Name: Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Lernen Sie den Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterieller Aktivität und Bacteriocin-Produktion bei Streptococcus pneumoniae. Diese Methode ermöglicht die schnelle Charakterisierung von Hemmspektren und Quorum-Sensing-Peptiden.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Elizabeth E. Kennedy Research Award.

1. Vorbereitung der Produzentenstammes <ol><li> Streak eine Pneumokokken-Stamm für Bakteriozin Produktion auf einem 5% Schafblut CASO-Agar Platte von -80 ° C Gefrierschrank Aktien getestet werden. HINWEIS: Die Verwendung von Blut-Platten für das anfängliche Wachstum des Stammes zu Inhibitionstest erhöht die Reproduzierbarkeit des Tests. Zusätzlich können andere nicht-Pneumokokken-Stämme, die Bakteriozine verwendet werden, obwohl die Wachstumsbedingungen müssen für einen bestimmten Organismus verändert werden. Wir haben Streptococcus mitis und Lactococcus lactis in der Overlay-Assay erfolgreich eingesetzt. </li><li> Inkubieren der Platte über Nacht (O / N) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation des Produzentenstammes, bereiten Sie die CASO-Agar (TSA) Platte durch Pipettieren von 3.000 bis 4.000 Einheiten Katalase auf Platten mit 25 ml TSA und die Ausbreitung der Katalase-Lösung mit sterilen Glasperlen. Lassen Sie die Platte trocken für etwa 10 min untereinem biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Sammeln Sie eine sichtbare Menge von Bakterien auf einer Pipettenspitze. Stechen die Pipettenspitze in die getrocknet TSA Platte. HINWEIS: Mehr als ein Produktionsstamm können in einem einzigen TSA Platte erstochen werden. Es ist wichtig, Raum aus, so dass die Stichverletzungen resultierenden Halos nicht überlappen. <ol><li> Wenn möglich, Bakteriozin Produzent bekannt als eine positive Kontrolle und der Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle verwendet werden. HINWEIS: Positive und negative Kontrollen sind zuvor veröffentlicht und sind auf Anfrage erhältlich 10. </li></ol></li><li> Inkubieren TSA-Platte, die mehrere Stichverletzungen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6 Stunden. </li></ol> 2. Erstellen Glycerol Stocks des Overlay Dehnungs <ol><li> Glycerin-Stammlösungen herzustellen (Kulturen mittleren exponentiellen Phase nach Zugabe von Glycerin gezüchtet und dann bei -80 ° C gelagert) vor dem Tag des Overlay-Assay. Impfen 5-10 Kolonien von Pneumokokken-strain für Empfindlichkeit oder Pheromon-Sekretion in Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) getestet werden. HINWEIS: Der Bau der BLPC induzierbaren Reporter ist bereits beschrieben worden und 2 Stämme sind auf Anfrage erhältlich. </li><li> Mit 5 ml THY mit fest geschlossenen Deckel in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren 5-10 Kolonien in Glasröhrchen ohne Schütteln. </li><li> Kulturen bei 37 ° C inkubieren, bis sie eine OD 620 zu erreichen von 0,3 bis 0,5. HINWEIS: Diese wird ca. 4-5 Stunden dauern, abhängig von der Belastung eingesetzt. <ol><li> Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig