Name: gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie eine transposasebasierte Methode zur gDNA-Anreicherung für NGS-Sequenzierung von 11 DNA-Reparaturgenen einschließlich BRCA1 und BRCA2. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle gleichzeitige Analyse mehrerer Gene.

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Wir danken der Ligue contre le Cancer de Côte d'Or und dem Centre Georges-François Leclerc für ihre finanzielle Unterstützung. Wir danken Philip Bastable für die Bearbeitung des Manuskripts.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Der weit verbreitete Einsatz von NGS-Geräten und Technologien hat neue Möglichkeiten bei der Untersuchung von Krebs und genetische Erkrankungen vorgesehen. Neben der Sequenzierung ganzer Genome oder RNA-Sequenzierung, die Analyse einer großen Menge von ausgewählten gDNA-Sequenzen in zahlreiche Patienten bietet gleichzeitig große Perspektiven in Diagnose. Hier ein bestimmtes Design (auf Anfrage) mit Nextera Technologie, um 11 vollständige Gene bei 24 Patienten gleichzeitig mit einem mittleren Durchsatz-Sequenzierung Gerä...

Im Jahr 2010 fast 1,5 Millionen Menschen (im wesentlichen Frauen) entwickelt weltweit Brustkrebs. Es wird geschätzt, dass 5 bis 10% dieser Fälle waren erblich. Vor fast 20 Jahren, BRCA1 und BRCA2 identifiziert wurden, wie in erblichen Brust-und Eierstockkrebs 1 beteiligt. Seit vor etwa 15 Jahren haben BRCA1-und BRCA2-codierenden Regionen wurden sequenziert, um die genetische Prädisposition für Brust-und Eierstockkrebs zu bestimmen. Veränderungen im BRCA1 und BRCA2 sind in 10 bis 20% der ausgewählten Familien 2 nahelegt, daß die Analyse dieser Bereiche ist nicht ausreichend für eine effektive Screening nachgewiesen. Vor kurzem hat die Analyse von nicht-kodierenden Sequenzen (Promotor, Introns, 3-&#39;UTR) von BRCA1-und BRCA2-Mutationen hervorgehoben, dass neue / Variationen könnten zu einem höheren Risiko von Brustkrebs 3-6 verknüpft werden. BRCA1 und BRCA2-Proteine ​​der homologen Rekombination Reparatur beteiligt (HHR), die von zahlreichen Partner 7 abgeschlossen ist. Während Veränderungen in BRCA1-oder BRCA2 induzieren Defekte in der DNA-Reparatur können die anderen Partner auch Einfluss auf das Risiko von Brustkrebs. Diese Hypothese erscheint seit BRIP1 8 bis validiert wurden und PALB2 9 haben eine nachgewiesene Wirkung auf Gebärmutterhals-und Brustkrebs sind. Zusätzlich können zwei weitere &quot;mittlerem Risiko&quot; Brustkrebs Anfälligkeit Gene, ATM und CHEK2, auch routinemäßig 10 untersucht werden. Im Anschluss an diesen Studien, haben wir beschlossen, ein Protokoll bis 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 und TP53) bei 24 Patienten analysiert gleichzeitig über eine sehr einfache und relativ entwickeln schnell Protokoll, das auf Transposase Technologie, mit Anreicherung und Sequenzierung auf einem mittleren Durchsatz Gerät. Dankdieser Technik sequenziert wir vollständige Gene aus dem Start des Promotors bis zum Ende der 3&#39;-UTR, außer RAP80, für die eine Intron-Region von 2.500 bp wurde nicht behandelt (CHR 5: 176,381,588-176,390,180). Dies entspricht insgesamt etwa 1.000.300 bp studierte bei 2.734 Sonden. Normalerweise sind BRCA1 und BRCA2 exonische Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung, die 1,5 Monate weniger als 20 Patienten muss analysiert. Bei dem vorliegenden Protokoll (Abbildung 1), in der gleichen Zeit 11 komplette Gene für mehr als 75 Patienten analysiert werden konnte.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Sequenzier-/Mitteldurchsatzgerät</td></tr><tr><td>Nextera Anreicherungskit</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Transposase-basierte Technologie</td></tr><tr><td>300-Zyklus-Kartusche</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPure-Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Magnetische Aufreinigungskügelchen</td></tr><tr><td>Magnetisches Stativ</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96-Well-Platten</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Diese Versiegelung ist nur für die PCR-Amplifikation erforderlich. Andere Standarddichtungen können während des gesamten Experiments verwendet werden</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Wird mit dem Sequenziergerät geliefert Experiment Manager Software Internetadresse: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Tool auf der Website des Herstellers</td></tr></tbody></table>

gdna enrichment durch eine transposase-basierte technologie für ngs-analyse der gesamten sequenz von brca1, brca2 und 9 gene in der dna-reparatur beteiligt schäden

