Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten
3. September 2014
Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die subzelluläre Fraktionierung von Hirngewebe unter Verwendung eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten zu demonstrieren, um Proteine aus den synaptischen Membranen und postsynaptischen Dichten anzureichern. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hirngewebe mit einem angetriebenen Homogenisator homogenisiert wird. Als nächstes folgt eine Reihe von Zentrifugationsschritten zur Herstellung von Rohmembranproteinextrakten.
Die Membranextrakte werden dann für die Ultrazentrifugation auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteine aus dem Gradienten zu sammeln. Letztendlich können die Ergebnisse Veränderungen der synaptischen Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse zeigen.
Dies ist eine gut etablierte Technik, die seit über 40 Jahren von Neurowissenschaftlern verwendet wird. Wir nutzen es in unserem Labor, um zu verstehen, wie sich die Proteinzusammensetzung der Synapse verändert, wenn wir verschiedene Neurotransmitter-Systeme stören. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. Gradienten pro Aufruf oder kontinuierlichen Saccharosegradienten, besteht darin, dass diskontinuierliche Saccharosegradienten einfacher von Hand erstellt werden können.
Bei diesem Protokoll wird ein motorbetriebener Teflon-Homogenisator aus Glas verwendet, der den Stößel zwischen den Proben immer auswechselt und spült und trocknet. Der Homogenisator lädt zunächst das präparierte Gewebe in ein 13-Milliliter-Röhrchen mit vier Millilitern 0,32 molar gepufferter HEPA-Saccharoselösung. Übertragen Sie dann das Tuch in einen sauberen Glashomogenisator.
Stellen Sie den Motor auf 900 U/min ein und homogenisieren Sie die Probe mit 12 Hüben über 30 Sekunden mit weniger als vier Gramm Gewebe, um eine gute Fraktionierung zu gewährleisten, übertragen Sie die Probe zurück in das Röhrchen und lagern Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot bei minus 80 Grad Celsius für die Proteinanalyse. Als nächstes trennen Sie das Kernmaterial, indem Sie das Homogenat 10 Minuten lang bei 900 G drehen. Bei vier Grad Celsius wird der Überstand in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.
Der Überstand enthält die rohe Membranfraktion. Um nun für die grobe Synaptosomenzentrifuge den Überstand bei 10.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius anzureichern, entfernen Sie den Überstand. Das Pellet enthält die rohe Synaptosomenfraktion Resus.
Suspendieren Sie es in einem Milliliter 0,32 molare Saccharoselösung. Dann bei weiteren drei Millilitern Lösung zur Suspensionszentrifuge die Rohfraktion 15 Minuten lang. Bei 10.000 G bei vier Grad Celsius den Überstand entfernen. Läuse nun das Pellet schnell, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter reinem Wasser.
Dann schnell weitere drei Milliliter Wasser hinzufügen. Übertragen Sie dies auf den Homogenisator. Führen Sie drei Striche mit der Hand aus und übertragen Sie sie zurück in die 13-Milliliter-Tube.
Stellen Sie die Probe schnell wieder auf vier Millimolare HEAs ein, fügen Sie 16 Mikroliter einmolekulare HEAs hinzu und mischen Sie sie durch Inversion. Legen Sie nun die Probe für eine halbe Stunde bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Um die Probenlyse zu gewährleisten, beenden Sie die Fraktionierung, indem Sie die Lysierte P mit zwei Primfraktionen pelletieren.
Schleudern Sie es bei 25.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius herunter, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Saccharoselösung. Diese enthält die angereicherten episomalen Synap-Membranen. Messen Sie zunächst die Puffer vor, um einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten zu erstellen.
Laden Sie drei Röhrchen wie folgt, eines mit genau 3,5 Millilitern 1,2 molaren Häufchen gepufferter Saccharoselösung. Ein weiteres mit genau drei Millilitern 1,0 molaren Lösungen und das dritte mit drei Millilitern 0,8 molaren Lösungen. Übertragen Sie anschließend mit einer Glaspipette die 1,2-molare Saccharoselösung in ein 12-Milliliter-Polymer-Ultrazentrifugenröhrchen.
Mit einer neuen Pipette die 1,0-molare Lösung vorsichtig auf die 1,2-molare Lösung aufschichten. Stören Sie die 1,2-molare Lösung nicht und führen Sie keine Blasen mit der Pipette ein. Verwenden Sie die gleiche Technik, um die 0,8-molare Lösung darauf zu schichten.
