Name: Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Lernen Sie die schnelle Genotypisierung von Neugeborenen-Mäusen und die Erzeugung primärer neuronaler Kulturen auf Gliazell-Feederschichten. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Studien an genetisch veränderten Mäusen.

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Die Autoren danken den Forschern der Universität von Iowa, Dr. Luis Tecedor, Ines Martins und Beverly Davidson für Anweisungen und hilfreiche Kommentare zu striatalen Kulturen, und Dr. Kara Gordon, Nicole Bode und Pedro Gonzalez-Alegre für die Unterstützung und Diskussionen bei der Genotypisierung. Wir danken auch Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) für hilfreiche Kommentare zum Thema Tätowieren und Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) für hilfreiche Kommentare zur Mauskultur. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der American Heart Association, des Verteidigungsministeriums (Peer Reviewed Medical Research Program Award W81XWH-14-1-0301), der Dystonia Medical Research Foundation, der Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, der National Science Foundation und der Whitehall Foundation (N.C.H.) unterstützt.

HINWEIS: Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Iowa zugelassen. 1. Langfristige Bezeichnung Mäuse Mit Tätowieren den Fußballen <ol><li> Immobilisieren eine Pfote mit der Pfote Pads (Fußsohle) mit Blick auf den Experimentator. Halten Sie die Pfote mit dem Daumen und dem Zeigefinger. Achten Sie darauf, die Pfote zu kneifen. HINWEIS: Stabil Immobilisierung ist darauf zu achten, dass die Tattoo-Pigment in die Dermis der Pfote Pads platziert und damit dauerhaft 7. </li><li> Wischen Sie die Pfotenpolster mit 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm oder Tupfer. </li><li> Bewerben Hautöl zu einem Wattestäbchen, und drücken Sie vorsichtig die Spitze gegen die Oberfläche der Pfote Pad mehrmals. Verwenden Sie nur eine kleine Menge von Hautöl; wenn sie in großen Mengen, es wird die Tätowierpigment vom Erreichen der Haut zu verhindern. </li><li> Tauchen Sie die Spitzen der Tattoo-Nadeln in der Tätowierfarbe gerade vorzum Tätowieren. Verwenden Sie saubere, keimfreie und scharfe Tätowiernadeln, um die Schmerzen und die Möglichkeit einer Infektion zu verringern, und auch um die Tätowierung Effizienz zu steigern. </li><li> Während die Pfotenpolster Oberfläche mit der Haut Öl bedeckt ist, drücken Sie die Tattoo-Nadelspitzen vertikal und leicht auf der Haut in der Mitte der Pfote Pad, und spritzen die Tinte mehrere Male. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Informationen über elektrische Tätowierung-System. </li><li> Spray 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm, drücken Sie sie vorsichtig gegen die Pfote zu zusätzlichen Tätowierungspigmente auf der Hautoberfläche zu entfernen, und überprüfen Sie die Qualität der Tätowierung. Prüfen, ob die Mitte des Pfotenpolster hat einen dunklen, runden Fleck, die von der normalen Pigmentierung der Haut unterscheidet. Wenn das Tattoo nicht dunkel oder groß genug für die einfache Anzeige, wiederholen Sie die vorherigen Schritte Tätowieren. </li></ol> 2. Genotypisierung Neugeborene Mäuse mit einem schnellen PCR Genotypisierung Kit <ol><li> Desinfizieren des distalen Endes eines Maus Schwanz mit 70% Ethanol, schneiden 5 mm oder weniger der Schwanzkippen und sie auf einem Rohr aus einem 8er Streifen des Typs, für die PCR verwendet. Verwenden Sie eine unbenutzte Rasierklinge für jeden Welpen um eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu vermeiden. Alternativ dazu können eine Schere, aber in diesem Fall sorgfältig durch das verbleibende Gewebe an die Klingen unter Verwendung von 70% Ethanol. Prüfen Sie, ob Blutungen. Wenn die Blutung auf, Druck auf die ausgeschnittenen Bereich des Schwanzes mit einem Gaze-Schwamm, bis Blutung aufgehört hat. </li><li> Fügen Sie 200 ul der DNA-Extraktionslösung zu jedem PCR-Röhrchen mit einer Probe. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für seine Zusammensetzung und Informationen über das Set. </li><li> Das Röhrchen Streifen in einen PCR-Thermocycler und Beginn der DNA-Extraktion, mit dem folgenden Programm: 1 Zyklus bei 55 ° C für 10 min, 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 Minuten, und Halten bei 4 ° C. Anmerkung: Dies ist das gleiche PCR-Thermocycler, die später für die PCR verwendet. </li><li> Nachdem die DNA-Extraktion beendet ist, entfernen Sie das Rohr Streifen aus dem Thermocycler einnd invertieren 5mal. </li><li> Überweisung 4 ul der Lösung (DNA-Extrakt) jeder Probe auf einer unbenutzten Röhre eines 8-Röhrenstreifen und mischen mit: 10 ul 2X PCR Ready Mix II, 2 ul vorne und Reverse-Primer gemischt (bei empfohlen 0,5 uM, siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Sequenzen) und 4 ul Nuklease-freies H 2 O, für jede Probe. Spin kurz (zB 3 sec) mit einer Tischzentrifuge. Halten Sie das Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten außer bei der Handhabung. </li><li> Führen Temperaturwechsel. Sehen Tabelle der Materialien / Ausrüstung für die thermische Programm. </li><li> Detektieren die amplifizierte DNA-Produkte. Laden die gesamte Reaktionslösung aus der PCR (20 &amp; mgr; l), die direkt in ein Bohrloch eines Agarosegels. Laden Sie die Molekulargewichtsmarker in eine separate gut. Anwenden eines elektrischen Feldes. </li><li> Erwerben Fluoreszenzbilder der Banden unter UV-Licht. </li></ol> 3. Primär Kultur der Maus Gehirn Neurons auf Gliazellen Feeder Layer- HINWEIS: Die Vorgehensweisen zum Gehirn Dissektion und Dissoziation Zelle (3,1) sind, die für alle nachfolgenden Verfahren. Die Verfahren für die Maus Gliakulturen (3.2), Ratte Gliakulturen (3.3) und eine Maus neuronalen Kulturen (3.4) werden separat danach beschrieben. <ol><li> Gehirn Dissection and Cellular Dissocaiation <ol><li> Opfere eine Maus oder Ratte Welpen durch Enthauptung, schnell zu entfernen, das Gehirn, und legen Sie sie in Hanks-Lösung (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung) + 20% fötalem Rinderserum (FBS) in einem 35-mm-Schale (auf Eis gehalten). </li><li> Schneiden Sie das Gehirn durch die Mittellinie in zwei Hemisphären. Entfernen der Region von Interesse (zB Großhirnrinde, Striatum und Hippocampus) von jeder Hemisphäre des Gehirns. Entfernen Sie die Hirnhaut und großen Blutgefäßen von der Oberfläche. Schneiden Sie die Hirnregion, in 4-10 dünne Scheiben mit einem Skalpell. </li><li> Spülen Sie die Hirnschnitten in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, einmal Witzh Hanks-Lösung + 20% FBS, dann 3-mal mit der Hanks-Lösung (dh ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Zu spülen, fügen Sie 5-10 ml Lösung, lassen Sie den Hirnschnitten am Boden des Röhrchens zu regeln, saugen die Lösung von oben, und fügen Sie eine frische Lösung. Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der Lösung. </li><li> Filter 2 ml der Trypsin-haltigen Aufschlußlösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in die Röhrchen mit den Gehirnschnitten. Lassen Sie die Trypsinierung fahren Sie für 13 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Neutralisieren die Trypsinlösung zuerst durch Absaugen meiste davon und dann durch Zugabe von 7-10 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C). </li><li> Spülen der Gehirnscheiben, zweimal mit Hanks-Lösung + 20% FBS, und dann dreimal mit der Hanks-Lösung (ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der solutIonen. </li><li> Filter 2 ml der Dissoziationslösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in der Röhre mit den Gehirnschnitten. </li><li> Mechanisch distanzieren die Zellen durch leichtes Verreiben 10-20 mal, bis sichtbare Gewebestücke verschwinden. Verwenden Sie ein Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette und vermeiden Sie Luftblasen beim Zerreiben. </li><li> Warten Sie 3 min für Kleinteile, sich niederzulassen. </li><li> Übertragen der Mehrzahl der Lösung (~ 1,5 ml, so dass einige Lösung an der Unterseite) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das 3 ml Hanks-Lösung + 20% FBS-Lösung (4 ° C) enthält, wobei die baumwollsteckt, Feuer- polierten Pasteurpipette. Die gesamte Lösung nicht übertragen, da die Aufnahme eines Sediment am Boden führt typischerweise zu einer Verschlechterung der Kultur. </li><li> Zentrifuge für 13 Minuten bei ~ 185 g (~ 1100 rpm) bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand vorsichtig,1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium (37 ° C) zu dem Pellet und resuspendieren durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. HINWEIS: Drei verschiedene Arten von Plattenmedien sind für verschiedene Kultur zwecke Plattierungsmedium-1 für Maus Gliazellen Plattierungsmedium-2 für Maus-Neuronen und Plattierungsmedium-3 Rattenneuronen und Gliazellen (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzungen) . </li><li> Nehmen Sie 10 ul der Zellsuspension, mischen Sie es mit 10 ul 0,4% Trypanblau-Lösung, und messen die Dichte der lebenden Zellen, entweder mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers. </li></ol></li><li> Maus Gliakulturen <ol><li> Waschen Sie die Deckgläser, zur Schaffung gesunder Kulturen von Mauszellen. <ol><li> Tauchen Deckgläser (rund, Durchmesser 12 mm) in 70% iger Salpetersäure in einer Glaspetrischale. Vor Licht mit Aluminiumfolie, und legen Sie sie auf einem Rundschüttler O / N. </li><li> Spülen Sie die Glas coverslips in der Petrischale mindestens dreimal mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie sie in destilliertem Wasser. Die Schale auf einem Orbitalschüttler O / N. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser auf einem Whatman 150 mm Filterpapier in der biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Autoklavieren Sie die Deckgläser. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in 24-Well-Kulturschale. </li></ol></li><li> Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2. </li><li> Erhalten die Gehirnzellen der Maus Welpen gemäß Schritt 3.1. HINWEIS: Die Verwendung der Großhirnrinde ist typisch für die Vorbereitung der Maus Glia-Feeder-Schicht. Aber auch andere Gehirnregionen, wie Hippocampus und Striatum, wird nach dem Einstellen der Zelldichte aufgrund von unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten. </li><li> Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-1 an die Zellsuspension (ca. 1 ml). Zum Vorwärmen Kulturmedien, legen Sie die Lösung in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, umermöglichen, dass die Temperatur und der pH-Wert zu stabilisieren. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein unbeschichtetes T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank. </li><li> An 1 Tag in vitro (DIV), spülen Sie die kultivierten Zellen in der T25-Flasche zweimal mit Plattierungsmedium-1 (4 ° C). Stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator. Führen Spülen durch Ansaugen des Mediums in den Kolben vollständig mit einer Pasteur-Pipette, indem ~ 5 ml frisches Medium und leichtes Kippen der Kolben mehrmals in einer Wirbelbewegung. </li><li> Bei 6-9 DIV, (dh einen Tag vor der Trypsinisierung und Plattieren auf Deckgläsern in Schritten 3.2.8-3.2.13), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials mit extrazellulären Matrixproteinen (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Kommentare das Beschichtungsmaterial) auf die Deckgläser in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank. </li><li> Bei 7-10 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent (räumlich kontinuierlich), trypsinieren ihnen. <ol><li> Die Flasche einmal spülen, durch Ansaugen die gesamte Lösung im Kolben und Hinzufügen von ~ 13 ml Hanks-Lösung (4 ° C) vorsichtig den Kolben kippen mehrmals in einer Wirbelbewegung, und saugen Sie die Lösung vollständig. </li><li> In 40 ul DNase-Lösung (Endkonzentration 750 Einheiten / ml) bis 4 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die heiße Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter, und fügen Sie das Filtrat direkt zu den Zellen in der Flasche. </li><li> Lassen Sie die Trypsinisierung gehen für 13 min bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Neutralisierung der Trypsinlösung durch Zugabe von 2 ml 100% FBS (4 ° C) in den Kolben. </li><li> Übertragen Sie die Zellen mit Trypsin in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit einem 5- bis 10-ml-Pipette ~ 4 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C), Zentrifuge bei ~ 185 g und 4 ° C für 13 min , und saugen Sie den Überstand. </li></ol></li><li> Das Pellet in 1 ml vorge warmed Plattierungsmedium-1. </li><li> Messung der Dichte der Zellen entsprechend Schritt 3.1.13. </li><li> Absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern, und Platten ~ 50 &amp; mgr; l der resuspendierten Gliazellen auf Deckgläsern. HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator. </li><li> 20-60 Minuten später, 1 ml vorgewärmtes Plattierungsmedium-1 in jede Vertiefung, und die Schale wieder in den Inkubator. Anmerkung: Während das Plattenmedium zugegeben wird, wird es hilfreich sein, eine andere Pipette zu verwenden, um nach unten drücken, der den Umfang des Deckplättchens (wo es keine plattierten Zellen), so daß das Deckglas nicht in dem Medium schwimmt. </li><li> Bei 1 DIV der