ein paar Mal vor der Messung der OD. </li></ol></li><li> Wenn das Experiment kann nicht am selben Tag durchgeführt werden, oder die Belastung wird mehrfach in der Zukunft genutzt werden, stellen Glycerin Aktien und wieder den Versuch zu einem späteren Zeitpunkt. Für Glycerinstamm Fügen Glycerin Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 20%. Aliquoten Kulturen in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. HINWEIS: Die Proben können sMonate bei -80 ° C überwacht. Wenn nicht machen Glycerin Aktien, verwenden Proben direkt für Overlay-Assay. </li></ol> 3. Overlay Assay <ol><li> Kurz vor der Anwendung zu überlagern, mischen Sie die Overlay-Komponenten. In einem 15 ml konischen Röhrchen, 5 ml THY, 3.000-4.000 U Katalase und 200 ul der Overlay-Stamm Bouillonkultur, die entweder gewachsen war, wurde an diesem Tag oder ein Glycerin Lager der Kultur, die bei Raumtemperatur aufgetaut wurde. Bei Verwendung der Reporter-Stamm, werden 50 ul X-Gal (40 mg / ml) zu dem Überlagerungsmischung. Verwenden Sie eine konische Röhrchen pro Platte. </li><li> Äquilibrieren Overlay Mischung bei Raumtemperatur vor der Zugabe des geschmolzenen TSA. </li><li> Entfernen TSA-Platte mit erstochen Belastung von Inkubator. Schmelzen festen TSA in Mikrowelle und halten bei 55 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. 3 ml geschmolzenem TSA mit 1,5% Agar und 55 ° C abgekühlt, um Mischung zu überlagern. <ol><li> Bereiten Sie die Overlay-Gemisch unmittelbar vor dem Pipettieren wird die Mischung beginnt zu sehr verfestigenschnell. HINWEIS: Wenn die Überlagerung beginnt vor Beschichtung verfestigt, werden die Ergebnisse nicht interpretierbar sein. </li></ol></li><li> Mischen Sie die Mischung durch Overlay-und Abpipettieren mehrmals mit einer 5 ml Pipette man aufpassen, nicht zu Blasen in die Mischung einführen. Langsam pipettieren Overlay Mischung direkt auf die Platte TSA erstochen. Halten Sie die Platte auf dem Labortisch für wenige Minuten und ermöglicht es der Agar zu verhärten. <ol><li> Die Platte, um die Overlay-Mischung verteilen nicht drehen, wird dieses Wachstum von der erstochen Kultur in den Überlagerungs ziehen. </li></ol></li><li> Vorsichtig TSA-Platte mit Overlay in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 O / N (ca. 16-18 h). </li><li> Beachten Sie die Platten nach Wachstum über Nacht. Die Platten sollten nur in Bereichen, in denen die Hemmung oder Pheromonsignal aufgetreten undurchsichtig vom Wachstum des Overlay-Belastung angezeigt. Diese werden als entweder klar oder blau Zonen rund um den Stamm erscheinen erstochen auf. HINWEIS: Obwohl Messements der Durchmesser der blau oder Clearing zur quantitativen Beurteilung bestimmt werden kann, Unterschiede in der Durchmesser kann auch in Abhängigkeit von der Menge der Bakterien, die in die Platte gestochen wurde, abhängig. Die Overlay-Assay ist ein qualitativer Test, jede quantitative Bewertung sollte mit Vorsicht interpretiert werden. Jede sichtbare Lichtung im Vergleich zur Negativkontrolle wird als Aktivität angesehen. </li></ol>

