Name: Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie optische und elektrophysiologische Aufnahmen bei wachen, kopffixierten, aber frei beweglichen Mäusen durchführen. Diese Methode kombiniert Zwei-Photonen-Mikroskopie und Patch-Clamp-Techniken mit natürlichem Verhalten.

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Die Autoren danken Prof. Eero Castren für seine wertvolle Kommentare zum Manuskript. Die Arbeit wird durch Zuschüsse aus der Akademie von Finnland, Zentrum für internationale Mobilität von Finnland und finnische Graduate School of Neuroscience (Gehirn und Geist Doctoral Program) unterstützt.

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<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
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<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
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<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
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<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
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<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Um Gehirn Physiologie und Pathologie, besser zu verstehen, muss die Forschung auf eine Vielzahl von Vorbereitungskomplexitätsstufen durchgeführt werden, unter Verwendung der am besten geeigneten Techniken für jede Zubereitung. Derzeit werden eine Vielzahl von Methoden der Neurowissenschaften (von Ganzkörper-fMRI-Sub-Organellen STED-Mikroskopie) leicht an narkotisierten Tieren angelegt, während Experimente an wach und Tiere verhalten haben eine erhebliche methodische Herausforderung vertreten. Hier wird ein neuer Ansatz beschrieben, bei dem ein Labortier, obwohl sie fest Kopf fixiert ist, kann um eine Klima angehoben Mobil homecage bewegen und erkunden Sie die Umgebung unter Sachstressfreien Bedingungen. Der Kopf fest verhalten Tierpräparation hier vorge bietet eine Reihe entscheidender Vorteile. Erstens sind mit dieser Methode erhaltenen elektrophysiologischen oder Bilddaten kompromisslose weder Narkose noch durch Constrain-induzierten Stress. Die Positionierung der Maus in das MobilheimKäfig ist schnell und nicht betäubt das Tier sogar vorübergehend erforderlich. Zweitens sorgt die Klima angehoben homecage die mechanische Stabilität, die nötig ist, um Änderungen in feinen neuronale Morphologie zu quantifizieren und Einzelzell-elektrophysiologische Aktivität in wach Tiere aufzunehmen. Schließlich wird das Mobil homecage Design kompakter im Vergleich zu der sphärischen Laufband, so dass die Positionierung des mobilen homecage unter einer Standard aufrechten Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung oder Patch-Clamp-Aufnahme in das Gehirn wach Maus. Firm Kopf-Fixierung in der mobilen homecage erfordert die Implantation einer speziell entwickelten vierflügelige Metallhalter, mit einer runden Öffnung in der Mitte für optischen oder elektrischen Zugriff auf die zugrunde liegenden Hirnregion. Diese Metallhalter sind an dem Schädel mittels einer Kombination von Klebstoff, Dentalzement und einer kleinen Schraube in den Schädelknochen eingeschraubt angebracht. Dieses chirurgische Verfahren wurde auf der Grundlage einer großen Anzahl von zuvor entwickeltenveröffentlichten Verfahren, und es zeigte sich in einer stabilen und reproduzierbaren Herstellung Schädel Fenster führen. Für in vivo elektrophysiologischen Experimenten eine mondförmige Fenster 34, einer kleinen Größe Kraniotomie (weniger als 0,5 mm) 32 und einem gebohrten glasüberzogene Zubereitung 35 verwendet worden. Hier wurde die &quot;umgekehrte&quot; Schädel Fenster entweder mit einem großen (3,5 mm Durchmesser) oder klein (weniger als 0,5 mm Durchmesser) Kraniotomie implantiert. Minimierung Gehirn Bewegung ist wichtig für stabile Einzelzellableitungen, weshalb es ratsam ist, kleine Größe Kraniotomien für elektrophysiologische Experimente durchzuführen. Nach der Implantation des Schädelfenster für optische Abbildungsexperimente werden die Tiere ließ man mindestens 2 oder 3 Wochen, während dessen die ersten Fenster vorübergehend seine Transparenz verliert und gewinnt es (mit einer Ausbeute von 50-70%, abhängig von erholen der genetische Hintergrund des Mausstamm). Transparenz der Schädelfenster und stabilkeit des Zahnzement &quot;cap&quot; zum Schädel angebracht werden mittels eines regulären Binokular und physikalische Inspektion während der Tierbehandlung überprüft werden. Am Ende der 2-3 wöchigen Erholungsphase sollten diese Tiere, die keine Anzeichen von Rest post-operative Entzündungen oder mechanische Defekte im Zahnzement zeigen aus den Experimenten ausgeschlossen und beendet werden. Das optimale Alter zum Starten der Ausbildung der Mäuse 2-4 Monate (entsprechend dem Körpergewicht 20-40 g). Bei jüngeren Tieren kann Verankerung des Dentalzement &quot;cap&quot; zum Schädel unzuverlässig sein, die ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischen Belastungen, die durch die Fortbewegung des Kopfes fest Maus in der Mobil homecage auferlegt wird erschwert. Obwohl die männlichen und weiblichen Mäusen gleichermaßen bereit sind, in mobilen homecage navigieren erscheinen, gibt es eine Tendenz zur besseren Prozentsatz der Schädelfenster der Wiedererlangung ihrer Transparenz bei weiblichen Mäusen (Daten nicht gezeigt) zu erreichen. Daher, um to eine ausgewogene Mischung von Geschlechtern in der Kohorte von Tieren für die Bildgebung ausgewählt, Implantation Schädelfenster in etwa 30% mehr männliche Mäuse empfohlen. Soziale Interaktionen sind bekannt für das Wohlbefinden der Tiere zu verbessern und Stress zu reduzieren, daher ist es ratsam, dass Wurf betrieben und parallel geschult und in Gruppenhaltung Käfige zusammengehalten. Im Gegensatz zu den für den Kugellaufband Vorbereitung 13 veröffentlichten Verfahren, wird die Methode unter Verwendung der mobilen homecage nicht verlangen, Anästhesie der Maus im Moment der Kopf-Fixierung. Dieser Unterschied ist wichtig, weil es um jegliche Restwirkungen, die sogar eine kurze und &quot;Licht&quot; Anästhesie Episode ist wahrscheinlich auf die