Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine
30. September 2014
Die Konkurrenz in Streptococcus pneumoniae wird durch Bacteriocine vermittelt, kleine antimikrobielle Peptide mit inhibitorischer Aktivität gegenüber Pneumokokken und anderen verwandten Spezies. Hier beschreiben wir einen optimierten bakteriellen Overlay-Assay, der die Charakterisierung der Bakteriocinaktivität und des inhibitorischen Spektrums, der Bacteriocin-spezifischen Immunität und den Nachweis von sekretierten Quorum-Sensing-Peptiden ermöglicht.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bakterien und die Aktivität der Streptokokken-Pneumonie mit Hilfe des Overlay-Assays sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zuerst der Produzentenstamm auf eine TSA-Platte gestochen wird. Im zweiten Schritt wird die Overlay-Stammmischung vorbereitet und dann langsam auf die TSA-Platte pipettiert, die den abgestuften Produzentenstamm enthält.
Im letzten Schritt wird die bakterielle Aktivität bewertet. Letztendlich kann der Overlay-Assay verwendet werden, um die Inaktivität der Bakterien oder die Pheromonproduktion des interessierenden Stichstamms nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der direkten Reinigung von Bacterin besteht darin, dass diese Methode eine schnelle Möglichkeit bietet, eine Reihe von Bakterien und Inaktivität zu etablieren und mehrere Stämme in der Produktion auf Bakterien zu untersuchen.
Natalie Marchek, eine Doktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Um die Bakterien im Produzenten vorzubereiten, beginnen Sie damit, den Pneumokokkenstamm von Interesse auf eine 5%ige TSA-Platte aus Schafblut zu streichen und die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5%igem Kohlendioxid zu inkubieren. Pipettieren Sie am nächsten Morgen 3000 bis 4.000 Einheiten Katalysatoren auf Platten mit 25 Millilitern TSA und verteilen Sie die Katalysatoren mit sterilen Glasperlen auf den Platten. Nachdem Sie die Platten ca. 10 Minuten unter einer biologischen Sicherheitswerkbank trocknen gelassen haben, sammeln Sie eine sichtbare Menge an Bakterien auf einer Pipettenspitze und stechen Sie die Pipettenspitze in die getrocknete TSA-Platte.
Wenn möglich, ist ein bekannter Bakteriensündenproduzent als Positivkontrolle und der zu verwendende Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle einzubeziehen, wobei ausreichend Abstand zwischen den Stichen zu schaffen ist, damit sich die Wachstumshöfe nicht überlappen. Inkubieren Sie dann die Stichkulturen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für sechs Stunden am Tag vor dem Overlay-Assay und inokulieren Sie fünf bis 10 Kolonien des zu testenden Pneumokokkenstamms in Glasröhrchen mit fünf Millilitern THY-Medium mit 0,5 % Hefeextrakt. Schließen Sie dann die Deckel dieser Glycerinstammkulturen und inkubieren Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad ohne Schütteln.
Nach vier bis fünf Stunden drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig um und messen Sie dann den Außendurchmesser. Wenn die Kulturen einen OD zwei 60 von 0,3 bis 0,5 erreicht haben, fügen Sie Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20 % hinzu, aliquotieren Sie die Kulturen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Am nächsten Morgen ein Aliquot der Glycerinbrühe bei Raumtemperatur auftauen.
Mischen Sie dann kurz vor dem Auftragen des Overlays fünf Milliliter THY 3000 bis 4.000 Einheiten Katalysator und 200 Mikroliter des Glycerinbestands in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Bei Reporterbakterienstämmen fügen Sie der Overlay-Mischung 50 Mikroliter Xcel mit einem konischen Röhrchen pro Platte hinzu. Legen Sie die Overlay-Mischung bei Raumtemperatur, während die Mischung den geschmolzenen festen TSA in einer Mikrowelle äquilibriert, und legen Sie sie dann in ein 55 Grad Celsius heißes Wasserbad.
Wenn das geschmolzene TSA schnell auf 55 Grad Celsius abgekühlt ist, geben Sie drei Milliliter TSA in die Overlay-Mischung und pipettieren Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette mehrmals auf und ab. Achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen, und pipettieren Sie dann die Overlay-Mischung langsam direkt auf die gestochene TSA-Platte. Nach einigen Minuten, wenn die Platte ausgehärtet ist und ohne die Platte zu drehen, setzen Sie die überlagerte Stichkultur vorsichtig wieder in den Inkubator ein, um sie über Nacht zu kultivieren.