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<li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic%2C+lichenicidin%2C+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Overlay-Assay ist ein schneller Weg, um den Bereich der Tätigkeit für Bakteriozin Hersteller zu ermitteln und Wettbewerbs Wechselwirkungen, die unter Pneumokokken-Stämme auftreten können, zu demonstrieren. Die Overlay-Assay lässt sich an für das Screening mehrere Stämme für Bakteriozin Produktion auf einer einzigen Platte zu verwenden. Wir haben erfolgreich große Stammsammlungen mit diesem Test mit Hilfe eines 48-Pin-Replikator an SBA-Platten von einer Hälfte einer 96-Well-Platte zu impfen gescreent. Nach Inkubation...

Streptococcus pneumoniae, eine gemeinsame Kolonisator des polymikrobiellen Gemeinschaft des Nasenrachenraums, ist in der Lage, mit anderen Pneumokokken und eng verwandten Arten durch die Produktion von bakteriell produzierten antimikrobiellen Peptide (Bacteriocine) konkurrieren. Jeder vollständig sequenzierten Pneumokokken-Stamm bis heute untersucht enthält eine Version des b acteriocin- l ike p eptide Ort, BLP. Bacteriocin-Produktion durch Pneumokokken nachgewiesen wurde im Ergebnis der in vitro und in vivo Konkurrenz 1-4 wichtig. Wettbewerbsdynamik werden durch die Expression von verschiedenen Bakteriozine zusammen mit verwandten Proteinen Immunität in Reaktion auf eine spezifische Peptid-Pheromon beeinflusst. Induktion der BLP-Locus durch ein Quorum Sensing System, bei dem ein Peptid-Pheromon, BLPC, bindet an das Sensorkinase, BlpH gesteuert und löst eine Signalkaskade, was zu derTranskription des BLP Locus 5,6. Es gibt vier allelische Variationen BLPC dass jede Bindung an seinen zugehörigen BlpH 6. Für die Zelle, die Auswirkungen seiner eigenen Bakteriocin überleben, werden die Gene, die Proteine ​​kodieren verwandten Immunität auf der gleichen Operon wie jede der Bakteriocin-Genen transkribiert. Tötung tritt auf, wenn ein Teilnehmer-Stamm ist nicht in der Lage, die BLP-Locus in Antwort auf exogene Pheromon hochregulieren oder, wenn der Stamm fehlt die spezifische Immunität Gen zum Schutz benötigt. Der Transporter-Komplex, BlpAB ist für die Sekretion und Prozessierung des Peptids Pheromon und Bakteriocin-Peptide 2,4 erforderlich. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein signifikanter Anteil der Pneumokokken-Stämme &quot;Betrüger&quot; bedeutet, dass sie eine Mutation im konservierten blpA Gen, das sie nicht in der Lage Pheromone und Bakteriozine 1,2 sezer macht haben. Diese Stämme sind in der Lage, auf exogene BLPC 2 durch Wiehern sezerniert reagierenBohren Stämme so dass für die Herstellung von Proteinen Immunität. Obwohl rohe Zubereitungen von Bakteriozine aus Überständen aus Produktionsstämme mit biochemischen Methoden vor, um Reinheit zu erzielen, hergestellt werden, ist dieser Ansatz nicht nützlich für das Screening von großen Sammlungen von Isolaten und wenn der Pegel des Bakteriocin Expression niedrig in Brühe gewachsenen Kulturen 2,7 9. Die Overlay-Assay ist als schnelle Möglichkeit, die Wettbewerbsdynamik zwischen den Stämmen, die in vitro zu untersuchen existieren können verwendet. Um dies zu tun, ist eine Pneumokokken-Stamm vorgeimpft auf einer Agar-Platte und erlaubt, zu wachsen, um lokale Bakterienkonzentrationen ausreichend für die Induktion des BLP Ort zu erreichen. Ein zweiter Stamm wird dann in einem geschmolzenen weichen Agar-Lösung, die dann über die vorgeimpft Stamm zur Empfindlichkeitstest wird angewendet, inokuliert. Um die Aktivität der BLP-Locus (unabhängig von der Inhibitoraktivität) zu bewerten, können Stämme mit einer Reihe von th lagert werdenree zuvor beschriebenen BLPC Reporter-Stämme. Diese Stämme wurden konstruiert, um eine von drei verschiedenen blpH Allele, die zu den drei häufigsten BLPC Pheromone vom Pneumokokken sezerniert antworten enthalten. Die Reporterstämme haben einen integrierten lacZ-Gen, das unter der Kontrolle eines BlpH abhängigen Promotor ist und tragen eine Deletion im Gen, das BLPC Selbststimulation 10,11 verhindert.