physiologischen Messungen kurz nach erhalten haben. In der Tat, auch wenn in den Studien, in denen Kopf-Fixierung wurde unter Vollnarkose durchgeführt und die eigentlichen Experimente wurden nach einer kurzen Wartezeit 13 gestartet, kann man nichtauszuschließen, mögliche langfristige Auswirkungen des kurzen Narkose Episode auf den experimentellen Daten. Andere Studien haben auf Wasserentzug für die systematische Gewöhnung der Tiere, um die Fixierung Kopf verlassen und zur Belohnung Wasser als Mittel der Motivation, das Tier unbeweglich 36 zu bleiben. Jedoch begrenzt der Lohn-basierte Kopffixierungsmethode der Wahl des anwendbaren Verhaltenstests und, besonders wichtig, ist in einem der etablierten Stimulus-Belohnung Verbände. Im Gegensatz dazu ist die Methode der Maus Gewöhnung an Fixierung in mobilen homecage Kopf nicht verlangen, Wasserentzug und die anschließende Belohnung. Ergänzung der mobilen homecage mit einem Wasserzufuhrsystem für lang anhaltende Experimente empfohlen. Die Tiertrainingseinheiten und Experimente vorgestellt wurden hier während der Tageszeit (von 08.00 Uhr bis 18.00 Uhr), die physiologisch passive Zeit für die Mäuse, die unter dem Standard-12-Stunden-Lichtplan (li gehalten werden, entspricht getanGHTS auf 6 Uhr und ab 6 Uhr). Da die Wasseraufnahme wird direkt mit der Maus die Aktivität zugeordnet ist, während der passive Zeitraum Mäuse benötigen keine Wasserabgabe, wenn die Dauer eines Ausbildungs ​​/ Imaging / Aufnahme-Session hat 2 Stunden nicht überschreiten. Neben der Zeitpunkt und die Dauer der Trainingseinheiten, muss man die Frage nach der optimalen Anzahl der Sitzungen für Gewöhnung der Tiere an mobile homecage gewünschte Adresse. Zu diesem Zweck wurden zwei Kriterien, die zur Belastung durch den Kopf der Fixierung induzierten zu bewerten: i) Gewichtsverlust, und ii) die Bewegungsaktivität Niveau. Wie in Abbildung 6 dargestellt, Gewichtsverlust erreicht das durchschnittliche Niveau von 6% auf die Ausbildung Tag 2, und ist vollständig von Trainingstag 4 (6A) umgekehrt. Im Einklang mit der Dynamik wiegen, wird die Bewegungsaktivität Niveau der kopffesten Tiere am ersten Tag der Ausbildung unterdrückt, sondern stabilisiert durch Training Tag 4 (6D). Basierend auf diesen Messungen Anregungen wirt, die die minimale Dauer der Maus Ausbildungszeit auf mobilen homecage beträgt 4 Tage, wie im Protokoll hiermit beschrieben. Die Nutzung der Klima angehoben, Flachboden Mobil homecage erlaubt das Hinzufügen von komplexen Aufgaben (sensomotorische, Wahrnehmungs-und kognitiven) zu den Trainings Paradigmen für Kopf-fixierten Mäusen. In der vorliegenden Studie zwei Protokolle von Verhaltenstests werden vorgestellt. Beide Protokolle nutzen Geruch Cues und kann mit Längs Imaging / Aufnahmen in der Maus Kortex kombiniert werden. Obwohl die mobile homecage aus nicht-absorbierende Materialien hergestellt, noch muss man Berücksichtigung möglicher Interferenzen zwischen dem Geruch von dem Gerät und Test Geruch (s) zu nehmen. Ein weiterer Faktor, mit optisch / taktile Signale einer Verhaltens Experiment stören kann, ist die Verbindungsstelle zwischen der Wand und dem Einsatz, die nicht nahtlos und kann daher von dem Tier als Wahrzeichen wahrgenommen werden. Bemerkenswert ist hier, dass, um Tier Kummer während solcher inte minimierenrventions die Platzierung eines Geruchs-präsentierenden Baumwolle auf das mobile homecage Wand, sollte der Experimentator üben, um solche Interventionen so schnell wie möglich durchzuführen und längeren Umgang mit dem Kohlenstoffkäfig. Alternative Strategien für neuartige Geruch / Objektpräsentation sind denkbar, z. B. indem Hydrogel-basierte Lösung, Tropfen oder Objekte (z. B. Futterchips) auf kleine Regale an der inneren Oberfläche des Kohlenstoffkäfigwand auf der Höhe mit Kopf Positionierung des Tieres kompatibel angebracht. Mobil homecage ermöglicht kopffesten Tiere eine breite Palette von zweidimensionalen Bewegungen einschließlich horizontaler Fortbewegung, situp, Pflege, Rühren, lecken, Nasen-Stossen, Fachvorderpfote Bewegungen und Wand berühren mit Vorderbeine, wie in der vorliegenden Studie dargestellt, um durchzuführen . Mit mobilen homecage und die Protokolle hier vorge können die Forscher die sensomotorische neuronale System mit einem hohen Maß an Kontrolle über sowohl die Stimulation Zustand studierens und die Verhaltens Lese-Outs. Darüber hinaus können Studien der kognitiven Fähigkeiten bei wachen Mäusen während Anlage, räumlichen Navigation und Entscheidungsaufgaben durchgeführt werden. Es gibt mehrere praktische Beschränkungen dieses Verfahrens. Zunächst wird eine erhebliche Menge an Druckluft benötigt, um die homecage Hebekraft zu erzielen und dauerhafte Experimente durchzuführen. Zweitens die Mobil homecage in ihrer gegenwärtigen Umsetzung nur 18 cm im Durchmesser und eine relativ kleine und einfache Raum im Vergleich zu der virtuellen Realität, wobei eine komplexe Versuchsumgebung ohne räumliche Einschränkungen gestaltet werden daher. Drittens, während Whisker Stimulation und Belohnung basierte hier vorgestellten, wurde ein Gerät verwendet, das die Möglichkeit der Wandkontakt für die Maus beschränkt. Hinzufügen eines externen optischen oder sensorischen Stimulationskanal (z. B. ein Auge gerichteten Lichtprojektor), würde die Gestaltung eine ergonomische und kompakte Vorrichtung im Vergleich zu benötigendie Mehrfachbild-oder Dome-Projektionslösungen, die in der Kugellaufexperimente verwendet wurden. Zusammenfassend ist die Nutzung der kopffesten Mäuse sich in die Luft gehoben Handy-homecage erleichtert die Studien, die Zell-, Molekular-und Verhaltensebene der Beobachtung und Manipulation in einem einzigen Experiment zu kombinieren. Hier dargestellten speziellen Anwendungen gehören Zwei-Photonen-mikroskopisch visuelle Darstellung, intrinsischen optischen Signal Imaging und Patch-Clamp-Aufnahmen in nicht-narkotisierten Mäusen verhalten. Es wird erwartet, dass dieser Ansatz neue Horizonte in der Experimente an wach, verhalten Maus öffnen und dienen als nützliche Werkzeug für die Medikamentenentwicklung und Grundlagenforschung der Gehirnfunktion.

