gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden
6. Oktober 2014
gDNA-Anreicherung für die NGS-Sequenzierung ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von konstitutionellen Mutationen. In diesem Artikel stellen wir das Verfahren vor, mit dem einfach die vollständige Sequenz von 11 Genen analysiert werden kann, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.
Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die Sequenz von 11 Genen gleichzeitig mit einem sehr einfachen und relativ schnellen Protokoll zu analysieren, das auf einer Transposase-basierten Technologie basiert. Dies wird durch die Wirkung einer Transposase erreicht, um 300 Basenpaar-DNA-Fragmente zu erhalten, die direkt mit Adaptern ligiert sind. Bei der ersten Erfassung mit speziellen Sonden werden Proben in interessanten Bereichen angereichert.
Dieser Schritt wird noch einmal wiederholt, um nur Zielsequenzen zu erhalten. Als nächstes wird eine PCR-Amplifikation durchgeführt, um die Menge der zu sequenzierenden Materialien zu erhöhen, wobei Ergebnisse erzielt werden, die genetische Variationen in Genen auf der Grundlage der Sequenzausrichtung und der bioinformatischen Analyse zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Sanger-Sequenzierung ist ihre große Kapazität, die es uns ermöglicht, 24 Leidenschaften für 11 vollständige Gene in weniger als zwei Wochen zu analysieren.
Die Demonstration des Verfahrens wird Sandy sein, ein Techniker für mein Labor. Bereiten Sie zunächst alle Reagenzien aus dem DNA-Anreicherungskit vor. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie etwa 50 Nanogramm genomische DNA in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu, indem Sie 25 Mikroliter TD-Puffer und dann fünf Mikroliter TDE einen Puffer hinzufügen.
Setzen Sie eine Pipette auf 50 Mikroliter und pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 10 Mal auf und ab. Kurz zentrifugieren und dann die Platte in einen Thermocycler legen, wenn sie fertig ist. Die ST-Lösung vortexen und 15 Mikroliter in jede Vertiefung mit der Probe geben.
Stellen Sie die Pipette auf 65 Mikroliter ein und pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 10 Mal auf und ab, inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie zentrifieren. Geben Sie anschließend 52 Mikroliter zuvor gemischter magnetischer Reinigungskügelchen in jede Vertiefungsmischung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie zentrifugieren. Nachdem Sie die Kügelchen mit Ethanol gewaschen haben, nehmen Sie die Platte vom Magnetständer und fügen Sie 22,5 Mikroliter RSB-Puffer hinzu.
Stellen Sie die Platte nach dem Mischen auf den Magnetständer und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Übertragen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der Snat auf eine neue 96-Well-Platte.
Um die erste Runde der PCR-Amplifikation zu beginnen, fügen Sie jeweils 20 Mikroliter LP PMM und je fünf Mikroliter Index eins und Index zwei hinzu. Die Platte gut mischen und mit einer selbstklebenden Micros EAL-Folie abdecken. Legen Sie die Platte nach dem Zentrifugieren in den Thermocycler und führen Sie das erste Programm aus.
Nach der Reinigung und Bestimmung der Ausbeute aus der ersten PCR-Runde beginnen Sie mit der ersten Hybridisierung, indem Sie bis zu 12 Proben ziehen. In der neuen 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass das Endvolumen jedes Pools 40 Mikroliter nicht überschreitet, mischen Sie die NCT-Lösung gründlich und geben Sie 50 Mikroliter in jede Well. Nachdem Sie 10 Mikroliter CSO hinzugefügt haben, mischen und verschließen Sie die Platte.
Legen Sie die Platte nach dem Zentrifugieren in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Zwei. Für die erste Hybridisierungswäsche nehmen Sie die Platte aus dem Thermocycler und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie die Klebeabdeckung ganz vorsichtig kurz.
Übertragen Sie 100 Mikroliter Reaktionsgemisch von der Platte auf eine neue MIDI 96-Well-Platte und fügen Sie 250 Mikroliter Well-Vortex-SMB-Lösung hinzu. Mischen und verschließen Sie die Platte, bevor Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Waschen und Entsorgen der Supena 200 Mikroliter gut gemischte WS two-Lösung in Vertiefungen mit Kügelchen geben und gründlich mischen, trans das gesamte Volumen in eine neue 96-Well-Platte übertragen.