Glia-Feeder-Schicht (dh auf dem Deckglas), ersetzen Sie das Medium mit 1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium-1, durch Ansaugen die gesamte Lösung in einem gut und dann mit frischem Medium zu füllen. </li><li> Bei 2-3 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die celLS 80-100% konfluent, fügen mitotischen Inhibitor (10 &amp; mgr; l einer Mischung aus 5-Fluor-2&#39;-deoxyuridin + Uridin; Endkonzentrationen von 81,2 und 204,8 &amp; mgr; M) in jede Vertiefung, um die DNA-Replikation und somit zu hemmen drücken Glia-Zellen-Proliferation. </li><li> 7-9 DIV, wenn die Zellen 90-100% konfluent (1-2 h vor dem Plattieren Neuronen auf der glial feeder layer) Ersetzen des Kulturmediums mit vorgewärmter Plattierungsmedium-2 (37 ° C). HINWEIS: Die Neuronen werden am selben Tag plattiert werden, unter Anwendung von Schritt 3.4. </li></ol></li><li> Rat Gliakulturen <ol><li> Coat eine T25 Kulturflasche mit dem gleichen Beschichtungsmaterial. Hinweis: Dies ist für die spätere Entfernung der nicht-adhärenten Zellen in Schritt 3.3.5 notwendig. <ol><li> 2,0 ml des Beschichtungsmaterials in den Kolben, und setzen Sie den Kolben in der Kulturbrutschrank. </li><li> Nach 2-3 Stunden, saugen Sie den Beschichtungsmaterial vollständig, so dass der Boden der Flasche trocken wird. </li></ol></li><li> Besorgen Sie sich die Zellenaus den jungen Ratten, gemäß dem Schritt 3.1. HINWEIS: Die Region CA3-CA1 des Hippocampus wird zur Herstellung der Ratten glial Nährschicht verwendet. Aber auch andere Gehirnregionen, wie dem cerebralen Cortex und Striatum wird bereinigt um Unterschiede in der Zelldichte aufgrund der unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten. </li><li> Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-3 zu der Zellsuspension (ca. 1 ml). </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in die beschichteten T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C). </li><li> Bei 2-3 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent waren, entfernen nicht adhärenten oder schwach haftenden Zellen, durch Schließen des Deckels dicht unter Schütteln heftig ~ 10 mal, Absaugen der Lösung und Zugabe von 4-5 ml des Überzuges Medium-3 (bei 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Untersuchen Sie die kultivierten Zellen über die gesamte Kolbenboden (zBVerwendung von Phasenkontrastmikroskop) zu bestätigen, dass die, die neuronale (dh solche, bei denen der äußere Rand des Zellenkörpers wird phasen hell dargestellt) vollständig entfernt werden. Wiederholen den Vorgang so oft wie nötig, um diese Zellen zu entfernen, und anschließend wurde der Kolben zurück in den Inkubator. HINWEIS: Die Festigkeit und die Gesamtzahl der &quot;Shakes&quot; erforderlich ist, kann zwischen den einzelnen Experimentatoren abweichen. Das Wichtigste ist, nicht auf die Gesamtzahl der Shakes auf eine festgelegte Anzahl zu halten, aber um zu bestätigen, dass die Neuronen-ähnliche Zellen eliminiert werden. </li><li> Bei 6-8 DIV, wenn Zellen sind 90-100% konfluent, Durchgang die Gliazellen durch Trypsinierung sie wie in Schritt 3.2.8. </li><li> Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), 10 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), übertragen die trypsiniert Zellen einem unbeschichteten T75-Kolben und Kultur sie Inkubator. HINWEIS: Ratte Gliazellen zweimal passagiert werden; im Gegensatz die Maus Gliazellen are agiert nur einmal, weil sie ungesund nach mehreren Durchgängen werden. Ratten-Gliazellen in T75-Flaschen, die nicht mit irgendeinem Überzugsmaterial überzogen werden passagiert werden. Die Beschichtung ermöglicht Ratte Gliazellen, zu schnell zu wachsen und liefern viele Geißelzellen (vermeintlichen Ependymzellen), die später die neuronale Kulturbedingungen verschlechtern wird. </li><li> Bei 17 bis 19 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 11 Tage nach der Passage und einen Tag vor Trypsinierung und Ausplattieren auf Deckgläser durch Schritte 3.3.9-3.3.14), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials auf ungewaschenen Deckgläser ( rund, Durchmesser 12 mm) in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank. HINWEIS: Bei Ratten Gliakulturen eine Differenz nicht in den Kulturergebnisse mit oder ohne Waschen der Deck bemerkt. </li><li> Bei 18-20 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 12 Tage nach Passagieren), bereiten Sie die Glia-Feeder-Schicht durch Trypsinisierung der kultivierten Zellen, nach step 3.2.8. </li><li> Während der Zentrifugation absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern. </li><li> Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), und Messen der Zelldichte, gemäß Schritt 3.1.13. </li><li> Stellen Sie den glial Dichte bis 10 4 lebenden Zellen / ml, und die Platte 100 ul des glialen Zellsuspension auf die beschichteten Glasplättchen. HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator für 20-60 min. </li><li> 1 ml der Plattierungsmedium-3 (4 ° C) in jede Vertiefung und die Schale wieder in den Inkubator. </li><li> Bei 3-4 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die Zellen auf dem Deckglas sind 40-80% konfluent, 1 ml der vorgewärmten Nährmedium (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung), die Cytosin-β-D-arabinofuranosid enthält ( AraC Endkonzentration von 4 &amp; mgr; M) bis glial-Zellproliferation anzuhalten. Platte Neurons 7-9 DIV der glial-Feeder-Schicht, wenn die Zellen 60-80% konfluent waren, unter Anwendung von Schritt 3.4. </li></ol></li><li> Maus Neuronale Kulturen <ol><li> Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2. </li><li> Verwenden Sie die Maus Welpen für Schritt 3.1. </li><li> Einstellung der Intensität des Lebendzellsuspension auf ~ 2,0 × 10 5 Zellen / ml mit vorgewärmten Plattierungsmedium-2 für die Beschichtung auf der Maus Gliazellen oder Verwendung Plattierungsmedium-3 für die Plattierung auf Ratten-Gliazellen. </li><li> Platte die Zellen auf der Glia-Feeder-Schicht, indem Sie vorsichtig Zugabe der Zellsuspension in das Kulturmedium von jedem gut. Hinweis: Das Volumen der Zellsuspension zugegeben werden durch die Zielzahl der Zellen in einer Kulturvertiefung bestimmt werden. Zum Beispiel Platte ~ 60 ul Zellsuspension zu 12.000 Zellen / Vertiefung zu erzielen. </li><li> Beachten Sie, dass keine Lösung Änderungen sind erforderlich, nachdem die Neuronen überzogen. Seien Sie vorsichtig, um die Verdampfung der Lösung aus den Vertiefungen vermeiden, im Laufe der Kultur, durch Befeuchten des Inneren of der Kulturbrutschrank. </li></ol></li></ol>

Der Autor (Zhengmin Huang) ist der Präsident von EZ BioResearch LLC, das die in diesem Artikel beschriebenen Reagenzien herstellt.