Ein spannender neuer Trend in den Neurowissenschaften ist es, experimentelle Ansätze für die molekulare und zelluläre Untersuchung der neuronalen Netzwerke im Gehirn wach, verhalten Nagetiere zu entwickeln. Solche Ansätze halten versprechen, neues Licht auf die neurophysiologischen Prozesse, die motorische Funktion, sensomotorische Integration, Wahrnehmung, Lernen, Gedächtnis, sowie Verletzungen Progression, Neurodegeneration und genetische Krankheiten zugrunde liegen, zu vergießen. Darüber hinaus die Aufnahme von wachen Tier Gehirn hält Versprechen in der Entwicklung von neuen therapeutischen Mittel und Behandlungen. Es gibt ein wachsendes Bewusstsein, dass der Anästhesie, die üblicherweise in der neurophysiologischen Experimenten verwendet wurde, können die grundlegenden Mechanismen der Hirnfunktion beeinflussen, möglicherweise zu einer fehlerhaften Interpretation von experimentellen Ergebnissen führt. So die weit verbreitete Betäubungsmittel Ketamin schnell zu Bildung neuer dendritischen Dornen und verbessert die synaptische Funktion 1; weitere häufig verwendet anesthetic Isofluran-Narkose bei chirurgischen Ebenen komplett unterdrückt spontane kortikale Aktivität bei neugeborenen Ratten und Blöcke Spindel-Burst-Schwingungen in zwei erwachsenen Tieren. Derzeit wird nur eine begrenzte Anzahl von Ansätzen ermöglichen Experimente in nicht narkotisierten Mäusen durch Zwei-Photonen-mikroskopische Bildgebung oder Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Ansätze können in frei beweglichen Kopf und fixierte Präparate aufgeteilt werden. Die einzigartige Attraktivität eines frei beweglichen Tier Zubereitung besteht darin, dass die Bewertung natürlicher Verhalten, einschließlich Ganzkörperbewegungen während der Fahrt. Ein Weg, um Bild im Gehirn eines sich frei bewegenden Nagetier ist ein miniaturisiertes Head-Mounted-Mikroskop oder Endoskop 3-5 befestigen. Miniaturisierte Vorrichtungen neigen jedoch dazu, begrenzte optische Leistung im Vergleich zur Ziel-basierten Zwei-Photonen-Mikroskopie haben, und können nicht leicht mit Ganzzell-Patch-Clamp-6 kombiniert werden. Die ExiStachel-Lösungen für Kopf-Fixierung einer wach Nager wurden in erster Linie entweder auf physische Zurückhaltung 7,8 oder auf die Ausbildung der Tier freiwillige Kopfstütze 9 aufweisen verlassen. Ein weiterer beliebter Ansatz ist es, das Tier Gliedmaßen, indem Sie es auf, z. B. eine Kugellaufband 10 zu bewegen; Dieser Ansatz wird häufig mit rechnergenerierten virtuellen Realität kombiniert. Elektrophysiologische Experimente am Kopf fest Mäusen haben meist verwendet, extrazelluläre Ableitungen und wurden zur zentralen Regulierung der Herz-Kreislauf-Funktion 11, Auswirkungen der Narkose auf die neuronale Aktivität 12, die auditive Reaktion im Hirnstamm 13 und 14 Informationsverarbeitung zu untersuchen. Die bahnbrechenden intrazellulären / Ganzzellableitungen an wachen verhalten Tiere wurden in den 2000er Jahren durchgeführt und haben sich auf die neuronale Aktivität, die Wahrnehmung und Bewegung 15-20 bezogenen konzentriert. Etwa zur gleichen Zeit wurden die ersten Studien zur mikroskopischen Abbildung wach Mäuse veröfeingesetzten Ausschusses, in der zwei-Photonen-Mikroskopie wurde in der sensorischen Kortex von Ratten physisch zurückhaltend 7 und an Mäusen auf einer Kugellaufband 21 läuft eingesetzt. Nachfolgende in vivo Mikroskopie und elektrophysiologischen Studien gezeigt, dass eine Kopffixierung Vorbereitung erfolgreich mit Verhaltensparadigmen basierend auf Vordergliedmaße Bewegungen, Geruchserkennung, Rühren, und leckt 8,22-25 kombiniert werden. Mäuse auf der Kugellaufband gelegt trainiert werden kann, um die virtuelle visuelle Umgebung von einem Computer generiert 10,26 navigieren. Die intrazelluläre / ​​extrazellulären Aufnahmen gezeigt, dass in einem Kopf-fixierten Tier Navigation wie virtuelle Umgebung, die Aktivierung von Hippocampus-Ortszellen nachgewiesen werden 27. In einer virtuellen visuellen Umgebung, Mäuse zeigen normale bewegungsbezogenen Theta-Rhythmus in der lokalen Feldpotential-und Theta-Phasen-Präzession während der aktiven Bewegung 27. Vor kurzem hat die räumliche und zeitliche activity Muster neuronaler Populationen wurden optisch in Mäusen während der Arbeitsspeicher Entscheidungsaufgaben in einer virtuellen Umgebung 28 aufgezeichnet. Trotz Durchbruch Forschungs aktiviert ist, hat die sphärische Laufband Design einige inhärente Einschränkungen. Zuerst wird das Tier benötigt, um auf einer unbegrenzten Oberfläche einer rotierenden Luft angehoben Ball, der keine greifbaren Hindernisse wie Wände oder Barrieren stellt bewegen. Diese Einschränkung ist nur zum Teil durch die computergenerierten &quot;Virtual Reality&quot; kompensiert werden, weil visuelle Eingabe ist wohl weniger effektiv an Mäusen und Ratten im Vergleich zur taktilen Sinnes (zB Whisker-touch oder lecken), die diese Arten natürlich verlassen auf. Zweitens kann die beträchtliche Krümmung der Kugeloberfläche unangenehm für den Labormäusen zu Fuß auf einem flachen Boden in ihren Käfigen verwendet wird. Schließlich ist die bloße Durchmesser der Kugel (mindestens 200 mm für Mäuse und 300 mm für Ratten) macht die vertikale Größe der sphärischenLaufband-Gerät relativ groß. Dies macht es schwierig, Kugellaufband mit den meisten handelsüblichen Mikroskopie-Setups zu kombinieren, und erfordert oft eine neue Einrichtung rund um das Laufband durch maßgeschneiderte Mikroskop Frames. Hier wird eine neue Methode beschrieben, bei dem ein Kopf-Fest Maus kann um eine Luft-Mobil homecage angehoben, die einen flachen Boden und Wände bietet greifbare bewegen, und erkunden Sie die physische Umgebung unter stressfreien Bedingungen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der Maus Ausbildung und Kopf-Fixierung und liefert repräsentative Beispiele, wo Zwei-Photonen-Mikroskopie, intrinsischen optischen Bildgebung und Patch-Clamp-Aufnahmen werden im Gehirn von Mäusen durchgeführt wach verhalten.

