Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten
September 3rd, 2014
Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die subzelluläre Fraktionierung von Hirngewebe unter Verwendung eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten zu demonstrieren, um Proteine aus den synaptischen Membranen und postsynaptischen Dichten anzureichern. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hirngewebe mit einem angetriebenen Homogenisator homogenisiert wird. Als nächstes folgt eine Reihe von Zentrifugationsschritten zur Herstellung von Rohmembranproteinextrakten.
Die Membranextrakte werden dann für die Ultrazentrifugation auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteine aus dem Gradienten zu sammeln. Letztendlich können die Ergebnisse Veränderungen der synaptischen Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse zeigen.
Dies ist eine gut etablierte Technik, die seit über 40 Jahren von Neurowissenschaftlern verwendet wird. Wir nutzen es in unserem Labor, um zu verstehen, wie sich die Proteinzusammensetzung der Synapse verändert, wenn wir verschiedene Neurotransmitter-Systeme stören. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. Gradienten pro Aufruf oder kontinuierlichen Saccharosegradienten, besteht darin, dass diskontinuierliche Saccharosegradienten einfacher von Hand erstellt werden können.
Bei diesem Protokoll wird ein motorbetriebener Teflon-Homogenisator aus Glas verwendet, der den Stößel zwischen den Proben immer auswechselt und spült und trocknet. Der Homogenisator lädt zunächst das präparierte Gewebe in ein 13-Milliliter-Röhrchen mit vier Millilitern 0,32 molar gepufferter HEPA-Saccharoselösung. Übertragen Sie dann das Tuch in einen sauberen Glashomogenisator.
Stellen Sie den Motor auf 900 U/min ein und homogenisieren Sie die Probe mit 12 Hüben über 30 Sekunden mit weniger als vier Gramm Gewebe, um eine gute Fraktionierung zu gewährleisten, übertragen Sie die Probe zurück in das Röhrchen und lagern Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot bei minus 80 Grad Celsius für die Proteinanalyse. Als nächstes trennen Sie das Kernmaterial, indem Sie das Homogenat 10 Minuten lang bei 900 G drehen. Bei vier Grad Celsius wird der Überstand in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.
Der Überstand enthält die rohe Membranfraktion. Um nun für die grobe Synaptosomenzentrifuge den Überstand bei 10.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius anzureichern, entfernen Sie den Überstand. Das Pellet enthält die rohe Synaptosomenfraktion Resus.
Suspendieren Sie es in einem Milliliter 0,32 molare Saccharoselösung. Dann bei weiteren drei Millilitern Lösung zur Suspensionszentrifuge die Rohfraktion 15 Minuten lang. Bei 10.000 G bei vier Grad Celsius den Überstand entfernen. Läuse nun das Pellet schnell, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter reinem Wasser.
Dann schnell weitere drei Milliliter Wasser hinzufügen. Übertragen Sie dies auf den Homogenisator. Führen Sie drei Striche mit der Hand aus und übertragen Sie sie zurück in die 13-Milliliter-Tube.
Stellen Sie die Probe schnell wieder auf vier Millimolare HEAs ein, fügen Sie 16 Mikroliter einmolekulare HEAs hinzu und mischen Sie sie durch Inversion. Legen Sie nun die Probe für eine halbe Stunde bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Um die Probenlyse zu gewährleisten, beenden Sie die Fraktionierung, indem Sie die Lysierte P mit zwei Primfraktionen pelletieren.
Schleudern Sie es bei 25.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius herunter, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Saccharoselösung. Diese enthält die angereicherten episomalen Synap-Membranen. Messen Sie zunächst die Puffer vor, um einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten zu erstellen.
Laden Sie drei Röhrchen wie folgt, eines mit genau 3,5 Millilitern 1,2 molaren Häufchen gepufferter Saccharoselösung. Ein weiteres mit genau drei Millilitern 1,0 molaren Lösungen und das dritte mit drei Millilitern 0,8 molaren Lösungen. Übertragen Sie anschließend mit einer Glaspipette die 1,2-molare Saccharoselösung in ein 12-Milliliter-Polymer-Ultrazentrifugenröhrchen.
Mit einer neuen Pipette die 1,0-molare Lösung vorsichtig auf die 1,2-molare Lösung aufschichten. Stören Sie die 1,2-molare Lösung nicht und führen Sie keine Blasen mit der Pipette ein. Verwenden Sie die gleiche Technik, um die 0,8-molare Lösung darauf zu schichten.
Seien Sie vorsichtig. Kleine Vibrationen von einem Tischwirbel oder einer Mikrozentrifuge reichen aus, um die Integrität des Gradienten zu stören. Es ist wichtig, die Farbverläufe sorgfältig und effizient zu erstellen.