Die hier vorgestellte Protokoll enthält Verfahren für die Tätowierung zur Kennzeichnung / Identifizierung Mäusen, zur Genotypisierung Mäuse aus Schwanzspitzen und zur Kultivierung von Maus Gehirnneuronen bei geringer Dichte. In einer Runde von Experimenten mit 6-8 Welpen, diese Verfahren benötigen in der Regel ~ 0,5 Stunden, ca. 4 h und ca. 2 h zugeführt, an insgesamt 6-7 Stunden. Dies macht es praktisch für eine einzige Versuchsleiter, alle aus der Zeit der Jungtiere &quot;die Geburtsstunde der Beschichtung von neurona...

Nagetiermodellen von genetischen Krankheiten als nützlich bei der Schaffung der physiologischen Funktionen von normalen Proteinen und Nukleinsäuren sowie die pathophysiologischen Folgen von Defekten in diesen erwiesen. Beispiele umfassen Mäuse für Proteine ​​in zelluläre Schlüsselfunktionen beteiligt defizient sowie Mausmodelle von Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit. Allerdings können bestimmte genetische Manipulationen an neonatale Letalität kurz oder ein paar Tage nach der Geburt führen. In diesen Fällen sind die primären Zellkulturen ein wichtiges Werkzeug, da lebende Zellen können aus den embryonalen oder neonatalen Welpen vor dem Tod erhalten werden, können sie für wenigstens einige Wochen in vitro gehalten werden, und während dieser Zeit frühe neuronale Entwicklung kann gefolgt werden biochemische, morphologische und funktionelle Experimente. Für die Primärkulturen, kann es vorteilhaft sein, die Nervenzellen bei niedriger Dichte Platte; dies macht es möglich, die einzelnen Zellkörper, Dendriten, Axonen und Nervenwellen termi visualisierennale mit hoher räumlicher Auflösung. Jedoch das Überleben und die Differenzierung von Neuronen bei niedriger Dichte erfordert typischerweise, dass sie auf einer glialen Feeder-Schicht plattiert sind, co-kultiviert mit Glia-Zellen in Abwesenheit von physikalischen Kontakt mit ihnen oder in einem Medium kultiviert, durch Glia 1 konditioniert. Die Einrichtung von niedriger Dichte neuronalen Kulturen auf Gliazellen Feeder-Schichten kann abhängig von schnellen und zuverlässigen Genotypisierung voraus sein - innerhalb von ein paar Stunden im Gegensatz zu ein paar Tagen. Geschwindigkeit ist besonders wichtig, wenn das neuronale Genotyp muss derjenigen einer glialen Nährschicht vorher vorbereitet angepaßt werden. Als ein praktisches Beispiel kann es notwendig sein, zu entscheiden, welche backs dem Genotyp in Erzeugen Kulturen zu verwenden, um die Effizienz eines Experiments zu optimieren. Hier zeigen wir die Arbeitsprotokoll, das für die schnelle, vereinfachte und zuverlässige Maus Genotypisierung in früheren Publikationen 2-6 verwendet wurde. Mäuseschwänzen undein im Handel erhältlicher Kit verwendet. Dieses Protokoll umfasst einstufigen Extraktion von Nukleinsäuren aus dem Gewebe und erfordert weder eine Nukleinsäure-Reinigungsschritt noch der Einsatz eines Aufhebungspuffer (&quot;Stop-Lösung&quot;). Die Zuverlässigkeit dieser Genotypisierungsverfahrens wird erreicht, indem die Ergebnisse einer Reihe von Tests, wenn Unterschiede in Bezug auf die Ausgangsmenge der Proben, dem Alter der Tiere und die Länge der PCR-Produkte eingebracht dargestellt. Dieses Kit bietet die Vorteile der automatischen Extraktion und Zuverlässigkeit. Aus Gründen der als umfassende, ist die Verwendung von Tätowieren für langfristige Identifikations der genotypisiert Mäusen demonstriert. Tätowieren wird durch Anlegen Tätowierfarbe in die Dermis der Haut (unter der Epidermis) erreicht 7. Es wird ein Verfahren für die Tätowierung Fußballen von Neugeborenen oder 1 Tag alten Mäusen beschrieben, obwohl Tätowierungen kann auch auf andere Teile des Körpers, wie zum Beispiel Schwänze und Zehen angewendet werden, und animals aller Altersgruppen. Darüber hinaus werden Verfahren für die Beschichtung und das Kultivieren der Maus-Neuronen bei einer niedrigen Dichte nachgewiesen werden, basierend auf einer optimierten Herstellung von verschiedenen Arten von glial-Feeder-Schichten 2,8. Wir verwenden einen genetischen Mausmodell des geerbten neurologische Erkrankung DYT1 Dystonie - eine autosomal-dominante Bewegungsstörung durch eine Mutation im Gen verursacht TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Das codierte Protein, Torsina, gehört zu den &quot;ATPasen mit verschiedenen Zellaktivitäten verbunden&quot; (AAA +) Proteinfamilie, deren Mitglieder in der Regel durchführen Chaperon-ähnliche Funktionen, Unterstützung bei: Proteinentfaltung, Protein-Komplex Demontage, Membrantransport und Vesikelfusion 10-13. Die Mutation führt zu einer in-frame-Deletion eines Codons, das für Glutaminsäure, und kann eine Manifestation der &quot;early-onset generali isoliert Dystonie &#39;14,15 führen. Jedoch ist die Pfadophysiological Mechanismen für diese Erkrankung verantwortlich bleiben weitgehend unverstanden. In einer Knock-in-Maus-Modell ist der mutierte Allel Tor1a tm2Wtd, im folgenden als Tor1a AE erwähnt. Heterozygote AE-Torsina knock-in Mäuse sind lebensfähig und genetisch imitieren menschlichen Patienten mit DYT1 Dystonie, während homozygote Knock-in Mäusen nach der Geburt sterben, 16,17, mit der Latenzzeit zu postnatalen Tod von genetischen Hintergrund 18 betroffen. Der frühe Tod von homozygoten Knockout-Mäusen erforderlich, daß sowohl die Genotypisierung von Tieren und die Einrichtung von neuronalen Kulturen schnell abgeschlossen. Als weiteres Beispiel für die Genotypisierung Tfap2a (Transkriptionsfaktor AP-2α, Aktivieren Enhancer bindendes Protein 2α) verwendet. Das durch dieses Gen kodierte Protein ist in der Regulierung mehrerer zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Differenzierung, Überleben und Apoptose 19 wichtig.