<table><tbody><tr><td>Pinzette, Edelstahl, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Tiertrimmer, Rasiermaschine</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Binokularmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Biologischer Temperaturregler mit Edelstahl-Heizkissen</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe mikrochirurgische Klinge</td><td>BD</td><td>REF </td><td></td>374769</tr><tr><td>Borosilikatrohr mit Filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Für die Herstellung von Patch-Pipetten</td></tr><tr><td>Kamera&nbsp;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>Nachtsichtbarkeit</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl Tierarzt</td><td></td></tr><tr><td>Zahnzement</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon Tierarzt</td><td></td></tr><tr><td>Einwegbohrer</td><td>Meisinger</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco ' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Augen-Gleitmittel</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td>Zum Schutz der Augen während der Operation und als Viskoselösung zum Eintauchen&nbsp;</td></tr><tr><td>Vorhausbohrer-Steuerung</td><td>Vorhaus&nbsp;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Foredom Mikromotor-Handstück</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Vierflügeliger Metallhalter</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kopfhalter für Mäuse</td><td>Narishige</td><td>SG-4N</td><td>Montiert auf stereotaktischem Instrument</td></tr><tr><td>Hämostase Kollagen Schwamm</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol Tierarzt</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp;</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Abrichtzange, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td>Vertikaler Abzieher für die Herstellung von Glaspipetten</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Bolzen</td><td>Centrostyle</td><td>Ref. 00343 s/Stahl M1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>Mobilheim Käfig</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Laser Scanning Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Vliestupfer, 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Chirurgische Tampons</td></tr><tr><td>Polyacrylkleber</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Rundglas Deckglas</td><td>Elektronenmikroskopie 1.5</td><td></td><td> Dicke</td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument für Kleintiere</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Student Iris Schere, gerade 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

flach platt klima angehoben plattform: eine neue methode zur kombination von verhalten mit mikroskopie oder elektrophysiologie auf awake frei bewegen nagetiere

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Es ist allgemein anerkannt, dass die Verwendung der Vollnarkose kann die Relevanz der aus einem lebenden Tier Gehirn erhalten oder elektromikroskopische Daten zu untergraben. Darüber hinaus ist die lange aus der Narkose begrenzt die Häufigkeit wiederholter Aufnahme / Bild Episoden in Längsschnittstudien. Daher sind neue Methoden, die stabile Aufnahmen von nicht-narkotisierten Mäusen Verhaltensweisen erlauben würde erwartet, dass die Felder von Mobilfunk-und kognitiven Neurowissenschaften zu fördern. Bestehende Lösungen reichen von der bloßen körperlichen Zwanges, um anspruchsvollere Ansätze wie Linear-und Kugellaufbänder in Kombination mit computergenerierten virtuellen Realität eingesetzt. Hier wird eine neue Methode beschrieben, bei dem ein Kopf-Fest Maus kann um eine Klima angehoben Mobil homecage bewegen und erkunden Sie die Umgebung unter stressfreien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Verhaltenstests (zB Lernen, Gewöhnung oder neuartige Objekterkennung) gleichzeitig mit führenZwei-Photonen-mikroskopische Bildgebung und / oder Patch-Clamp-Aufzeichnungen, die alle in einem einzigen Experiment kombiniert. Dieses Video-Artikel beschreibt die Verwendung des wachen Tier Kopf-Fixierung Gerät (Mobil homecage), zeigt die Verfahren der Tier Gewöhnung, und veranschaulicht eine Reihe von möglichen Anwendungen des Verfahrens.