Am nächsten Morgen beobachten Sie das Wachstum über Nacht. Die Platten sollten durch das Wachstum des Overlay-Stammes undurchsichtig erscheinen, außer in den Bereichen, in denen eine Hemmung oder Pheromonsignalisierung stattgefunden hat. Es gibt zwei mögliche Ergebnisse für den Overlay-Assay in diesem repräsentativen Experiment.
Nach der Kultivierung über Nacht wurde eine Clearance-Zone um den gestochenen Stamm beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieser Overlay-Stamm empfindlich auf die produzierten Bakteriensünden reagiert. Beachten Sie auch das Verwirbeln des gestochenen Stammes in die Overlay-Mischung. In diesem Experiment war der Overlay-Stamm immun gegen die Sekretion des Bacterins, was durch das Fehlen eines Halos um den Stich herum angezeigt wird.
Es ist auch möglich, dass der gestochene Stamm kein Bacterin für den Signalassay sezerniert. Zwei verschiedene Ergebnisse sind möglich. In diesem Experiment sezernierte der gestochene Stamm ein Pheromon, das mit der Histidinkinase des Overlay-Stammes interagierte, wie in der blauen Zone zu sehen ist, die den Abbau von Xal in diesem Bild anzeigt.
Wenn das Pheromon die Transkription des BLP-Locus im Stamm des Reporters nicht aktiviert oder wenn der gestochene Stamm kein Pheromon sezerniert, erfolgt der Abbau der X-Skala nicht, wie in diesem Bild zu sehen Nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie Mutationsanalyse oder Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob eine nennenswerte inhibitorische Aktivität auf den BLP-Locus zurückzuführen ist oder ob es sich um einen Mangel an Aktivität als Folge einer Mutation im Transporter-Gen handelt.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein optimierter Bakterien-Überzugstest zur Visualisierung der Aktivität von Streptococcus pneumoniae beschrieben. Der Test ermöglicht die Charakterisierung der Bacteriocin-Aktivität, Immunität sowie den Nachweis von Quorum-Sensing-Peptiden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Antimikrobielle Peptide
- Bakterielle Konkurrenz
Hintergrund
- Streptococcus pneumoniae konkurriert unter Verwendung von Bacteriocinen.
- Bacteriocine sind kleine antimikrobielle Peptide.
- Das Verständnis der Bacteriocin-Aktivität kann Behandlungsstrategien beeinflussen.
- Das Quorum-Sensing spielt eine Rolle bei der bakteriellen Kommunikation.
Zweck der Studie
- Bakterielle Aktivität mittels Überzug-Assay sichtbar machen.
- Bakteriozid-Aktivität und inhibitorisches Spektrum bewerten.
- Quorum-Sensing-Peptide nachweisen.
Verwendete Methoden
- Impfen der Produzentenstamm auf eine TSA-Platte.
- Vorbereiten und Auftragen der Überzugsschicht mit dem Stammgemisch.
- Beurteilung der bakteriellen Aktivität nach dem Überziehen.
- Vergleich dieser Methode mit direkten Reinigungstechniken.
Hauptergebnisse
- Der Überlagerungs-Assay zeigt effektiv die bakterielle Inaktivität an.
- Er ermöglicht eine schnelle Untersuchung mehrerer Stämme.
- Er demonstriert die Pheromonproduktion durch den produzierenden Stamm.
- Er bietet eine schnelle Alternative zu bestehenden Methoden.
Schlussfolgerungen
- Der optimierte Überzugstest ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Bacteriocinen.
- Diese Methode vertieft das Verständnis bakterieller Wechselwirkungen.
- Sie kann weitere Forschung zu antimikrobiellen Strategien erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels des Überzug-Assays lässt sich die Produktion und Empfindlichkeit von Bakterienstämmen gegenüber Bacteriocinen schnell überprüfen, was die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium der antimikrobiellen Wirkstoffentdeckung unterstützt. Durch die Visualisierung von kompetitiven Interaktionen und der Quorum-Sensing-Signalübertragung liefert die Methode mechanistische Einblicke in die bakterielle Konkurrenz, die bei der Identifizierung von Leitstrukturen und der Absicherung antimikrobieller Kandidaten hilfreich sind. Dieser Ansatz trägt dazu bei, Stämme oder Signalwege mit therapeutischem Potenzial zu priorisieren, bevor aufwändige Reinigungs- oder Charakterisierungsarbeiten durchgeführt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Produktion von Bacteriocinen mit der Wettbewerbsfähigkeit in polymikrobiellen Umgebungen verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung des blp-Locus als Determinante bakterieller Antagonismen, ohne dass eine Peptidreinigung erforderlich ist.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Stämme mit aktiver Bacteriocin-Sekretion zur weiteren mechanistischen Entschärfung identifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete antimikrobielle Bildschirmung vor, indem die Bacteriocin-Aktivität und Immunitätsprofile bestätigt werden.
