Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere

Hallo, ich bin Hel Lin, ein Postgraduierter am Near Science Center der Universität Helsinki. Heute zeigen meine Kollegen und ich, wie man optische und elektrophysiologische Ableitungen bei wachenden Köpfen fixierten, ansonsten aber frei bewegenden und verhaltenen Tieren durchführen kann. Unsere Methode schafft eine greifbare, vertraute Umgebung, in der die Maus navigieren und die sie erkunden kann.

Bei der mikroskopischen Bildgebung oder elektrophysiologischen Einzelzellaufnahmen, die eine feste Fixierung des Tierkopfes erfordern, implantieren wir ein chronisches Schädelfenster und gewöhnen die Maus an einen lufttransportierten Wohnmobilkäfig, der unter den Füßen des Tieres hindurchgleitet. Während der Fortbewegung auf einer ebenen Fläche kann der Wohnmobilkäfig unter einem aufrechten Standardmikroskop für die Zwei-Photonen-Bildgebung positioniert oder in eine Elektrophysiologie gestellt werden, die für Patch-Clamp-Aufzeichnungen in einem wachen Mausgehirn eingerichtet ist. Alle hier vorgestellten experimentellen Verfahren wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt.

Wir implantieren Schädelfenster nach veröffentlichten Protokollen mit geringfügigen Änderungen bei der Implantation von Schädelfenstern. Während dieser Erholungsphase darf sich das Tier mindestens zwei bis drei Wochen lang erholen, das Fenster erhält in der Regel seine Transparenz zurück. Tiere mit Anzeichen einer verbleibenden postoperativen Entzündung werden von den Versuchen ausgeschlossen.

Trainieren Sie die für eine Studie ausgewählten Tiere, um sie an die Kopffixierung zu gewöhnen. Behandeln Sie die Maus im Wohnmobilkäfig fünf bis 10 Minuten lang ruhig, vermeiden Sie abrupte Bewegungen und Geräusche und bringen Sie sie dann wieder in den Heimkäfig zurück. Wiederholen Sie den Vorgang zwei- bis dreimal in ungleichen Abständen.

Der Mobilkäfig ermöglicht die Fixierung des Kopfes, ohne das Tier vor der Kopffixierung zu betäuben. Verwenden Sie einen Lappen, um die Maus zwei- oder dreimal in ungleichen Abständen einzuwickeln. Achten Sie darauf, dass das Tier ruhig bleibt, während es eingewickelt ist.

Andernfalls wiederholen Sie den Vorgang, bis sich die Maus vollständig daran gewöhnt hat. Beginnen Sie das zweimal tägliche Training der Mäuse auf dem Wohnmobilkäfig am nächsten Tag, nachdem die Handhabung abgeschlossen ist. Wiegen Sie die Tiere vor jeder Trainingseinheit.

Tiere, die einen Gewichtsverlust von mehr als 10 % aufweisen, sollten von der Studie ausgeschlossen werden. Passen Sie die Position des Kopffixierarms an die Größe des trainierten Tieres an. Verbinden Sie den Lufteinlass des Käfiggeräts für Wohnmobile mit dem Standard-Druckluftauslass für Labors.

Stellen Sie sicher, dass der Luftdruck für einen freien Auftrieb des luftgehobenen Heimkäfigs ausreicht. Beginnen Sie mit dem Training von gewöhnten Tieren im Wohnmobilkäfig. Lege die Maus ruhig, indem du sie in den Lappen einwickelst.

Setzen Sie die am Kopf des Tieres befestigte Metallhalterung in den Kopffixierarm ein und fixieren Sie sie fest, indem Sie die Schrauben festziehen. Schalten Sie den Luftstrom ein, um den lufttransportierten Heimkäfig zum Schweben zu bringen. Entfernen Sie den Lappen und lassen Sie die Maus den Käfig zu Hause erkunden.

