Name: Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Lernen Sie die Anreicherung synaptischer Plasmamembran- und Postsynaptische-Dichte-Proteine aus Gehirngewebe mittels diskontinuierlichem Saccharosegradienten und Ultrazentrifugation. Diese etablierte Methode ermöglicht die Analyse synaptischer Proteindynamik.

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Die Autoren danken Dr. Mike Ehlers und seinen Labormitgliedern für die ursprüngliche Demonstration des Protokolls für die subzelluläre Fraktionierung von synaptischen Plasmamembranen. Wir danken auch Wendy Horsfall für das Management der Mäusekolonien. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse des CIHR (AJR und AS) unterstützt.

Das folgende Protokoll entspricht den Richtlinien des Canadian Council der Tierpflege und wurde von der Fakultät für Medizin und Pharmazie Animal Care Committee an der Universität von Toronto genehmigt worden. 1. Bereiten Sie benötigten Reagenzien, wie in Tabelle 1 beschrieben, <ol><li> Hinzufügen Protease und Phosphatase (falls erforderlich) Inhibitoren für alle Saccharoselösungen, Puffer und ddH 2 O, die in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen. Wichtig: Führen alle Schritte bei 4 ° C und vor-kühlen alle Reagenzien und Ausrüstung vor dem Start des Experiments. Kennzeichnen Sie alle Rohre, einschließlich Ultrazentrifuge Rohre, mit Permanentmarker. </li></ol> 2. Präparation der entsprechende Hirnregion <ol><li> Opfern das Tier durch Genickbruch oder Enthauptung. Haus und einschläfern Tiere in Einklang mit den institutionellen und Regierungspolitik auf die Tierpflege. </li><li> Schnell zu entfernen the Gehirn aus dem Schädel und Platz auf einer gekühlten Dissektion Block. </li><li> Präparieren Sie die entsprechende Hirnregion aus frischem Gewebe und fahren Sie mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Gewebehomogenisierung mit Motor Driven Glas-Teflon-Homogenisator <ol><li> Zeigen 50-100 mg (für SPM) oder 100-200 mg (PSD) des sezierten Gewebe in einem markierten 13 ml Polypropylen-Röhrchen mit 4 ml 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung. Übertragen Sie die Probe in ein 15 ml Glas-Kegel Teflon Gewebemühle / Homogenisator, stellen Sie den Motorantrieb bis 900 Umdrehungen pro Minute (Stufe 7) und homogenisieren die Probe mit 12 Schlägen über einen Zeitraum von 30 Sekunden. Verwenden Sie eine andere Glas-Teflon-Homogenisator zwischen den Proben, oder spülen Sie den Homogenisator mit kaltem destilliertem Wasser zwischen den Proben und wischen Sie mit einem trockenen Kimwipe. HINWEIS: Bis zu 4 g Gewebe kann in 4 ml 0,32 M HEPES-gepufferten Saccharoselösung homogenisiert werden jedoch ratsam, weniger Gewebe verwenden, um die richtige Fraktionierung gewährleisten, ist es. </li><li> Übertragen Sie die Probe homogenisiert zurück to die gleiche 13 ml Polypropylen-Röhrchen. Reserve 100 ul Homogenat und bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinfraktion. </li></ol> 4. Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um die Kernfraktion entfernen (Renditen Überstand S1) <ol><li> Zentrifuge das Homogenat in einem Festwinkelrotor bei 900 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Den Überstand (S1) zu einem neuen, markierten 13-ml-Röhrchen und resuspendieren Kernfraktion Pellet (P1) in 500 ul 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose. HINWEIS: Die (P1) Fraktion kann bei -80 ° C gelagert und für die Western-Blot-Analyse der Kernfraktion benutzt werden. </li></ol> 5. Anreicherung des Crude Synaptosomale Fraktion (Pellet Renditen P2) <ol><li> Zentrifugieren der Überstand (S1) bei 10.