<table><tbody><tr><td>REAGENZIEN - Tätowiermaschine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reiniger</td><td>Tieridentifikations- und Markierungssysteme, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Dies wird verwendet, um die Nadeln und den Halter nach dem Tätowieren zu reinigen.</td></tr><tr><td>Maschinelles Trocknungsmittel</td><td>Tieridentifikations- und Kennzeichnungssysteme, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>Dies wird verwendet, um die Nadeln und den Halter nach der Reinigung zu trocknen.</td></tr><tr><td>Neonate Tattoo Schwarzes Pigment</td><td>Tieridentifikations- und Markierungssysteme, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Skin Prep Applikator</td><td>Tieridentifikations- und -kennzeichnungssysteme, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Wattestäbchen.</td></tr><tr><td>Lösung zur Hautvorbereitung</td><td>Tieridentifikations- und -kennzeichnungssysteme, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Dieses Reagenz liefert eine dünne Ölschicht, die die Effizienz des Tätowierens verbessert und das Verblassen der Tätowierung verhindert, indem es (Informationen vom Anbieter): 1) verhindert, dass nicht tätowierte Haut vorübergehend verfärbt wird, wodurch die Qualität einer Pfotenballen-Tätowierung leicht beurteilt werden kann, bevor der Welpe in seinen Heimatkäfig zurückgebracht wird &ndash; Die fleckige Hautoberfläche kann mit der tätowierten Haut verwechselt werden, 2) Reduzierung von Hautschäden während des Tätowierens &ndash; Das Erweichen der Haut und das Schmieren der Nadel hilft der Nadel, in die Haut einzudringen, ohne Hautschäden zu verursachen, und 3) verhindert, dass molekularer Sauerstoff in die Haut eindringt, wodurch Entzündungsreaktionen auf reaktive Sauerstoffspezies reduziert werden, die erzeugt werden können.</td></tr><tr><td>REAGENZIEN - Genotypisierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotypisierungskit (Streifenröhrchenformat)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Ein roter Ladefarbstoff für die Elektrophorese ist in der 2X PCR Ready Mix-Lösung enthalten.</td></tr><tr><td>Gewebelyselösung A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Bereiten Sie DNA-Extraktionslösung durch Mischen von 20 & Mikro; l der Gewebelyselösung A und 180 &micro; l Gewebelyselösung B pro Probe.</td></tr><tr><td>Gewebelyselösung B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Bereiten Sie DNA-Extraktionslösung durch Mischen von 20 & Mikro; l der Gewebelyselösung A und 180 &micro; l Gewebelyselösung B pro Probe.</td></tr><tr><td>Essigsäure, eiszeitlich</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-optimierte Qualität, molekularbiologische Qualität</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>Wir verwenden 2% Agarose-Gele in TAE-Puffer, die den SYBR Safe DNA-Gel-Farbstoff (10.000-fach verdünnt) oder Ethidiumbromid (0,5 &micro; g/ml Gelvolumen).</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Gefilterte Pipettenspitzen, aerosolfrei, 0,1-10 &; Mikro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>Verwenden Sie Pipettenspitzen, die steril und frei von DNA, RNase und DNase sind. Verwenden Sie für alle Schritte, die DNA betreffen, gefilterte Pipettenspitzen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Gefilterte Pipettenspitzen, Premium Fit Filterspitzen, 0,5-20 & Mikro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Verwenden Sie Pipettenspitzen, die steril und frei von DNA, RNase und DNase sind. Verwenden Sie für alle Schritte, die DNA betreffen, gefilterte Pipettenspitzen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Gefilterte Pipettenspitzen, Premium Fit Filterspitzen, 1-200 & Mikro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Verwenden Sie Pipettenspitzen, die steril und frei von DNA, RNase und DNase sind. Verwenden Sie für alle Schritte, die DNA betreffen, gefilterte Pipettenspitzen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Molekulargewichtsmarker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Wir verwenden einen dieser drei Molekulargewichtsmarker.</td></tr><tr><td>Molekulargewichtsmarker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Molekulargewichtsmarker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen, 8-Röhrchen-Streifen mit einzeln angebrachten Domkappen, natur, 0,2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Verwenden Sie Röhrchen, die steril und frei von DNA, RNase und DNase sind. Ein 8-Röhrchen-Streifen ist einfacher zu handhaben und gruppiert die Proben als einzelne Röhrchen.</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen, Ultraflux Individual&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Verwenden Sie Röhrchen, die steril und frei von DNA, RNase und DNase sind.</td></tr><tr><td>Seal-Rite 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, natur</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Verwenden Sie Röhrchen, die steril und frei von DNA, RNase und DNase sind.</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel-Färbung * 10.000-fache Konzentration in DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primer zur Amplifikation des Tor1a-Gens in & Delta; E-TorsinA-Knock-in-Mäuse:</td><td></td><td></td><td>5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3' (vorwärts) und 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, CAC, AAC, CAC-3' (Rückseite) (Referenz 18). Diese Primer wurden in einer Endkonzentration von 1,0 ng/&micro; l (~0,16 &micro; M) (Referenz 2).</td></tr><tr><td>Primer zur Amplifikation des Tfap2a-Gens in Wildtyp-Mäusen</td><td></td><td></td><td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (vorwärts), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GTT GCT GAG GTA-3' (rückwärts) für das 498-bp Amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CAA CTT TCG-3' (vorwärts), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (umgekehrt) für das 983-bp Amplicon, und 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (VORWÄRTS), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (Rückseite) für das 1990-bp Amplicon. Diese Primer werden bei 0,5 & micro;M verwendet.</td></tr><tr><td>REAGENZIEN - Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Fluor-2&prime;-Desoxyuridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Weitere Informationen finden Sie im Kommentarbereich von Uridin.