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Der weit verbreitete Einsatz von Next Generation Sequencing hat neue Wege für die Krebsforschung und Diagnostik eröffnet. NGS werden riesige Mengen neuer Daten über Krebs, und vor allem Krebsgenetik zu bringen. Aktuellen Wissensstand und zukünftige Entdeckungen machen es notwendig, eine große Anzahl von Genen, die in einem genetischen Prädisposition für Krebs beteiligt sein könnten studieren. In diesem Zusammenhang haben wir eine Nextera Design bis 11 vollständige Gene in der DNA-Reparatur beteiligt sind Schäden zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um sicher zu studieren 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 und TP53) von Promotor zu 3&#39;-UTR bei 24 Patienten gleichzeitig. Dieses Protokoll, basierend auf Transposase Technologie und gDNA Bereicherung, gibt einen großen Vorteil in Bezug auf die Zeit für die genetische Diagnostik durch Multiplexing zu probieren. Dieses Protokoll kann sicher mit Blut gDNA verwendet werden.

Probe QC Ergebnisse Die Fähigkeit dieses Verfahrens, um Sequenzen von Zielgenen zu bestimmen, ist von der Qualität der gDNA (2A) und der Qualität des tagmentation Schritt basiert. Wenn die tagmentation nicht ausreicht (2B oben), wird die Sequenzierung nicht zufriedenstellend. Wie oben erwähnt, nach der tagmentation Reinigung der gDNA sollte in Fragmente von 150 bp bis 1000 bp mit der Mehrzahl der Fragmente etwa 300 bp (2B, unteres Feld) tagment...