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. Entfernen Sie den Überstand (S2) und Reserve 500 ul in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C für die spätere Protein Quant speichernkation und Western-Blot-Analyse der cytosolischen / Licht Membranfraktion. Resuspendieren verbleibende rohe synaptosomale Fraktion Pellet (P2) in 1 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung und dann einen weiteren 3 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. </li><li> Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C ist. Den Überstand (S2) und Reserve 500 ul in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse der cytosolischen / Licht Membranfraktion zu speichern. Speichern Sie die gewaschene rohe synaptosomale Pellet (P2 &#39;) in der Polypropylen-Röhrchen. </li></ol> 6. Lysing (Hypoosmotische Shock) der rohen Synaptosomale Fraktion <ol><li> Lyse der rohe synaptosomale Pellet (P2 &#39;) in Polypropylenröhrchen durch Resuspendieren in 1 ml ddH 2 O. Fügen Sie weitere 3 ml ddH2O, Transfer zu einem Glas-Teflon-Gewebe-Homogenisator und homogenisieren von Hand mit 3 Schlägen. HINWEIS: Es ist wichtig,diesen Schritt so schnell wie möglich durchzuführen und schnell gehen Sie zu Schritt 6.2. </li><li> Übertragungs Proben aus dem Homogenisator in denselben 13 ml Polypropylenröhrchen und schnell einstellen Probe wieder auf 4 mM HEPES mit 16 ul 1 M HEPES-Lösung zum Mischen umgekehrt. </li><li> Drehen Proben bei 4 ° C für 30 Minuten, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. </li></ol> 7. Anreicherung des Synaptosomale Membranfraktion (P3) <ol><li> Zentrifuge bei 25.000 x g für 20 min bei 4 ° C ist. Entfernen des rohen vesikulären Fraktion Stand (S3) und behalten sie in einem 5-ml-Röhrchen bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse zu speichern. Resuspendieren synaptosomalen Membranfraktion (P3) in 1 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. </li></ol> 8. Vorbereitung der diskontinuierlichen Saccharosegradienten <ol><li> Pipette genau 3,5 ml 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung und exakt 3,0 ml von 1,0 M und 0,8 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung in separate 6 ml Snap Cap Röhren. ANMERKUNG: Dies geschieht vor Messung der Volumina der Puffer, die verwendet werden, um den Saccharose-Gradienten bilden. Genaue Messung der Volumina ist wichtig, um sicherzustellen, dass die resultierenden Verläufe für Ultrazentrifugation ausgeglichen werden. </li><li> Mit einer Glaspasteurpipette und Birne, übertragen 1.2 M HEPES-gepufferten Saccharoselösung zu den 12 ml Polyallomer Ultrazentrifugenröhrchen. Schicht sorgfältig die 1,0 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung auf der Oberseite der 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. Schließlich Schicht das 0,8 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung auf der Oberseite der 1,0 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. Verwenden Sie eine frische Pasteur-Pipette für jedes Saccharose-Lösung und kümmern uns nicht um die Saccharose-Gradienten zu stören. Vibrationen von einer Bank oder Mikrowirbel wird die