</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen 35 x 10 mm Schale, mit Gewebekulturen behandelte</td><td>BD falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen, T25, gewebekulturbehandelt, schräger Hals, Stopfenverschlusskappe, 25 cm2 Wachstumsfläche, 70 ml</td><td>BD falcon</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen, T75, mit Gewebekulturen behandelt, schräger Hals, belüftete Kappe, 75 cm2 Wachstumsfläche, 250 ml</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>konisches Röhrchen, Polypropylen, 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (Zellzahlzähler) Objektträger</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin &beta;-D-Arabinofuranosidhydrochlorid (Ara-C-Hydrochlorid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose (Dextrose) wasserfrei, SigmaUltra, 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Schale, Petriglas 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>Stammlösung wird in einer Menge von 1.500 Einheiten/20 μm hergestellt; l = 75.000 Einheiten/ml in destilliertem Wasser.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, GlutaMAX, Pyruvat</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES Filtereinheit, 250 ml, Membran mit 50 mm Durchmesser, 0,2 &; Mikro; m Porengröße</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle PES-Filtereinheit, 500 ml, Membran mit 90 mm Durchmesser, 0,2 &; Mikro; m Porengröße</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas Deckglas, 12 mm Rund, Dicke 0,09 mm; 0,12 mm, Nr. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5 % (Titration)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, 37 %, A.C.S. Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4&bull;( 7H2O), BioUltra, &ge; 99,5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran-Matrix-Lösung, phenolrotfrei</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Dies ist das Beschichtungsmaterial für Deckgläser und Kolben. 1) Um es vorzubereiten, tauen Sie die Matrigel Basalmembran-Matrix-Lösung auf Eis auf, was normalerweise ~1 Tag dauert. Die aufgetaute Lösung wird mit einer vorgekühlten Pipette in vorgekühlte T25-Kolben auf Eis aliquotiert und die Kolben bei -20 °C gelagert. Zur Herstellung der Arbeitslösung Matrigel wird das aliquotierte Matrigel in einem Kolben auf Eis aufgetaut, durch Zugabe von vorgekühlter MEM-Lösung 50-fach verdünnt und die verdünnte Lösung bei 4 μC gehalten. Es ist wichtig, alle Kulturgefäße und Medien, die mit Matrigel in Berührung kommen, vorzukühlen, außer während und nach der Beschichtung von Deckgläsern, um zu verhindern, dass es vorzeitig ein Gel bildet. 2) Um die Glasdeckgläser oder Kulturflaschen mit Matrigel zu beschichten, tragen Sie die Matrigel-Lösung auf die Oberfläche auf. Vor dem Plattieren von Zellen ist es wichtig, die Oberfläche vollständig zu trocknen. Zu diesem Zweck kann es hilfreich sein, Matrigel während der Zellzentrifugation unmittelbar vor dem Plattieren der Zellen zu aspirieren und genügend Zeit zum Trocknen einzuplanen.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum-Extender, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Platten, mit Gewebekulturen behandelte 24-Well-Platte</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Platten, mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platte</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), flüssig</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Neuronale Ergänzung) 21&nbsp;</td><td>im Labor</td><td></td> hergestellt <td>Quelle: Referenz 69</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten, 5 &frac34; &rdquo; &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Verwenden Sie diesen 5 &frac34 mit Wattestecker; &rdquo; Pasteurpipette für die zelluläre Verreibung. Politieren Sie die Spitze vorher, um die Schnittfläche zu glätten und den Innendurchmesser auf 50-80% des Originals zu reduzieren. Eine zu kleine Spitze zerstört die Zellen und verringert die Lebensfähigkeit der Zellen, aber eine zu große Spitze verringert die Effizienz der Verreibung.</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten, 9" &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl), SigmaUltra, &ge; 99,0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 2 ml</td><td>BD Falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 5 ml&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 50 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3, Natriumhydrogencarbonat), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH), Pellets, 99,998% Spurenmetallbasis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat (Na2HPO4&bull;( 7H2O)), &ge; 99,99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, SigmaUltra, &ge; 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, steril, 0,2 & Mikro; m</td><td>Corning 431219</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 3 ml</td><td>BD Falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin, Holo, Rinderplasma</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung, 0,4%</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Dies wird zur Zählung lebender/toter Zellen verwendet. Erneuern Sie eine alte Trypanblau-Lösung, wenn sie mehrere Male wiederverwendet wird (z. B. mehrmals pro Woche über mehrere Wochen), da sie Ausfällungen bildet und zu fehlerhaften Messwerten der Zelldichte führt.</td></tr><tr><td>Trypsin, Typ XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung, 0,25%&nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>Stammlösung wird in einer Dosis von 50 mg 5-Fluor-2'-Desoxyuridin und 125 mg Uridin in 25 ml DMEM (8,12 bzw. 20,48 mM) hergestellt.</td></tr><tr><td>REAGENZIEN - Immunzytochemie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikörper, polyklonales Kaninchen Anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper, monoklonaler Anti-GFAP-Cocktail der Maus</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>AUSRÜSTUNG - Tätowieren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NEO&#8211; 9</td><td>Dieses Nagetier-Tätowiersystem für Neugeborene ist ein elektrisches System, das durch schnelles Bewegen von 1- oder 3-Punkt-Tätowiernadeln vertikal in die Haut funktioniert. Aktiviere die Tätowiermaschine einmal für ca. 0,5 Sekunden, während die Tattoo-Nadelspitzen senkrecht zur Hautoberfläche gehalten werden. Wir bevorzugen die Drei-Nadel-Tätowierung, um den tätowierten Bereich zu maximieren, aber die Einnadel-Tätowierung ist effektiv auf schmaleren Bereichen, z.B. den Zehen, oder wenn eine feine mechanische Kontrolle erforderlich ist, z.B. wenn Zahlen tätowiert werden. Zwei Tätowierrunden mit der langsamsten Geschwindigkeit (Einstellung "1" aus 3 Schritten) reichen in der Regel aus, um eine sichtbare und lang anhaltende Tätowierung der Pfotenballen zu erzeugen.</td></tr><tr><td>AUSRÜSTUNG - Genotypisierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresesystem, horizontal, Wide Mini&#8211; Sub Cell GT</td><td>BIO&#8211; RAD</td><td>170&#8211; 4405</td><td>Typische Elektrophoreseparameter sind die elektrische Feldstärke bei 6 V/cm und die Dauer von 25 min für ein 10 cm langes Gel.