Die hier vorgestellte Methode wird für die mikroskopische Bildgebung oder Einzelzellelektrophysiologischen Ableitungen an wachen, kopffesten, aber ansonsten frei bewegen und verhalten Mäusen bestimmt. Das Tier kann in zwei Dimensionen in einer realen (im Gegensatz zu virtuellen), Sachanlagen und vertrauten Umgebung, zu bewegen, während Schädel der Tiere ist fest mit dem Kopffixierung Arm fixiert. Gewöhnung der Mäuse in die Luft gehoben-Mobil homecage besteht aus 4-6 Tagen zweimal täglich 2-Stunden-Trainingseinheiten (Abbildung 1). Die ausgebildeten Tiere können dann in den Experimenten sofort verwendet werden. Eine typische Studie umfasst eine Anzahl von Bilderzeugungseinheiten oder Patch-Clamp-Aufnahmen, die in Abständen von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen voneinander beabstandet sind. Wichtig ist, optische und elektrophysiologische Aufzeichnungen gleichzeitig mit kognitiven und Verhaltens Stimuli und Anzeigen in einem einzigen Experiment durchgeführt werden. Um die mechanische Stabilität zu beurteilenMauskopf-Fixierung in der mobilen homecage wurden die Bildsequenzen der kortikalen Gefäße mit fluoreszierenden konjugierten Dextran und der kortikalen Dendriten ausdrücken YFP markierten gesammelt, während die Versuchstiere wurden die Navigation im mobilen homecage (Abbildung 2). Die maximalen Verschiebungen des Gehirns während der Fortbewegung des Tieres nicht überschreiten typischerweise 1-1,5 Mikrometer. Diese Verschiebungen aufgetreten in den horizontalen Richtungen und sehr selten in einem detektierbaren Verschiebung der Abbildungsebene resultiert, überflüssig macht eine Korrektur von Bewegungsartefakten. Stabile Kopf-Fixierung in der mobilen homecage ermöglicht die Quantifizierung der einzelnen dendritischen Dornen an wachen Tieren mit der gleichen Zuverlässigkeit wie bei narkotisierten Mäusen. Dichte dendritischer Fortsätze, Morphologie und den Umsatz während Langzeitstudien mit mehreren Bilderzeugungseinheiten in Abständen von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen durchgeführt überwacht werden. Die Benutzerfreundlichkeit des mi) Zwei-Photonen-Mikroskopie auf den Thy1-GCaMP3 transgenen Mäusen und ii) intrinsischen optischen Signal Bildgebung in Wildtyp-Mäusen: obil homecage für funktionelle optische Bildgebung wurde in somatosensorischen Kortex von Mäusen wach mit zwei Ansätze getestet. Ca 2 +-Imaging wurde in der Schicht 2/3, die Zellkörper der Neuronen viele fluoreszierend markierten, sowie deren Dendriten und Axone (Fig. 3) enthält, durchgeführt. Die Grundstücke der Fluoreszenz-über-Zeit aus ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) sind in Abbildung 3 dargestellt ist, zeigen spontane neuronale Aktivität (gemessen als vorübergehende Erhöhung des GCaMP3 Fluoreszenz) bei aktiver Navigation der Maus die in der mobilen homecage. Die optische Bildgebung basierend auf intrinsische Signale ermöglicht die Abbildung der räumlichen Verteilung der funktionellen Domänen. Abbildung 4 zeigt wellenförmige Veränderungen des Blutsauerstoffpegel (an die regionale neuronale Aktivierung), die entlang somatosensorischen Kortex in Reaktion auf v propagiertibrissa Stimulation bei einer Frequenz von 0,05 Hz liegt. Um Machbarkeit der Patch-Clamp-Aufnahmen mit mobilen homecage zu testen, verwendeten wir 2-3 Monate alten C57BL/6J-Mäusen. Layer 2/3 Neuronen im somatosensorischen Kortex wurden in Ganzzellkonfiguration mit Stromzange-Modus aufgenommen. Patch-Clamp-Aufnahme im Gehirn von Mäusen wach Kopf fest auf mobilen homecage im Wesentlichen der Patch-Clamp in Hirnschnitten blenden. Etwa 50% der Versuche führte zu erfolgreichen Gigaseal Bildung, von denen mehr als 70% ergab stabile Gesamtzellkonfiguration Aufnahme. Vorgänge von Giga Kontaktverluste durch mechanische Verschiebung der Zellen beobachtet. Abbildung 5 zeigt eine 60-Sekunden-Fragment einer repräsentativen 10-Minuten-langen Strom-Clamp-Aufzeichnung mit Episoden von aktiv (Laufen) Maus und passive (Ruhe-) Staaten korreliert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src='"/' files width='"600"'> Abbildung 1. Verfahren Kopf-Fixierung von wachen Mäusen in der mobilen homecage. A) Übersicht über die Klima angehoben homecage Mobildesign und Illustrationen der allgemeinen Konzept. B) Schematische Darstellung eines typischen Versuchszeitleiste. Die Untersuchung beginnt mit der Implantation des Schädelfenster zwei Wochen vor der Gewöhnung die Maus, um die Handhabung und die Verpackung, die durch acht zweimal täglichen Training folgt. Die typische Studie umfasst eine Anzahl von Abbildungseinheiten oder Patch-Clamp-Aufnahmen, die in Abständen von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen voneinander beabstandet sind. Beide optische und elektrophysiologische Messungen können parallel mit kognitiven oder Verhaltens Reize und Anzeigen in einem einzigen Experiment durchgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Beispiel der Zweiphotonen mikroskopische Bildgebung am wachen Mäusen bewegen das Mobil homecage. A, B) Kortikale Gefäßsystem, mit dem 70 kDa-Texas Red-konjugiertem Dextran markiert. Der Durchmesser der einzelnen Gefäßsegmente wird durch Auftragen im Laufe der Zeit den Verlauf der über das Gefäßlumen während Perioden der Ruhe-und der Maus ausgeführt (A) gezogenen Linien gemessen. Die Rate der Blutfluss in Arterien und Venen wird durch Zeilenabtastung entlang der parallel zur Gefäßwand (B). C, D) Feine Details der neuronalen Morphologie im Gehirn von transgenen Mäusen, die visualisiert YFP in Subpopulation der Ausdruck gezeichneten Linien gemessen Neuronen unter der Thy1-Promotors. Dreidimensionale Rekonstruktion der Pyramidenzellen in der Maus den somatosensorischen Kortex (C). Die Bilder eines dendritischen bRanch in einem wach, verhalten Maus erworben werden, für die Quantifizierung der einzelnen dendritischen Dorn Morphologie (D). E) Quantifizierung von Hirn Bewegung durch Mausbewegungen verursacht ausreichend stabil. Größere Verschiebungen Amplitude korrelieren mit Perioden von der Maus die Lauf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600"> Abbildung 3. Beispiel der neuronalen Aktivität in Bevölkerung wach Thy1-GCaMP3 Maus bewegt, um den mobilen homecage. A) Zwei-Photonen-Bild der kortikalen Schicht II / III-Neuronen. ROIs, zum Beispiel neuronale Zellkörper, Dendriten und Axone sind gelb. B) gezeigt AF / F Spuren der GCaMP3 Fluoreszenz von ROIs in A gezeigt (Zeit series bei 1,5 Sekunden / Bild aufgenommen). C) Zoom-In Bereich auf 65 ms / Frame abgebildet. D) Fluoreszenz von gelb ROIs in C über der Zeit aufgetragen, zeigt die vorübergehende Erhöhungen (rot) in der GCaMP3 Fluoreszenz, die an der Aktion entsprechen Potenzial-induzierte Ca 2 +-Einstrom Episoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600"> 4. Beispiel Abbilden der räumlichen Verteilung der funktionellen Antworten im Kortex einer wachen Maus durch Abbilden der intrinsischen optischen Signale. A) Hellfeld-Blick auf die oberflächlichen Blutgefäße durch die Schädelfenster. B) Magnitude Karte von der Baseline-Aktivität in der mobilen homecage während eines 6-Minuten-Episode. C) Magnitude Karte neuronaler Aktivität entlang somatosensorischen Kortex in Reaktion auf die vibrissa Stimulation mit einer Frequenz von 0,05 Hz ausbreitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600"> 5. Beispiel der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung in der Rinde einer wachen Maus bewegen das Mobil homecage. A) Strom-Clamp-Aufzeichnung von einem Neuron in der Maus Rindenschicht 2/3. Eine 0,5 sec, 100 pA Strominjektion (unterhalb der Spur angegeben) resultiert in einem Burst von Aktionspotentialen. Die Zelle zeigte Spike Frequenzanpassung charakteristisch für Pyramidenzellen. B) Dauerstrom-Clamp-Aufzeichnungaus dem gleichen Neuron mit der Maus 'Bewegungsaktivität (in rosa über der Kurve dargestellt) korreliert. Repräsentative spontane Aktivität der Schicht 2/3 Neuron in Zeiten der Maus ruhen (C) und Laufen (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600"> Abbildung 6. Tiergewichtsverlust und Bewegungsaktivität von head-fixed/non-fixed Mäusen während der Trainingseinheiten in der Mobil homecage. A) Tiergewicht (Mittelwert + SD,%) vor dem Training. Beachten Sie, dass die Gewichtsabnahme wird vollständig von der 8.7-ten Trainingseinheit. B) Flugbahn der horizontalen Fortbewegung bezogen auf die mobile homecage der Maus die umgekehrt,die von der verfolgten Bewegung der mobilen homecage während 8. Trainingseinheit. C) Raupenbewegungen eines nicht-Kopf-Fest Maus Erkundung der runden Käfig während der 8. Trainingseinheit. D) Dauer der Kopf fixiert (Kreis) hochgerechnet wurde und nicht fest (Dreieck) Mäuse Bewegung während 1-4 th Tag der Ausbildung (Mittelwert + SD,%). Beachten Sie, dass an Tag 4, zeigen kopffesten Mäusen weder Einfrieren (wie am 1. Tag), noch übermäßige Bewegungsaktivität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Diese Methode erstellt eine greifbare, vertraute Umgebung für die Maus zu navigieren und zu erkunden während der mikroskopischen Abbildung oder Einzelzellelektrophysiologischen Ableitungen, die feste Fixierung des Kopfes des Tieres verlangen.

Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Hallo, ich bin Hel Lin, ein Postgraduierter am Near Science Center der Universität Helsinki. Heute zeigen meine Kollegen und ich, wie man optische und elektrophysiologische Ableitungen bei wachenden Köpfen fixierten, ansonsten aber frei bewegenden und verhaltenen Tieren durchführen kann. Unsere Methode schafft eine greifbare, vertraute Umgebung, in der die Maus navigieren und die sie erkunden kann.Bei der mikroskopischen Bildgebung oder elektrophysiologischen Einzelzellaufnahmen, die eine feste Fixierung des Tierkopfes erfordern, implantieren wir ein chronisches Schädelfenster und gewöhnen die Maus an einen lufttransportierten Wohnmobilkäfig, der unter den Füßen des Tieres hindurchgleitet. Während der Fortbewegung auf einer ebenen Fläche kann der Wohnmobilkäfig unter einem aufrechten Standardmikroskop für die Zwei-Photonen-Bildgebung positioniert oder in eine Elektrophysiologie gestellt werden, die für Patch-Clamp-Aufzeichnungen in einem wachen Mausgehirn eingerichtet ist. Alle hier vorgestellten experimentellen Verfahren wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt.Wir implantieren Schädelfenster nach veröffentlichten Protokollen mit geringfügigen Änderungen bei der Implantation von Schädelfenstern. Während dieser Erholungsphase darf sich das Tier mindestens zwei bis drei Wochen lang erholen, das Fenster erhält in der Regel seine Transparenz zurück. Tiere mit Anzeichen einer verbleibenden postoperativen Entzündung werden von den Versuchen ausgeschlossen.Trainieren Sie die für eine Studie ausgewählten Tiere, um sie an die Kopffixierung zu gewöhnen. Behandeln Sie die Maus im Wohnmobilkäfig fünf bis 10 Minuten lang ruhig, vermeiden Sie abrupte Bewegungen und Geräusche und bringen Sie sie dann wieder in den Heimkäfig zurück. Wiederholen Sie den Vorgang zwei- bis dreimal in ungleichen Abständen.Der Mobilkäfig ermöglicht die Fixierung des Kopfes, ohne das Tier vor der Kopffixierung zu betäuben. Verwenden Sie einen Lappen, um die Maus zwei- oder dreimal in ungleichen Abständen einzuwickeln. Achten Sie darauf, dass das Tier ruhig bleibt, während es eingewickelt ist.Andernfalls wiederholen Sie den Vorgang, bis sich die Maus vollständig daran gewöhnt hat. Beginnen Sie das zweimal tägliche Training der Mäuse auf dem Wohnmobilkäfig am nächsten Tag, nachdem die Handhabung abgeschlossen ist. Wiegen Sie die Tiere vor jeder Trainingseinheit.Tiere, die einen Gewichtsverlust von mehr als 10 % aufweisen, sollten von der Studie ausgeschlossen werden. Passen Sie die Position des Kopffixierarms an die Größe des trainierten Tieres an. Verbinden Sie den Lufteinlass des Käfiggeräts für Wohnmobile mit dem Standard-Druckluftauslass für Labors.Stellen Sie sicher, dass der Luftdruck für einen freien Auftrieb des luftgehobenen Heimkäfigs ausreicht. Beginnen Sie mit dem Training von gewöhnten Tieren im Wohnmobilkäfig. Lege die Maus ruhig, indem du sie in den Lappen einwickelst.Setzen Sie die am Kopf des Tieres befestigte Metallhalterung in den Kopffixierarm ein und fixieren Sie sie fest, indem Sie die Schrauben festziehen. Schalten Sie den Luftstrom ein, um den lufttransportierten Heimkäfig zum Schweben zu bringen. Entfernen Sie den Lappen und lassen Sie die Maus den Käfig zu Hause erkunden.Während der ersten Trainingseinheit können Mäuse ein Erstarrungs- und Zitterverhalten sowie eine Schwanzaufrichtung zeigen. Um das Tier an Lärm zu gewöhnen, sorgen Sie dafür, dass es während aller Trainingseinheiten sowie während der Versuche ständig Umgebungsgeräuschen ausgesetzt ist, z. B. durch eine Radioübersetzung oder aufgezeichnete Musik und Sprache. Um chronischen Stress zu vermeiden, verwenden Sie in der ersten Stunde der Trainingseinheit helles Licht.Führen Sie nach der ersten Stunde das Training im Dunkeln durch und verwenden Sie eine Nahinfrarotkamera, um das Verhalten des Tieres zu überwachen. Wenn die Trainingseinheit beendet ist, lösen Sie das Tier aus dem Kopffixierungsarm, indem Sie die Schrauben lösen. Bringen Sie das Tier für mindestens zwei Stunden vor der nächsten Trainingseinheit in den Heimkäfig zurück.Wenn Sie die Maus mit zwei oder mehr anderen Mäusen in einem Käfig halten, verringert sich der Stresspegel. Optional können Sie den Luftkäfig zusammen mit dem Tier in seinem Heimatkäfig platzieren. Dies wird die Umgebung bereichern und kann die Unterbringung des Tieres im Käfig des Wohnmobils verstärken.Während der letzten Trainingseinheit sind Mäuse an die Kopffixierung gewöhnt und sollten ein stressfreies Verhalten zeigen, indem sie ruhig um den lufttransportierten Heimkäfig navigieren. In Abwesenheit von sichtbarem Licht kann die Bewegungsbahn der Maus verfolgt werden, indem die Bewegungen des Käfigs mit einer Nahinfrarotkamera oder mit einer optischen Computermaus überwacht werden. Bei längeren Trainingseinheiten, die länger als ein oder zwei Stunden dauern, sollten Sie in Erwägung ziehen, der Maus Trinkwasser zu geben, entweder manuell oder mit einem Pipettenhalter, der am Käfigrahmen des Wohnmobils befestigt ist.Das folgende Diagramm fasst den zeitlichen Ablauf einer typischen experimentellen Studie zusammen. Die Studie beginnt mit der Implantation des Schädelfensters zwei Wochen vor dem Umgang mit der Maus und wird mit acht zweimal täglichen Trainingseinheiten fortgesetzt. Die typische Studie umfasst eine Reihe von bildgebenden Sitzungen oder Patch-Clamp-Aufnahmesitzungen, die in einem Abstand von wenigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen durchgeführt werden.Sowohl optische als auch elektrophysiologische Experimente können parallel zu kognitiven oder verhaltensbezogenen Reizen und Auslesungen durchgeführt werden. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist eine einzigartige nichtlineare optische Technologie, die die Echtzeit-Visualisierung zellulärer und sogar subzellulärer Strukturen in tiefen kortikalen Schichten des Gehirns eines Nagetiers ermöglicht. Um ein mikroskopisches Bildgebungsexperiment mit zwei Photonen durchzuführen, setzen Sie ein trainiertes Tier in den Käfig des Wohnmobils und stellen Sie die Stopper ein, um die Mikroskopoptik vor versehentlicher Beschädigung zu schützen.Reinigen Sie das Deckglas des Schädelfensters, um Staubpartikel zu entfernen. Tropfen Sie eine Tauchflüssigkeit auf das Deckglas. Wir empfehlen die Verwendung von Viskuslösung, da Wasser schnell verdunstet.Die Plattform kann unter Verwendung des Weitfeldmodus des Fluoreszenzmikroskops und eines Langpass-Emissionsfilters auf einem typischen motorisierten optischen Tisch platziert werden. Beurteilen Sie das Gefäßsystem des Gehirns und wählen Sie eine Region von Interesse aus. Zur Bildgebung eines kortikalen Gefäßsystems, das in die Schwanzvene eines kopffesten und immobilisierten Tieres injiziert wird, wird ein 70 Kilo Dalton, Texas roter konjugierter Text Trans.Diese Bildsequenz zeigt eine Zeitrafferaufnahme von Schauplätzen und Arterien in der Hirnrinde einer sich verhaltenden Maus, während sie um den Käfig des Wohnmobils navigiert. Durch die Darstellung des Profils der Linien, die über das Gefäßlumen gezogen werden, kann man die Veränderungen des Gefäßdurchmessers und der Motilität einzelner Gefäßsegmente messen. Die Geschwindigkeit des Blutflusses in Arterien und Venen kann durch Abtastung entlang der parallel zur Gefäßwand gezogenen Linien gemessen werden. Fein.Details der Neuronenmorphologie können in transgenen Mäusen