Verschließen Sie die Platte und legen Sie sie in einen Thermocycler. Starten Sie den Thermocycler 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Platte sofort für zwei Minuten auf den Magnetständer.
Stellen Sie sicher, dass der Überstand vollständig klar erscheint. Entfernen Sie die Dichtung und entsorgen Sie sofort den gesamten Überstand. Entfernen Sie die Platte vom Magnetständer.
Geben Sie 200 Mikroliter gut gemischte Ws 3-Lösung in Vertiefungen, die Kügelchen enthalten, und mischen Sie sie gründlich. Nach dem Waschen und Entfernen des Supinats die Platte verschließen und kurz zentrifugieren, um die restliche Rückenlage nach unten zu ziehen. Legen Sie die Platte für zwei Minuten auf den Magnetständer.
Entsorgen Sie das restliche Supinat. Entfernen Sie anschließend die Platte vom Magnetständer. Fügen Sie 23 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Mischung hinzu.
Nach dem Mischen die Platte verschließen und fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen, bevor sie zentrifugiert. Nach dem Übertragen von 21 Mikrolitern Sat auf eine neue 96-Well-Platte fügen Sie jeweils vier Mikroliter ET und zwei Lösungen hinzu. Die Platte vor dem Zentrifusionieren gut mischen und verschließen.
Um die zweite Hybridisierung zu starten, entfernen Sie die Klebefolie und fügen Sie 50 Mikroliter NCT, 10 Mikroliter CSO und 15 Mikroliter Wasser in PCR-Qualität zu der 25-Mikroliter-Bibliothek hinzu. Legen Sie die Platte nach dem Zentrifugieren in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Zwei. In einer neuen 96-Well-Platte wurden 20 Mikroliter Evolution aus dem vorherigen Schritt gemischt.
Mit 25 Mikrolitern T-C-P-M-M und fünf Mikrolitern PPC wird die Platte nach dem Mischen und Zentrifugieren verschlossen. Legen Sie dann die Platte in einen Thermocycler und führen Sie am nächsten Tag Programm drei aus, zentrifugieren Sie die Platte und waschen Sie die Kügelchen mit Ethanol. Nehmen Sie die Platte vom Magnetständer und fügen Sie 30 Mikroliter RSB-Puffer hinzu.
Mischen und den Teller zwei Minuten lang inkubieren. Stellen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur auf das Magnetstativ und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang oder bis der S-Überstand vollständig klar erscheint. Übertragen Sie vorsichtig 28 Mikroliter der Snat in eine neue 96-Well-Platte.
Der letzte Schritt besteht darin, die Qualität der Bibliothek mithilfe eines Fragmentanalysators oder QPCR zu bestimmen. Während des Laufs sollte die Clusterdichte zwischen 801.000 K pro Quadratmillimeter liegen. Unterschiedliche Bilder entsprechen niedriger Dichte, hoher Dichte und perfekter Dichte.
Die mit dieser Technologie erzielten Ergebnisse lassen sich mit Hilfe der Bioinformatik sehr einfach als Punkt- oder Indel-Mutationen interpretieren. Die Basenänderung wird angezeigt und die gelöschte oder eingefügte Sequenz wird direkt identifiziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein optimiertes Protokoll zur Analyse der kompletten Sequenz von 11 Genen, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind, vor. Mithilfe einer Transposase-basierten Technologie ermöglicht die Methode eine effiziente Anreicherung von gDNA für die NGS-Sequenzierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genetik
- DNA-Reparaturmechanismen
- Next-Generation-Sequenzierung
Hintergrund
- Konstitutionelle Mutationen können die genetische Forschung erheblich beeinflussen.
- Herkömmliche Sequenziermethoden wie die Sanger-Sequenzierung weisen Einschränkungen hinsichtlich des Durchsatzes auf.
- Die Transposase-Technologie bietet einen neuartigen Ansatz für die Vorbereitung von DNA-Fragmenten.
- Die Anreicherung von Zielsequenzen ist entscheidend für eine genaue Analyse.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines schnellen und effizienten Protokolls zum Sequenzieren mehrerer Gene.