gDNA-Anreicherung für die NGS-Sequenzierung ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von konstitutionellen Mutationen. In diesem Artikel stellen wir das Verfahren vor, mit dem einfach die vollständige Sequenz von 11 Genen analysiert werden kann, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die Sequenz von 11 Genen gleichzeitig mit einem sehr einfachen und relativ schnellen Protokoll zu analysieren, das auf einer Transposase-basierten Technologie basiert. Dies wird durch die Wirkung einer Transposase erreicht, um 300 Basenpaar-DNA-Fragmente zu erhalten, die direkt mit Adaptern ligiert sind. Bei der ersten Erfassung mit speziellen Sonden werden Proben in interessanten Bereichen angereichert.Dieser Schritt wird noch einmal wiederholt, um nur Zielsequenzen zu erhalten. Als nächstes wird eine PCR-Amplifikation durchgeführt, um die Menge der zu sequenzierenden Materialien zu erhöhen, wobei Ergebnisse erzielt werden, die genetische Variationen in Genen auf der Grundlage der Sequenzausrichtung und der bioinformatischen Analyse zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Sanger-Sequenzierung ist ihre große Kapazität, die es uns ermöglicht, 24 Leidenschaften für 11 vollständige Gene in weniger als zwei Wochen zu analysieren.Die Demonstration des Verfahrens wird Sandy sein, ein Techniker für mein Labor. Bereiten Sie zunächst alle Reagenzien aus dem DNA-Anreicherungskit vor. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie etwa 50 Nanogramm genomische DNA in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu, indem Sie 25 Mikroliter TD-Puffer und dann fünf Mikroliter TDE einen Puffer hinzufügen.Setzen Sie eine Pipette auf 50 Mikroliter und pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 10 Mal auf und ab. Kurz zentrifugieren und dann die Platte in einen Thermocycler legen, wenn sie fertig ist. Die ST-Lösung vortexen und 15 Mikroliter in jede Vertiefung mit der Probe geben.Stellen Sie die Pipette auf 65 Mikroliter ein und pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 10 Mal auf und ab, inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie zentrifieren. Geben Sie anschließend 52 Mikroliter zuvor gemischter magnetischer Reinigungskügelchen in jede Vertiefungsmischung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie zentrifugieren. Nachdem Sie die Kügelchen mit Ethanol gewaschen haben, nehmen Sie die Platte vom Magnetständer und fügen Sie 22,5 Mikroliter RSB-Puffer hinzu.Stellen Sie die Platte nach dem Mischen auf den Magnetständer und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Übertragen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der Snat auf eine neue 96-Well-Platte.Um die erste Runde der PCR-Amplifikation zu beginnen, fügen Sie jeweils 20 Mikroliter LP PMM und je fünf Mikroliter Index eins und Index zwei hinzu. Die Platte gut mischen und mit einer selbstklebenden Micros EAL-Folie abdecken. Legen Sie die Platte nach dem Zentrifugieren in den Thermocycler und führen Sie das erste Programm aus.Nach der Reinigung und Bestimmung der Ausbeute aus der ersten PCR-Runde beginnen Sie mit der ersten Hybridisierung, indem Sie bis zu 12 Proben ziehen. In der neuen 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass das Endvolumen jedes Pools 40 Mikroliter nicht überschreitet, mischen Sie die NCT-Lösung gründlich und geben Sie 50 Mikroliter in jede Well. Nachdem Sie 10 Mikroliter CSO hinzugefügt haben, mischen und verschließen Sie die Platte.Legen Sie die Platte nach dem Zentrifugieren in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Zwei. Für die erste Hybridisierungswäsche nehmen Sie die Platte aus dem Thermocycler und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie die Klebeabdeckung ganz vorsichtig kurz.Übertragen Sie 100 Mikroliter Reaktionsgemisch von der Platte auf eine neue MIDI 96-Well-Platte und fügen Sie 250 Mikroliter Well-Vortex-SMB-Lösung hinzu. Mischen und verschließen Sie die Platte, bevor Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Waschen und Entsorgen der Supena 200 Mikroliter gut gemischte WS two-Lösung in Vertiefungen mit Kügelchen geben und gründlich mischen, trans das gesamte Volumen in eine neue 96-Well-Platte übertragen.Verschließen Sie die Platte und legen Sie sie in einen Thermocycler. Starten Sie den Thermocycler 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Platte sofort für zwei Minuten auf den Magnetständer.Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Entfernen Sie die Dichtung und entsorgen Sie sofort den gesamten Überstand. Entfernen Sie die Platte vom Magnetständer.Geben Sie 200 Mikroliter gut gemischte Ws 3-Lösung in Vertiefungen, die Kügelchen enthalten, und mischen Sie sie gründlich. Nach dem Waschen und Entfernen des Supinats die Platte verschließen und kurz zentrifugieren, um die restliche Rückenlage nach unten zu ziehen. Legen Sie die Platte für zwei Minuten auf den Magnetständer.Entsorgen Sie das restliche Supinat. Entfernen Sie anschließend die Platte vom Magnetständer. Fügen Sie 23 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Mischung hinzu.Nach dem Mischen die Platte verschließen und fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen, bevor sie zentrifugiert. Nach dem Übertragen von 21 Mikrolitern Sat auf eine neue 96-Well-Platte fügen Sie jeweils vier Mikroliter ET und zwei Lösungen hinzu. Die Platte vor dem Zentrifusionieren gut mischen und verschließen.Um die zweite Hybridisierung zu starten, entfernen Sie die Klebefolie und fügen Sie 50 Mikroliter NCT, 10 Mikroliter CSO und 15 Mikroliter Wasser in PCR-Qualität zu der 25-Mikroliter-Bibliothek hinzu. Legen Sie die Platte nach dem Zentrifugieren in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Zwei. In einer neuen 96-Well-Platte wurden 20 Mikroliter Evolution aus dem vorherigen Schritt gemischt.Mit 25 Mikrolitern T-C-P-M-M und fünf Mikrolitern PPC wird die Platte nach dem Mischen und Zentrifugieren verschlossen. Legen Sie dann die Platte in einen Thermocycler und führen Sie am nächsten Tag Programm drei aus, zentrifugieren Sie die Platte und waschen Sie die Kügelchen mit Ethanol. Nehmen Sie die Platte vom Magnetständer und fügen Sie 30 Mikroliter RSB-Puffer hinzu.Mischen und den Teller zwei Minuten lang inkubieren. Stellen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur auf das Magnetstativ und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang oder bis der S-Überstand vollständig klar erscheint. Übertragen Sie vorsichtig 28 Mikroliter der Snat in eine neue 96-Well-Platte.Der letzte Schritt besteht darin, die Qualität der Bibliothek mithilfe eines Fragmentanalysators oder QPCR zu bestimmen. Während des Laufs sollte die Clusterdichte zwischen 801.000 K pro Quadratmillimeter liegen. Unterschiedliche Bilder entsprechen niedriger Dichte, hoher Dichte und perfekter Dichte.Die mit dieser Technologie erzielten Ergebnisse lassen sich mit Hilfe der Bioinformatik sehr einfach als Punkt- oder Indel-Mutationen interpretieren. Die Basenänderung wird angezeigt und die gelöschte oder eingefügte Sequenz wird direkt identifiziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

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