sichtbar gemacht werden, die YFP in der Subpopulation von Neuronen unter dem Taiwan-Promotor exprimieren. Diese beiden Zacks vergleichen die Bildstabilität zwischen narkotisierten und wachen Tieren. Das rechte Seitenteil zeigt Dendriten des Tieres, das mit einem Ketamin-Xylazin-Gemisch betäubt wurde.Während das linke Seitenteil ein Dendritenbild in einem wachen Tier zeigt, das um einen Wohnmobilkäfig herumläuft. Die individuelle Morphologie der Wirbelsäule bei wachen Tieren kann mit der gleichen Zuverlässigkeit und Präzision analysiert werden wie bei den anästhesierten Mäusen. Die Verschiebung des Gehirns beim Laufen von Tieren überschreitet in der Regel nicht ein bis eineinhalb Mikrometer.Diese Bewegungen erfolgen in horizontalen Richtungen und führen sehr selten zu einer Verschiebung der Abbildungsebene, die eine Korrektur von Bewegungsartefakten überflüssig macht. In den meisten Fällen ist die Fähigkeit, die neuronale Aktivität im wachen lebenden Gehirn chronisch zu überwachen, essentiell für das Verständnis der Organisation und Funktion des Nervensystems. Mit Hilfe der drei transgenen Mäuse von tie one G Camp bilden wir die spontane neuronale Aktivität der wachen Mäuse ab, die sich im Wohnmobilkäfig verhalten.Diese Zeitraffer-Bildsequenz zeigt repräsentative Beispiele für Kalziumspitzen in neuronalen Zellkörpern, Niten und Axonen. Die optische Bildgebung auf der Grundlage intrinsischer Signale ermöglicht die Kartierung der räumlichen Verteilung von Funktionsbereichen, um ein intrinsisches optisches Bildgebungsexperiment durchzuführen. Setzen Sie das trainierte Tier in den Heimkäfig, der unter dem Kameraobjektiv positioniert ist.Reinigen Sie das Deckglas von Staub. Geben Sie einen Tropfen Glycerin hinzu und bedecken Sie es mit einem fünf Millimeter runden Deckblatt. Optimieren Sie die Position einer Hochgeschwindigkeitskamera.Platzieren Sie einen Manipulator mit einem Luftblasrohr gegenüber der kontralateralen Schwingung. Verwenden Sie grüne Lichter, um die Schiffskarte abzubilden. Fokussieren Sie sich tiefer in die Hirnrinde, etwa 400 Mikrometer unterhalb der kortikalen Gefäße.Platzieren Sie einen Bandpassfilter vor der Kamera und beleuchten Sie den Kortex mit einem roten Licht. Lassen Sie die Maus mindestens 30 Minuten lang an die Plattform anpassen. Zeichnen Sie die Grundaktivität während einer sechsminütigen Episode auf.Stimulieren Sie die Vibration alle 10 Sekunden mit Luftstößen für einen Zeitraum von insgesamt sechs Minuten. Dieses Bild zeigt die neuronale Aktivität, die sich entlang des somatosensorischen Kortex als Reaktion auf eine Vibrationsstimulation mit einer Frequenz von 0,05 Hertz ausbreitet. Um elektrophysiologische Einzelzellaufnahmen durchzuführen, setzen Sie das trainierte Tier, dem ein umgekehrtes Schädelfenster implantiert wurde, in den Käfig des Wohnmobils.Entfernen Sie langsam und vorsichtig das Deckglas von der Metallhalterung. Frischen Sie den kortikalen Puffer auf und reinigen Sie das Schädelfenster mit einem hämostatischen Tampon von Ablagerungen. Platzieren Sie die Masseelektrode in den kortikalen Puffer.Füllen Sie die Pipette der Patch-Klemme mit intrazellulärer Lösung. Üben Sie mit einem motorisierten Mikromanipulator einen Überdruck auf die Aufnahmepipette aus, vertiefen Sie die Pipette in den Kortex und erhalten Sie einen Giga-Seal-Kontakt mit der interessierenden Zelle. Entfernen Sie nach der Aufnahme die Pipette, frischen Sie den kortikalen Puffer auf und schließen Sie das Schädelfenster, indem Sie ein Deckglas auf die Metallhalterung kleben.Die Verwendung eines lufttransportierten Heimkäfigs ermöglicht die Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie mit klassischen Verhaltensparadigmen wie Lernen, Rehabilitation oder angstbezogenem Verhalten. Der Geruchssinn ist ein wichtiger sensorischer Input für Mäuse und kann zur Stimulation in Gedächtnistests und zur Beurteilung der Reaktion auf Neues verwendet werden. Um einen Gewöhnungstest durchzuführen, setzen Sie das trainierte Tier in den Käfig des Wohnmobils und lassen Sie es adoptieren.Befestigen Sie 30 Minuten lang ein sauberes, in Leitungswasser getränktes Stück Baumwolle mit einem beidseitigen Klebeband an der Innenwand des Wohnmobilkäfigs. Ersetzen Sie nach fünf Minuten die saubere Watte an der Wand des Käfigs durch eine neue, die in einer Flüssigkeit mit Vanillegeruch getränkt ist. Wiederholen Sie die fünfminütigen Kontakte mit dem Vanillegeruch dreimal im Abstand von fünf Minuten zwischen den Sitzungen.Um das Interesse am Geruch zu messen. Zählen Sie die kumulierte Zeit, die das Tier mit Blick auf die Zielzone verbringt, und die Gesamtzeit, die sich der Käfig des Wohnmobils bewegt hat. Während der letzten fünften Sitzung einen sozial bedeutsamen Geruch aufweisen.Befeuchten Sie den neuen Baumwollapplikator mit ein paar Tropfen Urin von Mäusen des anderen Geschlechts. Um die Reaktion auf Neuheit zu beurteilen, unterteilen Sie den Käfig des Wohnmobils in vier Zonen. Befestigen Sie zwei Baumwollstücke gegenüberliegend. Farbe.Kodieren Sie sie während des ersten Versuchs mit Markern an der Außenseite der Käfigwände. Legen Sie zwei saubere Baumwollstücke hinein. Ersetzen Sie dann beide durch Baumwolle, die in einem 1%igen Vanilleextrakt getränkt ist.Während des dritten Versuchs legen Sie die Vanillewatte in Zone Nummer eins und das in einem 1%igen Bananenextrakt getränkte Stück Baumwolle in die Zone. Nummer zwei, um die Präferenz für keinen Geruch zu messen. Berechnen Sie die Zeit, die Tiere mit dem Geruchsverbot verbringen, als Prozentsatz der kumulierten Zeit, die sie anderen Zonen gegenüberstehen.Hallo, ich bin Leo Kiro, Principal Investigator am Neuroscience Center der Universität Helsinki. Ich hoffe, Ihnen hat das Video gefallen und Sie fanden es nützlich. Wir haben in den letzten fünf Jahren mit zweifacher Mikroskopie in vivo gearbeitet, und die Verwendung von Allgemeinem und Ästhetik war schon immer ein großes Anliegen, weil eine Ästhetik die Gehirnfunktion, den Blutfluss und alles andere beeinträchtigt.Und heute bin ich froh, dass wir an wachen Tieren arbeiten und stabile mikroskopische Bildgebungsexperimente durchführen und die Ergebnisse, die wir zuvor bei anästhesierten Tieren erhalten haben, validieren und verifizieren können. Ich bin mir sicher, dass der Einsatz von Wohnmobilkäfigen und die Methoden, die wir heute vorgestellt haben, die Relevanz der In-vivo-Forschung im Allgemeinen erhöhen und zu neuen und bahnbrechenden Ergebnissen führen werden, und ich freue mich darauf.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Es wird ein Verfahren zur Manipulation der Aktivität der zerebralen kortikalen Pyramidenzellen optogenetically während das Elektroenzephalogramm, Elektromyogramm, und zerebrale Laktatkonzentration überwacht werden beschrieben. Experimentelle Aufnahmen werden auf Kabel-tethered Mäusen durchgeführt, während sie spontane Schlaf / Wach-Zyklen. Optogenetische Ausrüstung wird in unserem Labor zusammengebaut; Kontrollgerät ist kommerziell erhältlich.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Dieses Protokoll beschreibt das Design und die chirurgische Implantation eines kopffixierenden Mechanismus zur Überwachung der neuronalen Aktivität in subkortikalen Gehirnstrukturen bei wachen Ratten.  Es beschreibt Verfahren zur Isolierung einzelner Neuronen in der juxtazellulären Konfiguration und zur effizienten Identifizierung ihrer anatomischen Positionen.