- Verbesserung des Nachweises genetischer Variationen in DNA-Reparatur-Genen.
- Vergleich der Wirksamkeit dieser Methode mit etablierten Sequenziertechniken.
Verwendete Methoden
- Transposasebasierte Technologie zur DNA-Fragmentierung.
- Spezifische Sonden für die anfängliche Anreicherung von Zielregionen.
- Mehrfache Anreicherungsschritte zur Isolierung der Zielsequenzen.
- PCR-Amplifikation zur Erhöhung der Materialmenge für die Sequenzierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Sequenzierung von 11 Genen in einem einzigen Experiment.
- Identifizierung genetischer Variationen durch Sequenzalignierung.
- Ergebnisse in weniger als zwei Wochen erhalten.
- Nachgewiesene Vorteile gegenüber der traditionellen Sanger-Sequenzierung.
Schlussfolgerungen
- Die vorgestellte Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genetische Analyse.
- Sie ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Gene effizient.
- Dieser Ansatz kann weitere Forschungen zur DNA-Schadensreparatur erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mithilfe einer Transposase-basierten gDNA-Anreicherung für die NGS-Analyse lässt sich die Sequenzierung von 11 Genen der DNA-Reparatur, einschließlich BRCA1 und BRCA2, gleichzeitig und mit hoher Durchsatzleistung über mehrere Proben hinweg durchführen. Dieser Ansatz beschleunigt die Detektion von Varianten und ermöglicht eine robuste genetische Analyse für Onkologie-Forschungsportfolios. Multiplex-basierte Arbeitsabläufe verkürzen die Durchlaufzeit und verbessern die Entscheidungsfindung an entscheidenden Punkten in Biomarker- und Target-Validierungspipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine umfassende Untersuchung von DNA-Reparaturwegen, die mit einer Prädisposition für Krebserkrankungen assoziiert sind.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem handlungsrelevante genetische Varianten über mehrere Gene hinweg identifiziert werden.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem eine vollständige Sequenzabdeckung des gesamten Gens für die Hypothesenprüfung bereitgestellt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert multiplexierte, quantitative Sequenzdaten zur Assay-Standardisierung und Reproduzierbarkeit.
- Bereitet validierte Probensammlungen für nachgeschaltete, auf NGS basierende Screening-Workflows vor.
- Ermöglicht skalierbare, hochdurchsatzfähige Analysen, die für große Kohortenstudien geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung der genetischen Variantendetektion mit translationalen Biomarker-Strategien in der Onkologie-Forschung.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine umfassende Profilierung von Varianten ermöglicht wird.
- Verringert das biologische Risiko, indem hochzuverlässige Sequenzdaten der kompletten Gene für die Priorisierung von Kandidaten bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses auf Transposasen basierende Anreicherungsprotokoll integriert sich in den Bereich der frühen Entdeckung, der Identifizierung von Leitstrukturen und der translationsmedizinischen Forschung und unterstützt einen nahtlosen Übergang von der Hypothesenprüfung zur präklinischen Validierung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht eine robuste Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch vollständige Gen-Sequenzierung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für einen zuverlässigen Nachweis von Varianten in mehreren Proben.
- Analytik: Erzeugt interpretierbare Sequenzalignments und Variantenaufrufe für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Zuordnung von Biomarkern und risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in onkologischen Entwicklungsstufen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen skalierbaren, multiplexfähigen Workflow, der an zusätzliche Genpanels oder Krankheitsbereiche angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert und beschleunigt die Probenaufbereitung durch multiplexe, reproduzierbare Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem schnelle und umfassende genetische Analysen ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Assets in der onkologischen Forschung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der NGS-Bibliotheksherstellung und der bioinformatischen Analyse.
- Benötigt Zugang zu Thermocyclern, magnetischer Säuberung von Probematerialien und NGS-Geräten.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Probenvorbereitung und Dateninterpretation voraus.
- Kann auf aus Blut gewonnenes gDNA und gegebenenfalls andere Probentypen übertragen werden, sofern dies validiert ist.
- Hängt von Qualitätskontrollkennzahlen wie Clusterdichte und Bibliotheksausbeute ab.
