowelle volle Aufmerksamkeit zu schenken, um sicherzustellen, dass der erzeugte Schaum nicht überläuft. Erhitzen Sie das Becherglas in der Mikrowelle drei Minuten lang bei niedriger Leistung, schalten Sie dann auf hohe Leistung um und erhitzen Sie die Lösung in kurzen Impulsen, wobei Sie darauf achten, dass kein Verschütten erfolgt. Gießen Sie das Gel in ein horizontales Mini-Gel-Gerät und lassen Sie es bei Raumtemperatur erstarren. Nachdem sich das Gel 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius verfestigt hat.Vor der Verwendung für die Elektrophorese jede Bahn mit 25 Mikrolitern Fallenprobe beladen und drei Stunden lang mit 110 Volt in einem vier Grad Celsius kalten Raum laufen lassen, während das Gel läuft. Bereiten Sie eine Arbeitslösung für drei Nukleinsäurefärbemittel vor, indem Sie 15 Mikroliter 10.000 x Nukleinsäure-Färbestoff-Stammlösung zu 50 Millilitern doppelt destilliertem Wasser mit 0,1 molaren Natriumchlorid hinzufügen. Wenn die Elektrophorese der Proben abgeschlossen ist, färben Sie das Gel 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.Verwenden Sie schließlich einen UV-Trans-Strahler mit einer Wellenlänge von 302 Nanometern. Um die Fallenleiter zu betrachten, wurde die Telomereaktivität der DNA-Banden in Regionen des Mäusegehirns sowohl mit den traditionellen als auch mit den modifizierten Fallenassays nachgewiesen. Mit dem modifizierten Assay wurde eine bessere Visualisierung und Auflösung der Telomere-DNA-Produkte beobachtet, was sich an der Länge und Intensität der DNA-Leiter zeigt.Eine allmähliche Verringerung der Telomer-DNA-Produkte wurde beobachtet, wenn abnehmende Konzentrationen von Proteinextrakten in dem modifizierten Trap-Assay verwendet wurden, was auf seine Empfindlichkeit für den Nachweis der Telomereaktivität bei niedrigeren Proteinkonzentrationen hindeutet, der Nachweis der Telomeraseaktivität durch den modifizierten Assay in drei Gehirnregionen von einmonatigen weiblichen und männlichen Mäusen zeigte keine signifikanten Unterschiede. Bei drei Monate alten Mäusen zeigt sich jedoch eine höhere Telomeraseaktivität im Frontallappen und Hirnstamm im Vergleich zum Kleinhirn, was sich aus der Intensität der DNA-Banden und der Länge der DNA-Produktleiter ergibt. Während des Übergangs der Maus ins Erwachsenenalter nimmt die Aktivität des Thomastrahls im Frontallappen zu und nimmt im Hirnstamm und im Kleinhirn ab.Die Aktivität einiger Telomere scheint auch im Frontallappen bei Frauen höher zu sein. Im Gegensatz zu einer höheren Telomeraktivität im Hirnstamm und Kleinhirn bei Männern kann diese Technik nach der Beherrschung in sechs bis sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Thomaaktivität in dem Gewebe Ihrer Wahl leicht bestimmen können.

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Telomer und Telomerase spielen eine wesentliche Rolle beim Altern und bei der Tumorentstehung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie zwei murine induzierbare Telomerase-Knock-in-Allele erzeugt und wie sie in den Studien zur Gewebedegeneration/-regeneration und Krebs verwendet werden können.

Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) synthetisiert nicht nur telomeric DNA, sondern auch doppelsträngige RNA durch RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität. Hier beschreiben wir einen neu gegründeten Assay um RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität der endogenen TERT zu erkennen.

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Krebs Zellklonen mit einem MS2 Sequenz Beschriftung auf einer einzigen Produktlinie zu generieren. Dieser Ansatz, unter Berufung auf das MS2-GFP-System ermöglicht die Visualisierung der endogenen Abschriften der telomeric Repeat-haltigen RNA (TERRA) von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt.

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung eines lebensfähigen weiblichen Murinmodells mit nicht zufälliger X-Chromosomeninaktivierung, d.h. das mütterlich vererbte X-Chromosom ist in 100% der Zellen inaktiv. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Prüfung der Machbarkeit, Verträglichkeit und Sicherheit der pharmakologischen Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo.

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Wir haben erfolgreich den Standard-Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) umgebaut, der in Tröpfchenspolonen-Kettenreaktionen eingesetzt werden soll. Dieser neue Test, genannt ddTRAP, ist sensibler und quantitativer, was eine bessere Erkennung und statistische Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen menschlichen Zellen ermöglicht.

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Erfahren Sie, wie Sie die Telomerase-Aktivität in verschiedenen Regionen des Mausgehirns mit einem nicht-radioaktiven TRAP-Assay messen. Diese effiziente Methode ermöglicht den Vergleich zwischen männlichen und weiblichen Gehirnen.

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay (Video) | JoVE Journal

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

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