Juxtacellular Überwachung und Lokalisierung von einzelnen Neuronen im Sub-kortikalen Hirnstrukturen der Alarm, Head-zurückhaltende Ratten

Anweisungen für die kostengünstige Konstruktion und chirurgische Implantation einer chronischen transkraniellen Elektroenzephalographie-Montage mit hoher Dichte in Mäuse werden bereitgestellt. Techniken zur Aufzeichnung, Extraktion und Verarbeitung von Signalen werden ebenfalls beschrieben.

Mit hoher Dichte Elektroenzephalographische Acquisition in einem Nagetiermodell unter Verwendung von Low-Cost-und Open-Source-Ressourcen

Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

Ein kabelloses, bidirektionale System für neuronale Mehrkanal-Aufnahmen und Stimulation in Ratten frei Verhalten wird eingeführt. Das System ist leicht und kompakt, so dass nur minimale Auswirkungen auf die Futtersorten Verhaltensrepertoire. Darüber hinaus bietet dieses bidirektionale System ein ausgefeiltes Instrument um kausale Zusammenhänge zwischen Aktivierungsmuster Gehirn und Verhalten zu beurteilen.

Ein kabelloses, bidirektionale Schnittstelle für In Vivo Aufnahme und Stimulation der neuronalen Aktivität in Ratten frei Verhalten

Diese Studie stellt eine Methode für die gleichzeitige Aufzeichnung von lokales Feld Potenziale im Gehirn, EKG, Elektromyogrammen und Signale einer frei beweglichen Ratte zu atmen. Diese Technik, die experimentelle Kosten reduziert und vereinfacht die Analyse der Daten, wird zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Gehirn und periphere Organe beitragen.

Gleichzeitige Aufnahmen der kortikalen lokales Feld Potentiale, Elektrokardiogramm, Elektromyogramm und Atemrhythmus aus einem frei beweglichen Ratte

Das hier vorgestellte Protokoll liefert Informationen zur simultanen Elektroenzephalografie (EEG) und Verhaltensbeurteilung in Echtzeit. Wir haben alle Schritte, die mit diesem Protokoll verbunden sind, als attraktive Lösung für Forscher in vielen Bereichen der Neurowissenschaften diskutiert, insbesondere in Lern- und Gedächtnisbereichen.

Simultane Überwachung der drahtlosen Elektrophysiologie und des Gedächtnisverhaltenstests als Werkzeug zur Untersuchung der Neurogenese des Hippocampus

Hier wird ein Protokoll zur Implantation eines chronischen Schädelfensters für die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen vorgestellt.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

Wir haben eine einzige Plattform entwickelt, um das Verhalten von Tieren während zweier kletterfaserabhängiger assoziativer Lernaufgaben zu verfolgen. Das kostengünstige Design ermöglicht die Integration mit optogenetischen oder bildgebenden Experimenten, die auf das Klettern der faserassoziierten Kleinhirnaktivität gerichtet sind.

Eine flexible Plattform zur Überwachung des kleinhirnabhängigen sensorischen assoziativen Lernens

Ein detailliertes neues Verfahren zur funktionellen Bildgebung von wachen, kopffixierten Ratten wird beschrieben.

Kopfimplantate für die Neurobildgebung von wachen, kopffixierten Ratten

Das Protokoll beschreibt die Methodik der extrazellulären Aufzeichnung im motorischen Kortex (MC), um extrazelluläre elektrophysiologische Eigenschaften in frei beweglichen bewussten Mäusen aufzudecken, sowie die Datenanalyse von lokalen Feldpotentialen (LFPs) und Spikes, die für die Bewertung der neuronalen Netzwerkaktivität nützlich ist, die dem interessierenden Verhalten zugrunde liegt.

Mehrkanalige extrazelluläre Aufzeichnung bei frei beweglichen Mäusen

Erfahren Sie, wie Sie optische und elektrophysiologische Aufnahmen bei wachen, kopffixierten, aber frei beweglichen Mäusen durchführen. Diese Methode kombiniert Zwei-Photonen-Mikroskopie und Patch-Clamp-Techniken mit natürlichem Verhalten.

Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere (Video) | JoVE Journal

Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere

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