Während der ersten Trainingseinheit können Mäuse ein Erstarrungs- und Zitterverhalten sowie eine Schwanzaufrichtung zeigen. Um das Tier an Lärm zu gewöhnen, sorgen Sie dafür, dass es während aller Trainingseinheiten sowie während der Versuche ständig Umgebungsgeräuschen ausgesetzt ist, z. B. durch eine Radioübersetzung oder aufgezeichnete Musik und Sprache. Um chronischen Stress zu vermeiden, verwenden Sie in der ersten Stunde der Trainingseinheit helles Licht.

Führen Sie nach der ersten Stunde das Training im Dunkeln durch und verwenden Sie eine Nahinfrarotkamera, um das Verhalten des Tieres zu überwachen. Wenn die Trainingseinheit beendet ist, lösen Sie das Tier aus dem Kopffixierungsarm, indem Sie die Schrauben lösen. Bringen Sie das Tier für mindestens zwei Stunden vor der nächsten Trainingseinheit in den Heimkäfig zurück.

Wenn Sie die Maus mit zwei oder mehr anderen Mäusen in einem Käfig halten, verringert sich der Stresspegel. Optional können Sie den Luftkäfig zusammen mit dem Tier in seinem Heimatkäfig platzieren. Dies wird die Umgebung bereichern und kann die Unterbringung des Tieres im Käfig des Wohnmobils verstärken.

Während der letzten Trainingseinheit sind Mäuse an die Kopffixierung gewöhnt und sollten ein stressfreies Verhalten zeigen, indem sie ruhig um den lufttransportierten Heimkäfig navigieren. In Abwesenheit von sichtbarem Licht kann die Bewegungsbahn der Maus verfolgt werden, indem die Bewegungen des Käfigs mit einer Nahinfrarotkamera oder mit einer optischen Computermaus überwacht werden. Bei längeren Trainingseinheiten, die länger als ein oder zwei Stunden dauern, sollten Sie in Erwägung ziehen, der Maus Trinkwasser zu geben, entweder manuell oder mit einem Pipettenhalter, der am Käfigrahmen des Wohnmobils befestigt ist.

Das folgende Diagramm fasst den zeitlichen Ablauf einer typischen experimentellen Studie zusammen. Die Studie beginnt mit der Implantation des Schädelfensters zwei Wochen vor dem Umgang mit der Maus und wird mit acht zweimal täglichen Trainingseinheiten fortgesetzt. Die typische Studie umfasst eine Reihe von bildgebenden Sitzungen oder Patch-Clamp-Aufnahmesitzungen, die in einem Abstand von wenigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen durchgeführt werden.

Sowohl optische als auch elektrophysiologische Experimente können parallel zu kognitiven oder verhaltensbezogenen Reizen und Auslesungen durchgeführt werden. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist eine einzigartige nichtlineare optische Technologie, die die Echtzeit-Visualisierung zellulärer und sogar subzellulärer Strukturen in tiefen kortikalen Schichten des Gehirns eines Nagetiers ermöglicht. Um ein mikroskopisches Bildgebungsexperiment mit zwei Photonen durchzuführen, setzen Sie ein trainiertes Tier in den Käfig des Wohnmobils und stellen Sie die Stopper ein, um die Mikroskopoptik vor versehentlicher Beschädigung zu schützen.

Reinigen Sie das Deckglas des Schädelfensters, um Staubpartikel zu entfernen. Tropfen Sie eine Tauchflüssigkeit auf das Deckglas. Wir empfehlen die Verwendung von Viskuslösung, da Wasser schnell verdunstet.

Die Plattform kann unter Verwendung des Weitfeldmodus des Fluoreszenzmikroskops und eines Langpass-Emissionsfilters auf einem typischen motorisierten optischen Tisch platziert werden. Beurteilen Sie das Gefäßsystem des Gehirns und wählen Sie eine Region von Interesse aus. Zur Bildgebung eines kortikalen Gefäßsystems, das in die Schwanzvene eines kopffesten und immobilisierten Tieres injiziert wird, wird ein 70 Kilo Dalton, Texas roter konjugierter Text Trans.