<table><tbody><tr><td>Trypticase-Soja-Agar mit 5% Schafsblut</td><td>Fisher</td><td>B21261X</td><td>Für das Wachstum aus Tiefkühlkulturen</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100-500mg</td><td>4.741 Einheiten pro Platte</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Bouillon + Hefeextrakt (THY)</td><td>Fisher</td><td>DF0492-17-6&nbsp;</td><td>30 g THB, 5 g Hefeextrakt, 1 l ddH2O Autoklav</td></tr><tr><td>Trypticase Sojabrühe + Agarplatten (TSA)</td><td>Fisher</td><td>B11768&nbsp;</td><td>30 g TS, 15 g Agar, 1 L ddH2O Autoklav</td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl &beta;-D-galactopyranosid (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>Lösen in Dimethylformamid-Petrischalen</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td></td> FB0875712-Spektrophometer <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Misst die OD620 von Kulturen</td></tr><tr><td>37 &deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 > C Inkubator mit 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml konisches Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung des overlay-assay zur qualitativen messung bakterielle produktion und die sensibilität für pneumokokken bacteriocine

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae besiedelt die hochdiverse polymikrobielle Gemeinschaft des Nasopharynx, wo er mit ansässigen Organismen konkurrieren muss. Wir haben gezeigt, dass bakteriell produzierte antimikrobielle Peptide (Bakteriocine) das Ergebnis dieser kompetitiven Interaktionen bestimmen. Alle vollständig sequenzierten Pneumokokkenstämme beherbergen einen bActeriocin-l ike peptid (blp) Locus. Der blp-Locus kodiert für eine Reihe verschiedener Bakteriocine und alle hochkonservierten Komponenten, die für ihre Regulation, Verarbeitung und Sekretion benötigt werden. Die Diversität der Bakteriozine, die in der Bakteriocin-Immunitätsregion (BIR) des Locus vorkommen, trägt wesentlich zur Pneumokokken-Konkurrenz bei. Zusammen mit den Bakteriozinen befinden sich Immunitätsgene im BIR, die benötigt werden, um die Erzeugerzelle vor den Auswirkungen ihres eigenen Bakteriozins zu schützen. Der Overlay-Assay ist eine schnelle Methode, um eine große Anzahl von Stämmen auf kompetitive Wechselwirkungen zu untersuchen, die durch Bakteriocine vermittelt werden. Der Overlay-Assay ermöglicht auch die Charakterisierung der Bakteriozin-spezifischen Immunität und den Nachweis von sezernierten Quorum-Sensing-Peptiden. Der Assay wird durchgeführt, indem eine Agarplatte mit einem Stamm vorbeimpft wird, der auf die Bakteriocinproduktion getestet werden soll, gefolgt von der Anwendung einer weichen Agar-Überlagerung, die einen Stamm enthält, der auf Bacteriocin-Empfindlichkeit getestet werden soll. Eine Clearance-Zone, die den Stich umgibt, zeigt an, dass der Overlay-Stamm empfindlich auf die Bakteriocine reagiert, die von dem vorinokulierten Stamm produziert werden. Wenn keine Clearance-Zone beobachtet wird, ist entweder der Overlay-Stamm immun gegen die produzierten Bakteriocine oder der vorgeimpfte Stamm produziert keine Bakteriozine. Um zu bestimmen, ob der blp-Locus in einem gegebenen Stamm funktionsfähig ist, kann der Overlay-Assay angepasst werden, um die Peptid-Pheromon-Sekretion durch den vorinokulierten Stamm zu bewerten. In diesem Fall wird eine Reihe von vier lacZ-Reporterstämmen mit unterschiedlicher Pheromonspezifität im Overlay verwendet.

Es gibt zwei mögliche Ergebnisse in der Overlay-Assay. Es sollte möglich sein, das Wachstum des Stammes erstochen nach Inkubation über Nacht zu sehen. In 1A ist die Overlay-Stamm empfindlich für die Bakteriocine produziert. Ein Freiraum visualisiert die Belastung erstochen Umgebung werden. Zusätzlich ist Verwirbelung der gestochen Belastung in den Überlagerungsmischung möglich ist und in der Figur 1A zu sehen ist. In 1B ist die Overlay-Stamm immun gegen die Bakteriozine...