Seien Sie vorsichtig. Kleine Vibrationen von einem Tischwirbel oder einer Mikrozentrifuge reichen aus, um die Integrität des Gradienten zu stören. Es ist wichtig, die Farbverläufe sorgfältig und effizient zu erstellen.
Wenn es zu lange dauert oder der Gradient Vibrationen ausgesetzt ist, können Sie die synaptischen Membranen in den späteren Schritten nicht wiederherstellen. Nun mit einer weiteren Pastor-Pipette die angereicherte episomale Synap-Membranfraktion auf den vorbereiteten Gradienten auflegen. Gleichen Sie das Gefälle in einer Ultrazentrifuge in einem schwingenden Schaufelrotor präzise aus.
Dann schleudern Sie es zwei Stunden lang bei 150.000 G bei vier Grad Celsius herunter. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie den Gradienten nach der Zentrifugation aus dem Eimer nehmen, es sollten klare Streifen aus Saccharoselösung vorhanden sein. Mit Proteinfraktionen an jeder Grenzfläche und einem Pellet sollten die Fraktionen nicht diffus sein.
Mit einer 18-Gauge-Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze stechen Sie den untersten Teil der 1,2-molaren Grenzfläche und ziehen die weiße Proteinbande heraus, die die synaptischen Plasmamembranen enthält. Notieren Sie das Volumen dieser Ebene. Übertragen Sie die Schicht auf ein 3,5 Milliliter dickwandiges Ultrazentrifugenröhrchen.
Fügen Sie genau 2,5 Volumina von vier millimolaren HEAs hinzu. Bereiten Sie dann ein Ausgleichsröhrchen mit 0,32 molar HEAs gepufferter Saccharoselösung in einem Festwinkelrotor vor und ultrazentrifugieren Sie die Probe bei 200.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann die Senna und resuspendieren Sie das synaptische Plasmamembran-Pellet.
In 300 Mikrolitern 50 Millimolar HEAs zwei Millimolare EDTA-Lösung. Die postsynaptische Dichtefraktion oder PSD-Fraktion kann nun durch weitere Anwendung der gleichen Techniken gesammelt werden. Die Schritte sind im Textprotokoll klar umrissen.
Ein Western Blot wurde mit einem Gesamtprotein, der synaptischen Plasmamembran und ersten postsynaptischen Dichteproteinfraktionen durchgeführt. Die PSD-Fraktion wurde nur einer Waschmittelbehandlung unterzogen, und das Gewebe stammte aus dem Striatum der Maus. Präsynaptische Proteine wie der Dopamintransporter werden in der SPM-Fraktion angereichert, aber im anschließenden Detergenzschritt zur PSD-Anreicherung eliminiert.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben auf Eis zu legen und Protease- und Phosphatasehemmer nach diesem Verfahren einzuschließen. Andere Methoden wie die westliche Blutanalyse oder die zweidimensionale Gelelektrophorese können durchgeführt werden. Dann können Sie Fragen beantworten, wie z.B. wie sich die medikamentöse Behandlung auf die Rezeptorspiegel an der Synapse auswirkt.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird die Anreicherung von Proteinen, die mit der synaptischen Plasmamembran assoziiert sind, mittels Ultrazentrifugation in einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten beschrieben. Das Verfahren veranschaulicht die subzelluläre Fraktionierung von Hirngewebe zur Anreicherung von Proteinen aus synaptischen Membranen und postsynaptischen Dichten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Proteinanaylse
Hintergrund
- Das Verständnis der synaptischen Proteinspiegel ist entscheidend für die Neurowissenschaftsforschung.
- Synaptische Membranen und postsynaptische Dichten spielen eine Schlüsselrolle bei der neuronalen Kommunikation.
- Die Ultrazentrifugation ist eine Standardtechnik zur Anreicherung von Proteinen.
- Western-Blotting und 2D-DIGE sind gängige Methoden zur Proteinanalyse.
Zweck der Studie
- Proteine aus synaptischen Membranen und post-synaptischen Dichten anzureichern.
- Proteinextrakte herzustellen, die für weitere Analysen geeignet sind.
- Die Wirksamkeit eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten bei der Proteinanreicherung zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Homogenisierung von Hirngewebe mithilfe eines motorbetriebenen Homogenisators.
- Reihe von Zentrifugationsschritten zur Herstellung von rohen Membranproteinextrakten.
- Aufschichten der Membranextrakte auf ein diskontinuierliches Saccharosegradient.
- Ultrazentrifugation zur Sammlung der Proteine aus dem Gradienten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anreicherung von synaptischen Plasmamembranproteinen.
- Herstellung postsynaptischer Dichteproteine zur Analyse.
