Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den retrograden axonalen Transport des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) durch Live-Bildgebung zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst mikrofluidische Kammern auf Polylysin-beschichteten Deckgläsern montiert werden. Im zweiten Schritt werden dissoziierte E 18-Hippocampus-Neuronen der Ratte präpariert und im Zellkörperkompartiment der mikrofluidischen Kammer plattiert.

Als nächstes werden die Neuronen kultiviert, um die Ausdehnung der Axone über die Mikrorillen in das axonale Kompartiment der Kammer zu ermöglichen. Im letzten Schritt wird dem Axonkompartiment ein mit einem Quantenpunkt markierter BDNF hinzugefügt. Letztendlich kann die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die BDNF-Bewegung innerhalb der Axone des Hippocampus-Neurons zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren wie der B-D-F-E-G-I-P oder der BDFM-Kirschmarkierung besteht darin, dass die Markierung von BDF mit einem Quantenpunkt die Lichtabbildung eines einzelnen BDF-Dimers innerhalb der Axone ermöglicht, die das Verfahren demonstrieren. Zeichnen Sie einen Post-Punkt von meinen linken drei, beginnen Sie mit dem Handwaschen der mikrofluidischen Kammern in 1%aox, gefolgt von drei 30-minütigen Spülungen in Milli Q Wasser. Nachdem Sie die Kammern von Hand in 70 % Ethanol gewaschen haben, legen Sie sie zum Trocknen auf einem Param in einer Laminar-Flow-Haube aus, sterilisieren Sie beide Seiten der Kammern 20 Minuten lang unter UV-Licht und lagern Sie die bestrahlten Kammern dann in einer sterilen, mit Param versiegelten 15-Zentimeter-Schale bei Raumtemperatur.

Als nächstes 24 x 40 Millimeter einweichen. Nummer eins der Glasabdeckungen wird über Nacht mit 10 % Salzsäure auf einen Rotator gelegt, gefolgt von drei 30-minütigen Waschgängen mit Wasser nach dem letzten Waschgang. Sterilisieren Sie jedes Deckglas mit einem Tauchgang in 100 % Ethanol, brennen Sie es anschließend über einem Bunsenbrenner und lagern Sie sie trocken in einer sterilen Petrischale bei Raumtemperatur.

Um die Deckgläser zu beschichten, legen Sie sie in eine 15 Zentimeter große Kulturschale und schichten Sie sie dann jeweils mit 0,7 Millilitern 0,01 % Poly-L-Lysin auf. Nach einer einstündigen Inkubation in der Gewebekulturhaube spülen Sie die Deckgläser noch dreimal mit sterilem Wasser aus und trocknen sie anschließend mit einem Vakuum und legen Sie sie in eine sechs Zentimeter große Kulturschale. Legen Sie dann eine der sterilisierten Kammern mit der Mikrorillenseite nach unten auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas.

Achten Sie darauf, die Mikrorillen nicht zu berühren, und verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, um die Kammer vorsichtig nach unten zu drücken und die zusammengebaute mikrofluidische Kammer fest zu verschließen. Legen Sie nun zwei E 17 bis E 18 Ratten-Hippo Campi in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern Dissektionspuffer und spülen Sie das Gewebe dreimal mit jeweils fünf Millilitern Dissektionspuffer aus. Entfernen Sie dann so viel wie möglich von der Wäsche und fügen Sie 900 Mikroliter frischen Dissektionspuffer hinzu, um das Gewebe zu verdauen.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 2,5%iges Trypsin in das Gewebe und legen Sie das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Fügen Sie nach 10 Minuten Verdauung 100 Mikroliter DNA one hinzu und verwenden Sie eine feuerpolierte PE-Glaspipette, um das Gewebe unmittelbar nach dem Mischen fünf bis 10 Mal sanft auf und ab zu tri bewerten. Schrecken Sie das Tryin mit zwei Millilitern Beschichtungsmedium ab und lassen Sie die Ablagerungen fünf Minuten lang in der Gewebekulturhaube am Boden des Röhrchens absetzen.

Übertragen Sie anschließend vorsichtig zwei Milliliter Überstand in ein sauberes, steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Wiederbelebung der Zellen herunter. Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Beschichtungsmedium und laden Sie dann nach dem Zählen 15 bis 20 Mikroliter der Zellsuspension in ein Fach der mikrofluidischen Kammer. Inkubieren Sie die Kammer 10 Minuten lang, damit sich die Zellen am Deckglas festsetzen können, und fügen Sie dann weitere Beschichtungsmedien hinzu, um beide Kammern der Kammer zu füllen.

Ersetzen Sie nach einem Tag Inkubation das Beschichtungsmedium durch Erhaltungsmedien sowohl im Zellkörper als auch in den Axonkompartimenten. Am dritten Tag beginnen die Axone aus den Hippocampus-Neuronen, die Mikrorillen zu durchqueren und das Axonkompartiment zwischen dem fünften und siebten Tag zu erreichen. Während dieser Zeit wird die Hälfte des Kultivierungsmediums alle 24 bis 48 Stunden durch frisches Erhaltungsmedium ersetzt, bevor die Live-Bildgebung des quantenmarkierten BDNF-Axontransports beginnt.

