Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neugeborene Mäuse zu genotypisieren und neuronale Kulturen mit niedriger Dichte auf einer glialen Feeder-Schicht zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem neugeborene Mäuse im zweiten Schritt zunächst schnell mit ihren Schwanzspitzen genotypisiert werden. Am selben Tag werden die Gehirne präpariert und als Glia-Feeder-Schichten kultiviert.

Nach einigen Wochen wird dann eine weitere Gruppe neugeborener Mäuse schnell genotypisiert und neuronale Zellen aus dem Gehirn des Tieres für die Kultur auf den vorhergehenden Glia-Feeder-Schichten erzeugt. Letztlich kann diese Methode sowohl für eine schnelle und zuverlässige Genotypisierung als auch für die Erzeugung gesunder Neuronen und Gliazellen eingesetzt werden. Es gibt zwei Hauptvorteile dieses Protokolls.

Eine davon ist, dass wir gesunde Neuronen mit einer sehr geringen Dichte für bildgebende Experimente kultivieren können, indem wir sie auf eine fötale Gliaschicht aufschichten. Der zweite Vorteil besteht darin, dass neugeborene Mäuse innerhalb weniger Stunden genotypisiert werden können, was eine Übereinstimmung der Genotypen der Neuronen und der glialen fetalen Schicht ermöglicht. Ich bin ein wissenschaftlicher Mitarbeiter im Harta-Labor.

Ich werde die Verfahren zur Genotypisierung und Kulturen demonstrieren. Beginnen Sie damit, 200 Mikroliter DNA-Extraktionslösung in jedes PCR-Röhrchen zu geben, das eine Probe enthält. Legen Sie den Röhrchenstreifen in einen PCR-Thermocycler und starten Sie dann die DNA-Extraktion, wenn die Extraktion abgeschlossen ist.

Entfernen Sie den Schlauchstreifen aus dem Thermocycler und drehen Sie die Rohre fünfmal um. Übertragen Sie dann vier Mikroliter DNA-Extrakt von jeder Probe in ein unbenutztes Röhrchen auf einem Streifen mit acht Röhrchen und mischen Sie die Probe mit 10 Mikrolitern von zwei XPCR bereit. Mischen Sie zwei, zwei Mikroliter gemischte Vorwärts- und Rückwärtsprimer und vier Mikroliter nukleasefreies Wasser.

Legen Sie die Proben für jede Probe in einen Thermocycler und starten Sie das Temperaturwechselprogramm. Wenn das Programm beendet ist, laden Sie 20 Mikroliter jeder amplifizierten Probe oder jedes Molekulargewichtsmarkers direkt in die entsprechende Vertiefung eines Arous-Gels. Lassen Sie dann das Gel laufen und nehmen Sie Fluoreszenzbilder der Bänder unter ultraviolettem Licht auf.

Um die amplifizierten DNA-Produkte nachzuweisen, beginnen Sie damit, die interessierenden Regionen aus jeder Hemisphäre des Gehirns zu entfernen und dann das Hirngewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Lassen Sie das Taschentuch am Boden des Röhrchens absetzen und ersetzen Sie dann die Lösung von der Oberseite der Scheiben durch fünf bis 10 Milliliter eiskalt. Hank-Lösung mit oder ohne fötales Rinderserum, wie oben angegeben, wobei die gesamte Lösung vollständig abgesaugt wird.

Nach dem vierten Waschgang verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, um zwei Milliliter frisch zubereitete tryinhaltige Aufschlusslösung durch eine 0,2-Mikrometer-Spritze zu passieren. Direkt in das Röhrchen mit dem Hirngewebe filtrieren und die Trypsinisierung bei Raumtemperatur ablaufen lassen. Nach 13 Minuten neutralisieren Sie die Reaktion, indem Sie zuerst den größten Teil der Trypsinlösung aspirieren und dann sieben bis 10 Milliliter eiskalte Stranglösung mit fötalem Rinderserum hinzufügen.

Spülen Sie dann das Gewebe in Hank-Lösung mit oder ohne fötales Rinderserum, wie gerade gezeigt. Als nächstes filtrieren Sie zwei Milliliter Dissoziationslösung auf das Gehirngewebe. Dissoziieren Sie dann die Zellen mechanisch mit einem sanften Trier 10 bis 20 Mal mit einem mit Watte verstopften, feuerpolierten PEs, Ihrer Pipette.

Fahren Sie mit dem Trier fort, bis die sichtbaren Gewebestücke verschwunden sind. Warten Sie drei Minuten, bis sich die kleinen Stücke gesetzt haben, und verwenden Sie dann die PE-Pipette, um etwa 1,5 Milliliter der Lösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern eiskalter Hank-Lösung mit fötalem Rinderserum zu überführen, und schleudern Sie die Röhrchen 13 Minuten lang bei 185 g und vier Grad Celsius hinunter. Aspirieren Sie dann den Überstand vorsichtig mit derselben Pasteurpipette.

Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter vorwarmem Beschichtungsmedium. Geben Sie dann etwa vier Milliliter Vorwärmmedium hinzu. Überführen Sie die Zellsuspension in einen unbeschichteten Kulturkolben T 25 und stellen Sie den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator.

Spülen Sie die Zellen an einem Tag in vitro zweimal mit fünf Millilitern eiskaltem Beschichtungsmedium, einmal durch mehrmaliges leichtes Kippen des Kolbens in einer wirbelnden Bewegung, nach sechs bis neun Tagen in vitro geben Sie 100 Mikroliter Beschichtungsmaterial mit extrazellulären Matrixproteinen auf gläserne Deckgläser in einer Zellkulturschale und stellen Sie die Schale in den Zellkultur-Inkubator. Spülen Sie den Kolben am nächsten Tag, indem Sie die gesamte Lösung im Kolben ansaugen und etwa 13 Milliliter eiskalte Stranglösung hinzufügen. Saugen Sie dann die Lösung vollständig an.

Als nächstes filtrieren Sie vier Milliliter einer Trypsin-EDTA-plus-DNA-Lösung direkt auf die Zellen und lassen die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator aus dem Zellkulturkolben dissoziieren. Nach 13 Minuten wird die Reaktion mit zwei Millilitern eiskaltem, 100 % fötalem Rinderserum neutralisiert und die Zellsuspension mit einer Pipette von fünf bis 10 Millilitern in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie dann die Zellen, indem Sie etwa vier Milliliter eiskalte Stranglösung mit fötalem Rinderserum hinzufügen, zentrifugieren und dann das Pellet in einem Milliliter vorwarmem Beschichtungsmedium suspendieren. Eins.

Saugen Sie nun das Beschichtungsmaterial vollständig aus der Abdeckung ab, schieben Sie es und plattieren Sie ca. 50 Mikroliter der resuspendierten Gliazellen auf die Decksohlen. Um die Glia-Feeder-Schicht zu etablieren, inkubieren Sie die Gliazellen 20 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann einen Milliliter vorwarmes Beschichtungsmedium hinzu, einen auf jeden Deckglas, während das Beschichtungsmedium hinzugefügt wird. Es ist sinnvoll, mit einer weiteren Pipette auf den Umfang des Deckglases zu drücken, damit das Deckglas nicht im Medium schwimmt.

Nach der Übernachtung Kultur. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter frisches Vorwärmmedium, einmal nach zwei bis drei Tagen. In vitro fügen Sie jeder Feeder-Layer-Kultur 10 Mikroliter eines mitotischen Inhibitors hinzu, um die DNA-Replikation und die Proliferation von Gliazellen nach sieben bis neun Tagen zu hemmen.

Ersetzen Sie in vitro das Nährmedium durch das vorwarme Beschichtungsmedium zwei. Plattieren Sie dann vorsichtig etwa 50 bis 100 Mikroliter neuronaler Mauszellen in vorwarmem Plattierungsmedium zwei auf jede Glia-Feeder-Schicht. In diesem Bild wurde das Tour ein Gen aus genomischer DNA amplifiziert, isoliert aus den Schwanzclips von Neugeborenen, von Wildtyp-Heterozygoten und homozygoten Welpen des Knockin DYT One Dystonie-Modells.

Deutlich zu erkennen sind separate Banden für das Wildtyp- und das mutierte Allel. In dieser Abbildung sind zwei repräsentative Felder aus einer neuronalen Kultur des Hippocampus der Maus dargestellt. Sie wurden aus der Hippocampusregion von Wildtyp-Mäusen aus CA drei und CA 1 erzeugt.

14 Tage nach der Plattierung auf einer vorab festgelegten ca. drei, ca. einer hippokampalen Glia-Feeder-Schicht von Wildtyp-Mäusen in den differentiellen Interferenzkontrastbildern können Anzeichen einer guten Gesundheit, wie z.B. ein deutlicher Rand von neuronalen Zellkörper-ausgedehnten neuronalen Prozessen und eine relativ gleichmäßige Schicht von Gliazellen beobachtet werden. Weitere immunzytochemische Färbung für die neuronale Markerkarte. Zweitens, die Identifizierung der Neuronen und ihrer Prozesse in jedem Feld kann ebenfalls beobachtet werden.

Mit diesem Protokoll kann eine Genotypisierung in einer Kulturrunde in 67 Stunden abgeschlossen werden. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für die Kultivierung von Neuronen von gentechnisch veränderten Mäusen, die einige Tage nach der Geburt sterben können.