Die Konkurrenz in Streptococcus pneumoniae wird durch Bacteriocine vermittelt, kleine antimikrobielle Peptide mit inhibitorischer Aktivität gegenüber Pneumokokken und anderen verwandten Spezies. Hier beschreiben wir einen optimierten bakteriellen Overlay-Assay, der die Charakterisierung der Bakteriocinaktivität und des inhibitorischen Spektrums, der Bacteriocin-spezifischen Immunität und den Nachweis von sekretierten Quorum-Sensing-Peptiden ermöglicht.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bakterien und die Aktivität der Streptokokken-Pneumonie mit Hilfe des Overlay-Assays sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zuerst der Produzentenstamm auf eine TSA-Platte gestochen wird. Im zweiten Schritt wird die Overlay-Stammmischung vorbereitet und dann langsam auf die TSA-Platte pipettiert, die den abgestuften Produzentenstamm enthält.Im letzten Schritt wird die bakterielle Aktivität bewertet. Letztendlich kann der Overlay-Assay verwendet werden, um die Inaktivität der Bakterien oder die Pheromonproduktion des interessierenden Stichstamms nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der direkten Reinigung von Bacterin besteht darin, dass diese Methode eine schnelle Möglichkeit bietet, eine Reihe von Bakterien und Inaktivität zu etablieren und mehrere Stämme in der Produktion auf Bakterien zu untersuchen.Natalie Marchek, eine Doktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Um die Bakterien im Produzenten vorzubereiten, beginnen Sie damit, den Pneumokokkenstamm von Interesse auf eine 5%ige TSA-Platte aus Schafblut zu streichen und die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5%igem Kohlendioxid zu inkubieren. Pipettieren Sie am nächsten Morgen 3000 bis 4.000 Einheiten Katalysatoren auf Platten mit 25 Millilitern TSA und verteilen Sie die Katalysatoren mit sterilen Glasperlen auf den Platten. Nachdem Sie die Platten ca. 10 Minuten unter einer biologischen Sicherheitswerkbank trocknen gelassen haben, sammeln Sie eine sichtbare Menge an Bakterien auf einer Pipettenspitze und stechen Sie die Pipettenspitze in die getrocknete TSA-Platte.Wenn möglich, ist ein bekannter Bakteriensündenproduzent als Positivkontrolle und der zu verwendende Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle einzubeziehen, wobei ausreichend Abstand zwischen den Stichen zu schaffen ist, damit sich die Wachstumshöfe nicht überlappen. Inkubieren Sie dann die Stichkulturen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für sechs Stunden am Tag vor dem Overlay-Assay und inokulieren Sie fünf bis 10 Kolonien des zu testenden Pneumokokkenstamms in Glasröhrchen mit fünf Millilitern THY-Medium mit 0,5 % Hefeextrakt. Schließen Sie dann die Deckel dieser Glycerinstammkulturen und inkubieren Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad ohne Schütteln.Nach vier bis fünf Stunden drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig um und messen Sie dann den Außendurchmesser. Wenn die Kulturen einen OD zwei 60 von 0,3 bis 0,5 erreicht haben, fügen Sie Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20 % hinzu, aliquotieren Sie die Kulturen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Am nächsten Morgen ein Aliquot der Glycerinbrühe bei Raumtemperatur auftauen.Mischen Sie dann kurz vor dem Auftragen des Overlays fünf Milliliter THY 3000 bis 4.000 Einheiten Katalysator und 200 Mikroliter des Glycerinbestands in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Bei Reporterbakterienstämmen fügen Sie der Overlay-Mischung 50 Mikroliter Xcel mit einem konischen Röhrchen pro Platte hinzu. Legen Sie die Overlay-Mischung bei Raumtemperatur, während die Mischung den geschmolzenen festen TSA in einer Mikrowelle äquilibriert, und legen Sie sie dann in ein 55 Grad Celsius heißes Wasserbad.Wenn das geschmolzene TSA schnell auf 55 Grad Celsius abgekühlt ist, geben Sie drei Milliliter TSA in die Overlay-Mischung und pipettieren Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette mehrmals auf und ab. Achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen, und pipettieren Sie dann die Overlay-Mischung langsam direkt auf die gestochene TSA-Platte. Nach einigen Minuten, wenn die Platte ausgehärtet ist und ohne die Platte zu drehen, setzen Sie die überlagerte Stichkultur vorsichtig wieder in den Inkubator ein, um sie über Nacht zu kultivieren.Am nächsten Morgen beobachten Sie das Wachstum über Nacht. Die Platten sollten durch das Wachstum des Overlay-Stammes undurchsichtig erscheinen, außer in den Bereichen, in denen eine Hemmung oder Pheromonsignalisierung stattgefunden hat. Es gibt zwei mögliche Ergebnisse für den Overlay-Assay in diesem repräsentativen Experiment.Nach der Kultivierung über Nacht wurde eine Clearance-Zone um den gestochenen Stamm beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieser Overlay-Stamm empfindlich auf die produzierten Bakteriensünden reagiert. Beachten Sie auch das Verwirbeln des gestochenen Stammes in die Overlay-Mischung. In diesem Experiment war der Overlay-Stamm immun gegen die Sekretion des Bacterins, was durch das Fehlen eines Halos um den Stich herum angezeigt wird.Es ist auch möglich, dass der gestochene Stamm kein Bacterin für den Signalassay sezerniert. Zwei verschiedene Ergebnisse sind möglich. In diesem Experiment sezernierte der gestochene Stamm ein Pheromon, das mit der Histidinkinase des Overlay-Stammes interagierte, wie in der blauen Zone zu sehen ist, die den Abbau von Xal in diesem Bild anzeigt.Wenn das Pheromon die Transkription des BLP-Locus im Stamm des Reporters nicht aktiviert oder wenn der gestochene Stamm kein Pheromon sezerniert, erfolgt der Abbau der X-Skala nicht, wie in diesem Bild zu sehen Nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie Mutationsanalyse oder Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob eine nennenswerte inhibitorische Aktivität auf den BLP-Locus zurückzuführen ist oder ob es sich um einen Mangel an Aktivität als Folge einer Mutation im Transporter-Gen handelt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Hockett, K. L. und Baltrus, D. A. Einsatz der Soft-Agar-Überlagerungstechnik zur Suche nach bakteriell produzierten inhibitorischen Verbindungen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Erkennung von bakteriiocinvermitteltem Tötung, indem Supernatant aus einem antibiotikainduzierten Spenderstamm auf eine weiche Agarschicht mit einem Teststamm gespott wird. Freie Zonen, die nach der Inkubation entstehen, deuten auf bakterielle Hemmung hin.