Integrität des Gradienten zu stören. </li><li> Verwendung einer Pasteur-Pipette resuspendiert Schicht die synaptosomale Membranfraktion (P3) auf der Oberseite des vorbereiteten diskontinuierlichen Saccharosegradienten.Stellen Sie sicher, dass die Gradienten durch Wiegen sie in den Eimer des Schwingbecherrotor ausgeglichen. Wenn die Eimer nicht ausgeglichen sind, verwenden Sie ein P200-Pipette vorsichtig hinzufügen 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose an die Spitze des Gradienten und das Gleichgewicht der Rotorschaufeln. </li></ol> 9. Fraktionierung der synaptischen Plasmamembran (SPM) <ol><li> Ultrazentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor bei 150.000 × g für 2 h bei 4 ° C ist. Die Saccharose-Gradienten vorsichtig aus dem Eimer Ultrazentrifuge. Verwendung einer 18 G-Nadel und einer 1 ml-Spritze durchstoßen das Rohr an der Unterseite der 1,0 M / 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung Interphase und zieht die synaptischen Plasmamembranschicht (SPM). </li><li> Notieren Sie sich die Lautstärke, die jedes SPM Probe in der 1 ml Spritze einnimmt. Legen Sie die gesammelten SPM Schicht in 3,5 ml dickwandigen Rohren Ultrazentrifuge, fügen Sie genau 2,5 Volumen 4 mM HEPES, um die Saccharose-Konzentration von 1,2 m bis 0,32 M. einstellen Sobald jeder Probe wurde einstellened auf 0,32 M Saccharose, mit 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung das Gleichgewicht der Rohre. </li><li> Ultrazentrifuge in einem Festwinkelrotor bei 200.000 × g für 30 min bei 4 ° C ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren synaptischen Plasmamembranpellet (SPM) in 300 ul 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. Proben bei -80 ° C bis zur Western-Blot verwendet. </li></ol> 10. Herstellung der postsynaptischen Dichte Fraktion (PSD) <ol><li> Auftauen SPM Proben auf Eis. </li><li> Machen Sie eine Lösung von 0,54% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. </li><li> In einem 5 ml-Polystyrolröhrchen, kombinieren 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-Lösung und 300 ul SPM Fraktion und Drehen der Probe für 15 min bei 4 ° C </li><li> Übertragungs Proben zu 3,5 ml dickwandiger Rohre Ultrazentrifuge und Zentrifugenproben bei 32.000 × g für 20 min bei 4 ° C ist. </li><li> Reservieren Sie den Überstand (Triton X-100 löslichen Fraktion [TS]) und bei -80, ° C. HINWEIS: In dieser Stufe wird das Pellet stellt die &quot;PSD-1T&quot; Fraktion. Eine zweite Behandlung mit Reinigungsmittel ein &quot;PSD-2T&quot; Fraktion zu produzieren. Wenn eine PSD-1T-Fraktion gewünscht wird, gehen Sie zu Schritt 10.6. <ol><li> Um ein PSD-2T Fraktion produzieren, das Pellet in 3 ml 0,5% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. Drehen Proben für 15 min bei 4 ° C ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 32.000 g für 20 min bei 4 ° C und gehen Sie zu Schritt 10.6. </li></ol></li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren postsynaptischen (PSD) Pellet in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. HINWEIS: Die Resuspension Volumen kann von der Größe der Pellets ab; ein Volumen von 50-75 ul empfohlen. Weil der PSD-Fraktion eine Waschmittel-unlöslichen Fraktion, ist es oft notwendig, 1-2 ul 0,5% SDS in den vollständigen Resuspendierung des Proteins zu ermöglichen. Proben bei -80 ° C bis zur Western-Blot verwendet. </li></ol>