Diese Bildsequenz zeigt eine Zeitrafferaufnahme von Schauplätzen und Arterien in der Hirnrinde einer sich verhaltenden Maus, während sie um den Käfig des Wohnmobils navigiert. Durch die Darstellung des Profils der Linien, die über das Gefäßlumen gezogen werden, kann man die Veränderungen des Gefäßdurchmessers und der Motilität einzelner Gefäßsegmente messen. Die Geschwindigkeit des Blutflusses in Arterien und Venen kann durch Abtastung entlang der parallel zur Gefäßwand gezogenen Linien gemessen werden. Fein.

Details der Neuronenmorphologie können in transgenen Mäusen sichtbar gemacht werden, die YFP in der Subpopulation von Neuronen unter dem Taiwan-Promotor exprimieren. Diese beiden Zacks vergleichen die Bildstabilität zwischen narkotisierten und wachen Tieren. Das rechte Seitenteil zeigt Dendriten des Tieres, das mit einem Ketamin-Xylazin-Gemisch betäubt wurde.

Während das linke Seitenteil ein Dendritenbild in einem wachen Tier zeigt, das um einen Wohnmobilkäfig herumläuft. Die individuelle Morphologie der Wirbelsäule bei wachen Tieren kann mit der gleichen Zuverlässigkeit und Präzision analysiert werden wie bei den anästhesierten Mäusen. Die Verschiebung des Gehirns beim Laufen von Tieren überschreitet in der Regel nicht ein bis eineinhalb Mikrometer.

Diese Bewegungen erfolgen in horizontalen Richtungen und führen sehr selten zu einer Verschiebung der Abbildungsebene, die eine Korrektur von Bewegungsartefakten überflüssig macht. In den meisten Fällen ist die Fähigkeit, die neuronale Aktivität im wachen lebenden Gehirn chronisch zu überwachen, essentiell für das Verständnis der Organisation und Funktion des Nervensystems. Mit Hilfe der drei transgenen Mäuse von tie one G Camp bilden wir die spontane neuronale Aktivität der wachen Mäuse ab, die sich im Wohnmobilkäfig verhalten.

Diese Zeitraffer-Bildsequenz zeigt repräsentative Beispiele für Kalziumspitzen in neuronalen Zellkörpern, Niten und Axonen. Die optische Bildgebung auf der Grundlage intrinsischer Signale ermöglicht die Kartierung der räumlichen Verteilung von Funktionsbereichen, um ein intrinsisches optisches Bildgebungsexperiment durchzuführen. Setzen Sie das trainierte Tier in den Heimkäfig, der unter dem Kameraobjektiv positioniert ist.

Reinigen Sie das Deckglas von Staub. Geben Sie einen Tropfen Glycerin hinzu und bedecken Sie es mit einem fünf Millimeter runden Deckblatt. Optimieren Sie die Position einer Hochgeschwindigkeitskamera.

Platzieren Sie einen Manipulator mit einem Luftblasrohr gegenüber der kontralateralen Schwingung. Verwenden Sie grüne Lichter, um die Schiffskarte abzubilden. Fokussieren Sie sich tiefer in die Hirnrinde, etwa 400 Mikrometer unterhalb der kortikalen Gefäße.

Platzieren Sie einen Bandpassfilter vor der Kamera und beleuchten Sie den Kortex mit einem roten Licht. Lassen Sie die Maus mindestens 30 Minuten lang an die Plattform anpassen. Zeichnen Sie die Grundaktivität während einer sechsminütigen Episode auf.

Stimulieren Sie die Vibration alle 10 Sekunden mit Luftstößen für einen Zeitraum von insgesamt sechs Minuten. Dieses Bild zeigt die neuronale Aktivität, die sich entlang des somatosensorischen Kortex als Reaktion auf eine Vibrationsstimulation mit einer Frequenz von 0,05 Hertz ausbreitet. Um elektrophysiologische Einzelzellaufnahmen durchzuführen, setzen Sie das trainierte Tier, dem ein umgekehrtes Schädelfenster implantiert wurde, in den Käfig des Wohnmobils.

Entfernen Sie langsam und vorsichtig das Deckglas von der Metallhalterung. Frischen Sie den kortikalen Puffer auf und reinigen Sie das Schädelfenster mit einem hämostatischen Tampon von Ablagerungen. Platzieren Sie die Masseelektrode in den kortikalen Puffer.