- Operativer Wert: Standardisiert qualitative Auslesungen (Freisetzungszone, pheromoninduzierte Reportersignale) über mehrere Stämme hinweg, um reproduzierbare vergleichende Analysen zu ermöglichen.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die Hochdurchsatz-Bewertung von Stamm-Bibliotheken und beschleunigt so die Identifizierung von Produzenten und empfindlichen Indikatoren zur Optimierung von Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Wert: Verbindet die entdeckungsphasenbezogene Bacteriocin-Aktivität mit präklinischer Relevanz, indem spezifische hemmende Spektren und Mechanismen der Immunflucht charakterisiert werden.
- Mechanistische Risikoreduktion: Klärt, ob die beobachtete Hemmung auf dem blp-Locus beruht, wodurch falsch-positive Ergebnisse bei der Validierung antimikrobieller Wirkstoffkandidaten reduziert werden.
- Biomarker-Korrelation: Detektiert sezernierte Quorum-sensing-Peptide, die als translationelle Biomarker für die Aktivierung von Signalwegen in natürlichen Umgebungen dienen könnten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Overlay-Assay ist in den frühen Entdeckungsprozess integriert, unterstützt die Hypothesenprüfung bei der Target-Validierung und ermöglicht die Assay-Bereitschaft für Workflows zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, die auf antimikrobielle Peptide ausgerichtet sind.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft Hypothesen zu bakteriellen Wettbewerbsmechanismen, indem sie die durch Bacteriocine vermittelte Hemmung und stammspezifische Empfindlichkeitsmuster sichtbar macht.
- Screening: Erzeugt qualitative Aktivitätsaussagen, die die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Screenings zur Identifizierung von Bacteriocin-produzierenden Stämmen unterstützen.
- Analytik: Liefert messbare Ergebnisse wie die Bildung von Hemmzonen und die Aktivierung von Reportergenen (z. B. Abbau von lacZ), um verschiedene Bedingungen zu vergleichen und die Modulation von Signalwegen zu verfolgen.
- Translationale Forschung: Verbindet laborbedingte Beobachtungen zur Bacteriocin-Ausschüttung mit möglicher in-vivo-Relevanz, indem die Funktionalität des blp-Lokus in klinischen oder umweltbedingten Isolaten bewertet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Screening-Plattform zur Beurteilung der Bacteriocin-Aktivität über verschiedene Stammkollektionen hinweg und reduziert so redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem die mechanistische Uneindeutigkeit im Zusammenhang mit bakteriozinvermittelter Konkurrenz verringert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung qualitativer Bewertungen antimikrobieller Aktivität zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in frühen antimikrobiellen Programmen, indem falsch-negative Produzentenstämme oder immune Stämme schnell identifiziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Stämmen oder Loci basierend auf nachgewiesener Bakteriozin-Funktionalität und Empfindlichkeitsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit anaeroben Bakterien und sterilen Überdeckungstechniken, um Kontaminationen zu vermeiden und eine genaue Interpretation der Zonen sicherzustellen.
- Setzt den Zugang zu TSA-Platten, THY-Medium, lacZ-Reportersystemen sowie kontrollierten Inkubationsbedingungen (37 °C, 5 % CO2) voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Einstichtiefe, des Überdeckungsvolumens und der Inkubationszeiten, um reproduzierbare Hemm- oder Signalisierungsergebnisse zwischen verschiedenen Anwendern zu gewährleisten.
- Muss bei der Anpassung des Assays an neue genetische Hintergründe oder Arten die Variabilität der Wachstumsdynamik der Stämme und des Zeitpunkts der Pheromonsekretion berücksichtigen.
- Auf qualitative oder halbquantitative Ergebnisse beschränkt; ergänzende Methoden (z. B. Mutagenese, Sequenzierung) sind erforderlich, um die Abhängigkeit vom blp-Locus oder die Funktionalität von Transportern zu bestätigen.