Soft Agar Overlay Assay zur Erkennung bakteriiozinvermittelter Tötung bei Pseudomonas syringae

Dieses Video zeigt den Nachweis von Bakteriocin produzierenden Milchsäurebakterien, die aus Fäkalien von Mäusen gewonnen werden. Der Assay bestimmt die antimikrobielle Aktivität von Bacteriocin auf bestimmte Bakterienstämme.

Bewertung des antimikrobiellen Potenzials von Bacteriocin-produzierenden fäkalen Bakterienisolaten der Maus

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre...

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Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

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Wir beschreiben eine einfache Methode zum Screening von Bakterienkulturen auf die Produktion von Verbindungen, die gegenüber anderen Bakterien hemmend wirken.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

Die in diesem Protokoll vorgestellten Co-Kultur-Interaktions-Assays sind kostengünstig, hochdurchstöbet und einfach. Diese Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in der Kokultur zu beobachten, Interaktionsmuster zu identifizieren und das hemmende Potenzial eines mikrobiellen Stammes von Interesse gegen menschliche und ökologische Krankheitserreger zu charakterisieren.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

Lernen Sie den Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterieller Aktivität und Bacteriocin-Produktion bei Streptococcus pneumoniae. Diese Methode ermöglicht die schnelle Charakterisierung von Hemmspektren und Quorum-Sensing-Peptiden.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

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