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Thermocycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Unsere PCR-Reaktionen für das Tor1a-Gen in &#916; E-TorsinA-Knock-in-Mäuse sind wie folgt: 1 Denaturierungszyklus bei 94 &#176; C für 3 min, 35 Denaturierungszyklen bei 94 &#176; C für 30 Sekunden, Glühen bei 58 &#176; C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 72 &#176; C für 2 Min. Es folgt die endgültige Verlängerung bei 72 &#176; C für 10 min und halten bei 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Netzteil, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT - Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler, Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Dieser automatisierte Zellzähler misst getrennt die Dichten von lebenden und toten Zellen (nicht gefärbt bzw. mit Trypanblau gefärbt). Es ist wichtig, den optimalen Bereich der Dichtemessungen zu kennen: Der von uns verwendete Zähler hat die höchste Genauigkeit im Bereich von 1 x 105 bis 4 x 106 Zellen/ml. Wenn die gemessenen Werte für die Zelldichte außerhalb des empfohlenen Bereichs liegen, passen Sie das Resuspensionsvolumen entsprechend an.</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank, Klasse II, Typ A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Diese Haube wird für alle Zellkulturverfahren verwendet, mit Ausnahme der Hirndissektion.</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator, AutoFlow, Feuchtigkeitskontrolle Wassermantel</td><td></td><td>NUAIRE NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Horizontale Reinbank</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Diese Reinbank wird für die Dissektion des Gehirns verwendet (Schritte 3.1.1 und 3.1.2 von "Hirndissektion und zelluläre Dissoziation)".</td></tr><tr><td>Orbit LS Low Speed Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Superspeed Zentrifuge</td><td>Fisher</td><td>46910 (Zentrifuge)/46922 (Rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle genotypisierung der tiere nach aufbau primärkulturen von neuronen des gehirns gefolgt

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Hochauflösende Analyse der Morphologie und Funktion von Säuger-Neuronen erfordert oft die Genotypisierung von Einzeltieren, gefolgt von der Analyse der Primärkulturen von Neuronen. Wir beschreiben eine Reihe von Verfahren für: Etikettieren neugeborenen Mäusen die genotypisiert werden, schnelle Genotypisierung und die Einrichtung mit niedriger Dichte Kulturen von Nervenzellen im Gehirn von diesen Mäusen. Einzelne Mäuse werden von Tätowierungen, die für langfristigen Identifikations dauerhaft in das Erwachsenenalter ermöglicht markiert. Genotypisierung von dem beschriebenen Protokoll ist schnell und effizient und ermöglicht eine automatisierte Extraktion von Nukleinsäure mit guter Zuverlässigkeit. Dies ist unter Umständen, wenn genügend Zeit für herkömmliche Genotypisierung nicht verfügbar ist, beispielsweise nützlich, in Mäusen, die aus Neugeborenen-Letalität leiden. Primären neuronalen Kulturen werden bei niedriger Dichte, die Abbildungsexperimente mit hoher räumlicher Auflösung ermöglicht erzeugt. Diese Kulturverfahren erfordert die Herstellung von glial-Feeder-Schichten vor dem neuronalen Plattierung. Die protocol ist in seiner Gesamtheit an einem Mausmodell für die Bewegungsstörung DYT1 Dystonie (&amp; Dgr; E-Torsina Knock-in-Mäusen) aufgebracht und Neuronenkulturen werden von Hippocampus, Kortex und Striatum dieser Mäuse hergestellt. Dieses Protokoll kann auf Mäuse mit anderen genetischen Mutationen, um andere Tierarten angewendet werden, wie gut. Ferner können einzelne Komponenten des Protokolls isoliert Teilprojekte verwendet werden. Dabei dient dieses Protokoll haben breite Anwendungen, nicht nur in den Neurowissenschaften, aber auch in anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften.

Als ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls, sind repräsentative Ergebnisse für die Markierung von Mäusen durch Tätowierungen, zuverlässig Genotypisierung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und mit primären neuronalen Kulturen glial-Feeder-Schichten gezeigt. Tätowierung Neugeborene Welpen wurden auf den Fußballen mit einem Tätowierung-System ("Newborn" in Abbildung 1) gekennzeichnet. Die Etiketten blieben 3 ...

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neugeborene Mäuse zu genotypisieren und neuronale Kulturen mit niedriger Dichte auf einer glialen Feeder-Schicht zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem neugeborene Mäuse im zweiten Schritt zunächst schnell mit ihren Schwanzspitzen genotypisiert werden. Am selben Tag werden die Gehirne präpariert und als Glia-Feeder-Schichten kultiviert.Nach einigen Wochen wird dann eine weitere Gruppe neugeborener Mäuse schnell genotypisiert und neuronale Zellen aus dem Gehirn des Tieres für die Kultur auf den vorhergehenden Glia-Feeder-Schichten erzeugt. Letztlich kann diese Methode sowohl für eine schnelle und zuverlässige Genotypisierung als auch für die Erzeugung gesunder Neuronen und Gliazellen eingesetzt werden. Es gibt zwei Hauptvorteile dieses Protokolls.Eine davon ist, dass wir gesunde Neuronen mit einer sehr geringen Dichte für bildgebende Experimente kultivieren können, indem wir sie auf eine fötale Gliaschicht aufschichten. Der zweite Vorteil besteht darin, dass neugeborene Mäuse innerhalb weniger Stunden genotypisiert werden können, was eine Übereinstimmung der Genotypen der Neuronen und der glialen fetalen Schicht ermöglicht. Ich bin ein wissenschaftlicher Mitarbeiter im Harta-Labor.Ich werde die Verfahren zur Genotypisierung und Kulturen demonstrieren. Beginnen Sie damit, 200 Mikroliter DNA-Extraktionslösung in jedes PCR-Röhrchen zu geben, das eine Probe enthält. Legen Sie den Röhrchenstreifen in einen PCR-Thermocycler und starten Sie dann die DNA-Extraktion, wenn die Extraktion abgeschlossen ist.Entfernen Sie den Schlauchstreifen aus dem Thermocycler und drehen Sie die Rohre fünfmal um. Übertragen Sie dann vier Mikroliter DNA-Extrakt von jeder Probe in ein unbenutztes Röhrchen auf einem Streifen mit acht Röhrchen und mischen Sie die Probe mit 10 Mikrolitern von zwei XPCR bereit. Mischen Sie zwei, zwei Mikroliter gemischte Vorwärts- und Rückwärtsprimer und vier Mikroliter nukleasefreies Wasser.Legen Sie die Proben für jede Probe in einen Thermocycler und starten Sie das Temperaturwechselprogramm. Wenn das Programm beendet ist, laden Sie 20 Mikroliter jeder amplifizierten Probe oder jedes Molekulargewichtsmarkers direkt in die entsprechende Vertiefung eines Arous-Gels. Lassen Sie dann das Gel laufen und nehmen Sie Fluoreszenzbilder der Bänder unter ultraviolettem Licht auf.Um die amplifizierten DNA-Produkte nachzuweisen, beginnen Sie damit, die