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<li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner%3A+conserved+Pex5p+WXXXF%2FY+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li>
<li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li>
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<li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li>
<li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Es gibt mehrere Schritte in der Prozedur, die entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis sind. In Schritt 3 ist es wichtig, dass ein gleichmäßiger Grad der Homogenisierung wird für jede Probe erreicht. Beim Homogenisieren Gewebe mit dem Motor angetrieben Homogenisator wird eine konstante Geschwindigkeit nicht nur für die Drehbewegung des Stößels, sondern auch mit der Anzahl von Hüben. Die Inkubationszeit bei der osmotischen Schock sollten präzise sein, da längere Homogenisierung oder Inkubation in der hypotonischen Lös...

Neuronen kommunizieren über Synapsen und die Qualität dieser Kommunikation wird durch Veränderungen in der Zusammensetzung der Proteine ​​an der Synapse weitgehend reguliert. Insbesondere die Proteine ​​in der postsynaptischen Dichte liegt in der neuronalen Kommunikation teilnehmen, die durch inniges Gerüst Neurotransmitter-Rezeptoren mit ihren Signalübertragungssysteme 1. Weiterhin sind dauerhafte Änderungen in der Stärke der synaptischen Wirksamkeit durch Zugabe oder Entfernung von Rezeptoren an der postsynaptischen Dichte 1-6 gesteuert. Daher ist die Isolierung und Quantifizierung der synaptischen Proteinen eine notwendige und nützliche Technik, um einen Einblick in die Möglichkeiten, die Nervenzellen reagieren auf Reize und verändern synaptischen Wirksamkeit 7 zu gewinnen. Dieser Artikel beschreibt eine übliche Technik, synaptischen Proteinen aus Hirngewebe von Nagern durch Ultrazentrifugation auf diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten zu isolieren. Die synaptischen Plasmamembranfraktion angereichert und isoliert werden, basierend aufseine Dichte in Saccharose, die empirisch bestimmt worden ist, ähnlich zu 1,2 M Saccharose ist. Je nachdem welche biologischen Frage kann subzellulären Fraktionen durch kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Gradienten von Saccharose oder Percoll getrennt werden. Kontinuierlichen Gradienten ermöglichen die Trennung von Proteinen in mehrere Fraktionen; Dies kann besonders nützlich sein, um die Co-Lokalisierung von Proteinen in einer gegebenen Fraktion 8 zeigen. Jedoch ist die Herstellung von kontinuierlichen Gradienten mühsamer und unnötig für viele Anwendungen. Diskontinuierlichen Gradienten vergleichsweise leichter herzustellen und kann verwendet werden, um Proteine ​​in wenigen, allgemein definierten Fraktionen zu trennen. Diskontinuierlichen Gradienten, der aus drei Schichten von Saccharose Erhöhung Molarität bestehen in großem Umfang verwendet, um Proteine, die mit den synaptischen Plasmamembran (SPM) zugeordnet isolieren. Diese synaptischen Plasmamembranfraktion kann weiter auf der postsynaptischen Dichte fractio verarbeitet werdenn (PSD) durch Detergensbehandlung und Isolierung der Waschmittel-unlöslichen Fraktion. Wenn dieses Verfahren wurde zuerst in den 1960er Jahren 9,10 beschrieben wurde Elektronenmikroskopie verwendet, um die Organellen und Membranen, die in etwa definieren die synaptischen Plasmamembran und postsynaptischen Dichte Fraktionen 9-14 demonstrieren. Diese Studien zeigten, die Aufnahme von prä-und postsynaptischen Membranen und synaptischen Vesikeln in der SPM-Fraktion; nach Detergens-Behandlung vor allem die Elektronendichte, waren postsynaptischen Dichten sichtbar. In dem Verfahren wird ein hypotonischen Schock verwendet, um aus dem Zellkörper 10 abzuklemmen die synaptischen Prozessen. Dieser Schritt nutzt die Tatsache, dass Mitochondrien sind resistenter gegen osmotischen Schock und intakt bleiben, so dass sie an der Unterseite des Saccharosegradienten (Figur 1) zu sedimentieren. Mit dem gleichen Anreicherungstechnik, waren die SPM und PSD-Fraktionen erste biochemischdurch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Sequenzierung der Hauptproteinkomponenten 15-17. Anschließend Western Blot-Analyse wurde verwendet, um zu detektieren und zu quantifizieren, die Pegel der synaptischen Proteinen und definieren diese Fraktionen weiter (Figur 2). Wir haben diese Technik in unseren Laboratorien verwendet, um Änderungen in der synaptischen Ebenen der Dopamin-Transporter, wenn das SLC6A3-Locus in der Maus 18 doppelt auftreten, zu quantifizieren. Wir haben auch diese Technik in NMDA-Rezeptor-defizienten Mäusen verwendet, um Synapse-spezifische Verringerung der Proteine, die Teil des DISC1 Interaktom 19 aufzudecken. Es ist aus Western-Blot-Analyse, die SPM Fraktionen enthalten synaptische Vesikel Membranproteine, Endosomen-Marker, mitochondriale Proteine, membranassoziierten synthetische Enzyme und Signaltransduktion Moleküle sowie als integrierte Komponenten der postsynaptischen Dichte und synaptischen Plasmamembranen 20-23. Even PSD Fraktionen Kontamination mit reichlich mitochondriale Proteine ​​und es kann notwendig, um einen zweiten Gradienten Sedimentation oder zusätzliche Reinigungsschritte durchzuführen, um diese 13 zu entfernen. Kürzlich wurde die quantitative Massenspektrometrie eine Liste von über 100 Proteinen in der postsynaptischen Dichte allein, sowie einen Hinweis auf die relative Menge dieser Komponenten 24,25 vorgesehen.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7,4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &frac12; &rdquo; Nadel</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glas Teflon Homogenisator Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Modell RW 16 Basisrührer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 Festwinkelrotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Zentrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Polyallomer-Röhrchen (13,2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotorschwingschaufel</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 Boden-Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dickwandige Polycarbonat-Röhrchen (3,5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 Festwinkelrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 Tisch-Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der synaptischen plasmamembran und postsynaptische dichte proteinen mit einer diskontinuierlichen saccharosegradienten