Spülen Sie während der BDNF-Depletion beide Kompartimente der mikrofluidischen Kammer während der BDNF-Depletion alle 30 Minuten gründlich mit BDNF-freiem serumfreiem neuronalem Basalmedium, inkubieren Sie 50 nanomolare monobiotinylierte BDNF-Dimere mit 50 nanomolaren Quanten. 6 5 5 Strippin-Konjugate in neurobasalen Medien auf Eis für 60 Minuten durchführen. Ersetzen Sie dann das Medium im Axonkompartiment für vier Stunden bei 37 Grad Celsius durch 300 Mikroliter Quantenpunkt-markiertes BDNF, um die Diffusion von Quantenpunkt-markiertem BDNF in das Zellkörperkompartiment zu minimieren.

Es ist sehr wichtig, am Ende der Inkubation, des Aufwärmens und des inversen Mikroskops, das mit einem 100-fachen Ölobjektiv und einer Klimakammer auf eine konstante Temperatur von 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ausgestattet ist, während sich das Gerät aufwärmt, immer auf einem höheren Medienniveau als im Axonkompartiment zu halten. Waschen Sie den ungebundenen Quantenpunkt mit der Bezeichnung BDNF aus der mikrofluidischen Kammer ab und verwenden Sie dann einen Satz texanischer roter Anregungs- und Emissionswürfel, um das Quantenpunkt-Signal 6 5 5 zu visualisieren. Verwenden Sie schließlich eine CCD-Kamera, um Zeitrafferbilder in den mittleren Axonen mit einer Geschwindigkeit von einem Bild pro Sekunde für insgesamt zwei Minuten aufzunehmen.

Verwenden Sie Mikrorillen ohne Axone, die keine QD haben, als Kontrolle für die Infiltration und analysieren Sie den BDNF-Transport mit der entsprechenden Bildanalysesoftware in der Zeitrafferbildgebung des mit Quantenpunkten markierten BDNF-Signaltransports. Quantenpunktsignale werden in den meisten Mikrorillen mit Axonen beobachtet, während in den Mikrorillen ohne Axone kein Quantensignal zu sehen ist, was auf eine geringe bis keine Diffusion des Quantenpunktsignals aus dem Axonkompartiment hinweist. zum Zellkörperkompartiment hier. Ein 80 Mikrometer langes Segment eines Hippocampus-Neuronenaxons wurde 100 Sekunden lang fluoreszierend aufgezeichnet. Insgesamt sechs.

Quanten-BDNF-Signale wurden während der Bildgebung deutlich festgestellt, wobei drei beobachtet wurden, die sich unidirektional in Richtung des Zellkörpers bewegten. Es wurde beobachtet, dass sich ein Signal reibungslos zum Zellkörper bewegte und das gesamte Feld in etwa 70 Sekunden durchquerte. Es wurde beobachtet, dass sich ein anderer in den ersten 20 Sekunden in eine retrograde Richtung bewegte, für 10 bis 20 Sekunden auf eine antrograde Bewegung umschaltete und dann in den letzten 20 Sekunden wieder die Richtung in Richtung des Zellkörpers änderte.

Es wurde auch festgestellt, dass sich das dritte Ereignis in eine retrograde Richtung bewegte, dann aber in der Mitte des Satzes für etwa 20 Sekunden pausierte. In diesem ersten repräsentativen Glockenspiel des mit Quantenpunkten markierten BDNF-Transports bewegte sich der mit BDNF markierte Quantenpunkt schnell und reibungslos auf den Zellkörper zu und überquerte das 80-Mikrometer-Feld in etwa 60 Sekunden. Mit sehr kurzen Pausen in diesem zweiten Chronographen legte die Quantum BDNF in 120 Sekunden etwa 50 Mikrometer in retrograder Richtung zurück, mit mindestens drei Segmenten längerer Pausen.

Schließlich messen die Streudiagramme die Bewegungsgeschwindigkeit, die durchschnittliche Geschwindigkeit und die Pausenzeit jedes einzelnen Quantenpunkts mit der Bezeichnung BDNF. Die Bewegungsgeschwindigkeiten des mit BDNF gekennzeichneten Quantenpunkts waren relativ schnell und reichten von 0,47 bis 1,97 Mikrometern pro Sekunde mit einem Mittelwert von 1,06 plus oder minus 0,05 Mikrometer pro Sekunde. Aufgrund der BDNF-Pausen während des Transports war die mittlere Geschwindigkeit viel niedriger als die Bewegungsgeschwindigkeit mit einem Mittelwert von 0,48 plus oder minus 0,03 Mikrometer pro Sekunde bei einer mittleren Pausendauer von 15,88 plus oder minus 1,30 Sekunden nach der Entwicklung.

Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, den Neurotrophin- und Rezeptorhandel in gesunden und kranken Neuronen zu untersuchen.