Wenn es zu lange dauert oder der Gradient Vibrationen ausgesetzt ist, können Sie die synaptischen Membranen in den späteren Schritten nicht wiederherstellen. Nun mit einer weiteren Pastor-Pipette die angereicherte episomale Synap-Membranfraktion auf den vorbereiteten Gradienten auflegen. Gleichen Sie das Gefälle in einer Ultrazentrifuge in einem schwingenden Schaufelrotor präzise aus.
Dann schleudern Sie es zwei Stunden lang bei 150.000 G bei vier Grad Celsius herunter. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie den Gradienten nach der Zentrifugation aus dem Eimer nehmen, es sollten klare Streifen aus Saccharoselösung vorhanden sein. Mit Proteinfraktionen an jeder Grenzfläche und einem Pellet sollten die Fraktionen nicht diffus sein.
Mit einer 18-Gauge-Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze stechen Sie den untersten Teil der 1,2-molaren Grenzfläche und ziehen die weiße Proteinbande heraus, die die synaptischen Plasmamembranen enthält. Notieren Sie das Volumen dieser Ebene. Übertragen Sie die Schicht auf ein 3,5 Milliliter dickwandiges Ultrazentrifugenröhrchen.
Fügen Sie genau 2,5 Volumina von vier millimolaren HEAs hinzu. Bereiten Sie dann ein Ausgleichsröhrchen mit 0,32 molar HEAs gepufferter Saccharoselösung in einem Festwinkelrotor vor und ultrazentrifugieren Sie die Probe bei 200.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann die Senna und resuspendieren Sie das synaptische Plasmamembran-Pellet.
In 300 Mikrolitern 50 Millimolar HEAs zwei Millimolare EDTA-Lösung. Die postsynaptische Dichtefraktion oder PSD-Fraktion kann nun durch weitere Anwendung der gleichen Techniken gesammelt werden. Die Schritte sind im Textprotokoll klar umrissen.
Ein Western Blot wurde mit einem Gesamtprotein, der synaptischen Plasmamembran und ersten postsynaptischen Dichteproteinfraktionen durchgeführt. Die PSD-Fraktion wurde nur einer Waschmittelbehandlung unterzogen, und das Gewebe stammte aus dem Striatum der Maus. Präsynaptische Proteine wie der Dopamintransporter werden in der SPM-Fraktion angereichert, aber im anschließenden Detergenzschritt zur PSD-Anreicherung eliminiert.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben auf Eis zu legen und Protease- und Phosphatasehemmer nach diesem Verfahren einzuschließen. Andere Methoden wie die westliche Blutanalyse oder die zweidimensionale Gelelektrophorese können durchgeführt werden. Dann können Sie Fragen beantworten, wie z.B. wie sich die medikamentöse Behandlung auf die Rezeptorspiegel an der Synapse auswirkt.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen, die mit der synaptischen Plasmamembran assoziiert sind, durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten. Das Verfahren demonstriert die subzelluläre Fraktionierung von Hirngewebe zur Anreicherung von Proteinen aus synaptischen Membranen und postsynaptischen Dichten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Proteinanalyse
Hintergrund
- Das Verständnis der synaptischen Proteinspiegel ist entscheidend für die neurowissenschaftliche Forschung.
- Synaptische Membranen und postsynaptische Dichten spielen eine Schlüsselrolle bei der neuronalen Kommunikation.
- Ultrazentrifugation ist eine Standardtechnik zur Proteinanreicherung.
- Western Blotting und 2D DIGE sind gängige Methoden zur Proteinanalyse.
Zweck der Studie
- Anreicherung von Proteinen aus synaptischen Membranen und postsynaptischen Dichten.
- Vorbereitung von Proteinextrakten für weitere Analysen.
- Demonstration der Wirksamkeit eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten bei der Proteinanreicherung.
Verwendete Methoden
- Homogenisierung von Hirngewebe mit einem elektrischen Homogenisator.
- Reihe von Zentrifugationsschritten zur Vorbereitung von Rohproteinextrakten aus Membranen.
- Aufschichten von Membranextrakten auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten.
- Ultrazentrifugation zur Sammlung von Proteinen aus dem Gradienten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anreicherung von Proteinen der synaptischen Plasmamembran.
- Vorbereitung von Proteinen der postsynaptischen Dichte für die Analyse.
- Ergebnisse können Veränderungen der synaptischen Proteinspiegel anzeigen.
- Geeignet für Western Blot-Analyse und 2D DIGE.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bereichert effektiv Proteine aus synaptischen Membranen.
- Bietet eine Grundlage für die Untersuchung der Dynamik synaptischer Proteine.
- Kann auf verschiedene Fragestellungen der neurowissenschaftlichen Forschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