interessierenden Regionen aus jeder Hemisphäre des Gehirns zu entfernen und dann das Hirngewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Lassen Sie das Taschentuch am Boden des Röhrchens absetzen und ersetzen Sie dann die Lösung von der Oberseite der Scheiben durch fünf bis 10 Milliliter eiskalt. Hank-Lösung mit oder ohne fötales Rinderserum, wie oben angegeben, wobei die gesamte Lösung vollständig abgesaugt wird.Nach dem vierten Waschgang verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, um zwei Milliliter frisch zubereitete tryinhaltige Aufschlusslösung durch eine 0,2-Mikrometer-Spritze zu passieren. Direkt in das Röhrchen mit dem Hirngewebe filtrieren und die Trypsinisierung bei Raumtemperatur ablaufen lassen. Nach 13 Minuten neutralisieren Sie die Reaktion, indem Sie zuerst den größten Teil der Trypsinlösung aspirieren und dann sieben bis 10 Milliliter eiskalte Stranglösung mit fötalem Rinderserum hinzufügen.Spülen Sie dann das Gewebe in Hank-Lösung mit oder ohne fötales Rinderserum, wie gerade gezeigt. Als nächstes filtrieren Sie zwei Milliliter Dissoziationslösung auf das Gehirngewebe. Dissoziieren Sie dann die Zellen mechanisch mit einem sanften Trier 10 bis 20 Mal mit einem mit Watte verstopften, feuerpolierten PEs, Ihrer Pipette.Fahren Sie mit dem Trier fort, bis die sichtbaren Gewebestücke verschwunden sind. Warten Sie drei Minuten, bis sich die kleinen Stücke gesetzt haben, und verwenden Sie dann die PE-Pipette, um etwa 1,5 Milliliter der Lösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern eiskalter Hank-Lösung mit fötalem Rinderserum zu überführen, und schleudern Sie die Röhrchen 13 Minuten lang bei 185 g und vier Grad Celsius hinunter. Aspirieren Sie dann den Überstand vorsichtig mit derselben Pasteurpipette.Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter vorwarmem Beschichtungsmedium. Geben Sie dann etwa vier Milliliter Vorwärmmedium hinzu. Überführen Sie die Zellsuspension in einen unbeschichteten Kulturkolben T 25 und stellen Sie den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator.Spülen Sie die Zellen an einem Tag in vitro zweimal mit fünf Millilitern eiskaltem Beschichtungsmedium, einmal durch mehrmaliges leichtes Kippen des Kolbens in einer wirbelnden Bewegung, nach sechs bis neun Tagen in vitro geben Sie 100 Mikroliter Beschichtungsmaterial mit extrazellulären Matrixproteinen auf gläserne Deckgläser in einer Zellkulturschale und stellen Sie die Schale in den Zellkultur-Inkubator. Spülen Sie den Kolben am nächsten Tag, indem Sie die gesamte Lösung im Kolben ansaugen und etwa 13 Milliliter eiskalte Stranglösung hinzufügen. Saugen Sie dann die Lösung vollständig an.Als nächstes filtrieren Sie vier Milliliter einer Trypsin-EDTA-plus-DNA-Lösung direkt auf die Zellen und lassen die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator aus dem Zellkulturkolben dissoziieren. Nach 13 Minuten wird die Reaktion mit zwei Millilitern eiskaltem, 100 % fötalem Rinderserum neutralisiert und die Zellsuspension mit einer Pipette von fünf bis 10 Millilitern in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie dann die Zellen, indem Sie etwa vier Milliliter eiskalte Stranglösung mit fötalem Rinderserum hinzufügen, zentrifugieren und dann das Pellet in einem Milliliter vorwarmem Beschichtungsmedium suspendieren. Eins.Saugen Sie nun das Beschichtungsmaterial vollständig aus der Abdeckung ab, schieben Sie es und plattieren Sie ca. 50 Mikroliter der resuspendierten Gliazellen auf die Decksohlen. Um die Glia-Feeder-Schicht zu etablieren, inkubieren Sie die Gliazellen 20 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann einen Milliliter vorwarmes Beschichtungsmedium hinzu, einen auf jeden Deckglas, während das Beschichtungsmedium hinzugefügt wird. Es ist sinnvoll, mit einer weiteren Pipette auf den Umfang des Deckglases zu drücken, damit das Deckglas nicht im Medium schwimmt.Nach der Übernachtung Kultur. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter frisches Vorwärmmedium, einmal nach zwei bis drei Tagen. In vitro fügen Sie jeder Feeder-Layer-Kultur 10 Mikroliter eines mitotischen Inhibitors hinzu, um die DNA-Replikation und die Proliferation von Gliazellen nach sieben bis neun Tagen zu hemmen.Ersetzen Sie in vitro das Nährmedium durch das vorwarme Beschichtungsmedium zwei. Plattieren Sie dann vorsichtig etwa 50 bis 100 Mikroliter neuronaler Mauszellen in vorwarmem Plattierungsmedium zwei auf jede Glia-Feeder-Schicht. In diesem Bild wurde das Tour ein Gen aus genomischer DNA amplifiziert, isoliert aus den Schwanzclips von Neugeborenen, von Wildtyp-Heterozygoten und homozygoten Welpen des Knockin DYT One Dystonie-Modells.Deutlich zu erkennen sind separate Banden für das Wildtyp- und das mutierte Allel. In dieser Abbildung sind zwei repräsentative Felder aus einer neuronalen Kultur des Hippocampus der Maus dargestellt. Sie wurden aus der Hippocampusregion von Wildtyp-Mäusen aus CA drei und CA 1 erzeugt.14 Tage nach der Plattierung auf einer vorab festgelegten ca. drei, ca. einer hippokampalen Glia-Feeder-Schicht von Wildtyp-Mäusen in den differentiellen Interferenzkontrastbildern können Anzeichen einer guten Gesundheit, wie z.B. ein deutlicher Rand von neuronalen Zellkörper-ausgedehnten neuronalen Prozessen und eine relativ gleichmäßige Schicht von Gliazellen beobachtet werden. Weitere immunzytochemische Färbung für die neuronale Markerkarte. Zweitens, die Identifizierung der Neuronen und ihrer Prozesse in jedem Feld kann ebenfalls beobachtet werden.Mit diesem Protokoll kann eine Genotypisierung in einer Kulturrunde in 67 Stunden abgeschlossen werden. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für die Kultivierung von Neuronen von gentechnisch veränderten Mäusen, die einige Tage nach der Geburt sterben können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Das Video zeigt eine Technik zur Kultivierung primärer Astrozyten aus der Rattenrinde. Die Hirnrinde wird mechanisch dissoziiert, um eine homogene Gliazellsuspension zu erhalten, die dann auf Polypeptid-beschichteten Platten plattiert wird, um die selektive Proliferation von Astrozyten zu fördern. Anschließend werden die Astrozyten enzymatisch von den Platten dissoziiert und auf frische Medien überführt, was die Kultivierung reiner Astrozyten ermöglicht.

Generierung einer Primärkultur von Astrozyten aus dem Gehirn eines Rattenwelpen

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Lernen Sie die schnelle Genotypisierung von Neugeborenen-Mäusen und die Erzeugung primärer neuronaler Kulturen auf Gliazell-Feederschichten. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Studien an genetisch veränderten Mäusen.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

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