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronale subzellulärer Fraktionierung Techniken erlauben die Quantifizierung von Proteinen, die in und aus der Synapse gehandelt werden. Wie ursprünglich in den späten 1960er Jahren beschrieben, können Proteine, die mit den synaptischen Plasmamembran assoziiert durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Dichtegradienten isoliert werden. Sobald synaptischen Membranen isoliert werden, kann der makromolekularen Komplex postsynaptischen Dichte bekannt anschließend aufgrund seiner Unlöslichkeit Reinigungsmittel isoliert werden. Die zur synaptischen Plasmamembranen und postsynaptischen Dichte Proteine ​​zu isolieren Techniken im Wesentlichen gleich bleiben nach 40 Jahren, und sind weit verbreitet in der aktuellen neurowissenschaftlichen Forschung. Dieser Artikel beschreibt die Fraktionierung von Proteinen mit der synaptischen Plasmamembran und postsynaptischen Dichte mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Resultierenden Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Die Vorbereitung der Saccharosedichtegradienten sollten in einer klaren Trennung der drei Mol-Lösungen von Saccharose (0,8, 1,0 und 1,2 M Saccharose) führen. Siehe 3A ein Beispiel des Verlaufs bevor die Proteinprobe zugegeben. Wenn der Gradient zu viel im Voraus vorbereitet, oder wenn es auf einer Arbeitsfläche, mit Vibrationen von anderen Geräten hergestellt, wird der Gradient verglichen werden kann und korrekte Trennung nicht erreicht werden. Wenn eine klare Trennung der drei Lösungen nicht sichtbar i...

Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine ​​wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die subzelluläre Fraktionierung von Hirngewebe unter Verwendung eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten zu demonstrieren, um Proteine aus den synaptischen Membranen und postsynaptischen Dichten anzureichern. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hirngewebe mit einem angetriebenen Homogenisator homogenisiert wird. Als nächstes folgt eine Reihe von Zentrifugationsschritten zur Herstellung von Rohmembranproteinextrakten.Die Membranextrakte werden dann für die Ultrazentrifugation auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteine aus dem Gradienten zu sammeln. Letztendlich können die Ergebnisse Veränderungen der synaptischen Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse zeigen.Dies ist eine gut etablierte Technik, die seit über 40 Jahren von Neurowissenschaftlern verwendet wird. Wir nutzen es in unserem Labor, um zu verstehen, wie sich die Proteinzusammensetzung der Synapse verändert, wenn wir verschiedene Neurotransmitter-Systeme stören. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. Gradienten pro Aufruf oder kontinuierlichen Saccharosegradienten, be

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Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Die Identifizierung von Molekülen und Signalwegen, die die synaptische Plastizität und das Gedächtnis steuern, ist immer noch eine große Herausforderung in den Neurowissenschaften. Hier wird ein Arbeitsablauf beschrieben, der sich mit der relativen Quantifizierung von synaptischen Proteinen befasst, die angeblich an der molekularen Reorganisation von Synapsen während des Lernens und der Gedächtniskonsolidierung in einem auditorischen Lernparadigma beteiligt sind.

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Dieses Protokoll stellt eine robuste, detaillierte Methode dar, um hochreine Synaptosomen, synaptische Vesikel und andere synaptische Fraktionen aus dem Mausgehirn zu erhalten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung synaptischer Prozesse, einschließlich der biochemischen Analyse der Proteinlokalisation und -funktion mit kompartimentärer Auflösung.

Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Lernen Sie die Anreicherung synaptischer Plasmamembran- und Postsynaptische-Dichte-Proteine aus Gehirngewebe mittels diskontinuierlichem Saccharosegradienten und Ultrazentrifugation. Diese etablierte Methode ermöglicht die Analyse synaptischer Proteindynamik.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

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