Füllen Sie die Pipette der Patch-Klemme mit intrazellulärer Lösung. Üben Sie mit einem motorisierten Mikromanipulator einen Überdruck auf die Aufnahmepipette aus, vertiefen Sie die Pipette in den Kortex und erhalten Sie einen Giga-Seal-Kontakt mit der interessierenden Zelle. Entfernen Sie nach der Aufnahme die Pipette, frischen Sie den kortikalen Puffer auf und schließen Sie das Schädelfenster, indem Sie ein Deckglas auf die Metallhalterung kleben.

Die Verwendung eines lufttransportierten Heimkäfigs ermöglicht die Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie mit klassischen Verhaltensparadigmen wie Lernen, Rehabilitation oder angstbezogenem Verhalten. Der Geruchssinn ist ein wichtiger sensorischer Input für Mäuse und kann zur Stimulation in Gedächtnistests und zur Beurteilung der Reaktion auf Neues verwendet werden. Um einen Gewöhnungstest durchzuführen, setzen Sie das trainierte Tier in den Käfig des Wohnmobils und lassen Sie es adoptieren.

Befestigen Sie 30 Minuten lang ein sauberes, in Leitungswasser getränktes Stück Baumwolle mit einem beidseitigen Klebeband an der Innenwand des Wohnmobilkäfigs. Ersetzen Sie nach fünf Minuten die saubere Watte an der Wand des Käfigs durch eine neue, die in einer Flüssigkeit mit Vanillegeruch getränkt ist. Wiederholen Sie die fünfminütigen Kontakte mit dem Vanillegeruch dreimal im Abstand von fünf Minuten zwischen den Sitzungen.

Um das Interesse am Geruch zu messen. Zählen Sie die kumulierte Zeit, die das Tier mit Blick auf die Zielzone verbringt, und die Gesamtzeit, die sich der Käfig des Wohnmobils bewegt hat. Während der letzten fünften Sitzung einen sozial bedeutsamen Geruch aufweisen.

Befeuchten Sie den neuen Baumwollapplikator mit ein paar Tropfen Urin von Mäusen des anderen Geschlechts. Um die Reaktion auf Neuheit zu beurteilen, unterteilen Sie den Käfig des Wohnmobils in vier Zonen. Befestigen Sie zwei Baumwollstücke gegenüberliegend. Farbe.

Kodieren Sie sie während des ersten Versuchs mit Markern an der Außenseite der Käfigwände. Legen Sie zwei saubere Baumwollstücke hinein. Ersetzen Sie dann beide durch Baumwolle, die in einem 1%igen Vanilleextrakt getränkt ist.

Während des dritten Versuchs legen Sie die Vanillewatte in Zone Nummer eins und das in einem 1%igen Bananenextrakt getränkte Stück Baumwolle in die Zone. Nummer zwei, um die Präferenz für keinen Geruch zu messen. Berechnen Sie die Zeit, die Tiere mit dem Geruchsverbot verbringen, als Prozentsatz der kumulierten Zeit, die sie anderen Zonen gegenüberstehen.

Hallo, ich bin Leo Kiro, Principal Investigator am Neuroscience Center der Universität Helsinki. Ich hoffe, Ihnen hat das Video gefallen und Sie fanden es nützlich. Wir haben in den letzten fünf Jahren mit zweifacher Mikroskopie in vivo gearbeitet, und die Verwendung von Allgemeinem und Ästhetik war schon immer ein großes Anliegen, weil eine Ästhetik die Gehirnfunktion, den Blutfluss und alles andere beeinträchtigt.

Und heute bin ich froh, dass wir an wachen Tieren arbeiten und stabile mikroskopische Bildgebungsexperimente durchführen und die Ergebnisse, die wir zuvor bei anästhesierten Tieren erhalten haben, validieren und verifizieren können. Ich bin mir sicher, dass der Einsatz von Wohnmobilkäfigen und die Methoden, die wir heute vorgestellt haben, die Relevanz der In-vivo-Forschung im Allgemeinen erhöhen und zu neuen und bahnbrechenden Ergebnissen führen werden, und ich freue mich darauf.