- Die Ergebnisse können auf Veränderungen der synaptischen Proteinspiegel hinweisen.
- Geeignet für die Western-Blot-Analyse und 2D-DIGE.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bereichert effektiv Proteine aus synaptischen Membranen.
- Bietet eine Grundlage für die Untersuchung der Dynamik synaptischer Proteine.
- Kann auf verschiedene Fragestellungen der Neurowissenschaften angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Quantifizierung synaptischer Proteine ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Validierung zentralnervöser Zielstrukturen, indem molekulare Veränderungen mit funktionellen Phänotypen verknüpft werden. Diese Methode der subzellulären Fraktionierung unterstützt das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckungsphase, indem sie krankheitsrelevante synaptische Kompartimente isoliert. Sie bietet ein krankheitsrelevantes System zur Beurteilung der Zielstrukturenbindung und der Modulation von Signalwegen in präklinischen Modellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung des Transports von Proteinen der synaptischen Plasmamembran und der postsynaptischen Dichte.
- Operationaler Wert: Bietet einen standardisierten Ansatz zur Isolierung synaptischer Kompartimente für die Absicherung von Zielstrukturen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Biomarker-Abstimmung, indem Veränderungen der prä- und postsynaptischen Proteinspiegel nach Modulation von Signalwegen gemessen werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte synaptische Proteinfraktionen für die Verwendung in phänotypischen Screening-Assays vor, um die Wirkung von Substanzen auf die synaptische Integrität zu bewerten.
- Operationaler Wert: Erzeugt reproduzierbare, quantitative Proteinergebnisse, die für die Assay-Standardisierung und die Analyse mit hohem Informationsgehalt geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Die diskontinuierliche Saccharose-Gradientenmethode ermöglicht die Batch-Verarbeitung von Proben für eine konsistente Bereitschaft zum Screening.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme durch die Isolierung synaptischer Proteine aus spezifischen Hirnregionen wie dem Striatum, um neuropsychiatrische Zielstrukturen zu untersuchen.
- Operativer Wert: Unterstützt die Entwicklung translationaler Biomarker, indem quantifizierbare Nachweise synaptischer Proteine bereitgestellt werden, die mit funktionellen Ergebnissen korrelieren.
- Risikominderung: Ermöglicht die Kontinuität in der präklinischen Forschung, indem die Modulation von Zielstrukturen mit messbaren Veränderungen in der Zusammensetzung synaptischer Proteine verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie quantitative Daten zu synaptischen Proteinen bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung synaptischer Kompartimente, die von Störungen des Neurotransmittersystems betroffen sind.
- Screening: Ermöglicht die Bereitstellung von angereicherten synaptischen Plasmamembran- und PSD-Fraktionen, die für Western Blot- oder 2D DIGE-Analysen geeignet sind, und damit die Versuchsdurchführung.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen abhängiger Variablen (Proteinbandintensität), die den Vergleich von synaptischen Proteinmengen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Beurteilung von Veränderungen synaptischer Proteine in Krankheitsmodellen ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Isolierung synaptischer Proteine über mehrere ZNS-Projekte und Zielstrukturen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen durch direkte Messung des synaptischen Proteintransports verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit und Standardisierung sicher durch einen etablierten diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten-Protokoll mit definierten Zentrifugationsschritten.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, quantitative Daten zu synaptischen Proteinen bereitgestellt werden, die das Risiko bei der Weiterentwicklung von ZNS-Targets verringern.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von ZNS-Targets basierend auf messbaren Effekten auf die Zusammensetzung synaptischer Proteine und die synaptische Funktion.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der subzellulären Fraktionierung, Ultrazentrifugation und synaptischen Biologie, um eine korrekte Gradientenbildung und Fraktionssammlung sicherzustellen.
- Setzt den Zugang zu einer Ultrazentrifuge mit Schwenkköpfen und Rotoren mit festem Winkel sowie die Fähigkeit voraus, die Proben während der gesamten Verarbeitung bei 4 °C zu lagern.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Herstellung der Gradienten, der Gewebehomogenisierung und der Verwendung von Protease- und Phosphataseinhibitoren, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf verschiedene Hirnregionen oder Krankheitsmodelle angewendet wird, da Unterschiede in der Expression synaptischer Proteine und der Gewebeausbeute bestehen können.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Notwendigkeit von frischem oder sachgerecht gelagertem Gewebe sowie eine sorgfältige Handhabung, um eine Störung des Gradienten durch Erschütterungen oder Verzögerungen während der Einrichtung zu vermeiden.
