Name: Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit MNU eine Netzhautdegeneration bei adulten Zebrafischen induzieren und deren Regeneration über 30 Tage verfolgen. Diese Methode kombiniert funktionelle OKR-Messungen mit histologischen Analysen.

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Wir danken Monika Kilchenmann, Federica Bisignani und Agathe Duda für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Alle Versuche der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen und Vision Research von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten werden. 1. Tiere <ol><li> Pflegen Sie die Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) der AB (Oregon) Spannung zwischen 6-12 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und einem 14/10 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus 15 Jahren. </li><li> Befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die kantonalen Veterinäramt. </li></ol> 2. MNU-Behandlung <ol><li> Bereiten Sie Wasser mit 150 mg / L Trockensubstanz von N-Methyl-N -nitrosourea (MNU). VORSICHT! MNU ist giftig; kann Krebs, vererbbare Schäden oder Schädigung des ungeborenen Kindes führen. </li><li> Inkubieren Zebrafisch in Wasser, das das MNU für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schnell mit spülen Zebrafischfrischem Wasser und setzen die Fische in ein neues Aquarium ohne MNU. Pflegen Fisch unter Standardbedingungen, so lange für die Experimente gewünscht. </li></ol> 3. Sehschärfe Mess <ol><li> Starten Sie den optomotorischen System, wählen Sie &quot;Test&quot; aus dem Menü und die Optionen auf &quot;Simple Treppe&quot;, &quot;Acuity (Freq)&quot; und &quot;Randomisierte / Separate&quot; 16. </li><li> Installieren Sie eine Infusionsflasche mit 500 ml Wasser gefüllt ca. 1 m über der optomotorischen Systems. </li><li> Legen Sie ein Zebrafisch in der Untersuchungskammer und an die Infusionsflasche. Legen Sie die Prüfung Kammer in der optomotorischen Systems. </li><li> Starten Sie die Messung und die Augenbewegungen in Echtzeit auf dem Computerbildschirm zu beobachten. Dadurch wird eine positive Antwort (&quot;Ja&quot;) als aufeinander folgende Sakkaden in die richtige Richtung definiert, während eine negative Antwort (&quot;nein&quot;) stellt zufälligen Augenbewegungen ähnlich wie die mit der Station beobachtet wirdary Gitter. Wenn die Augen der Zebrafisch zeigen drei oder mehr aufeinanderfolgenden optokinetischen Antworten (OKR), drücken Sie &quot;Ja&quot;; Wenn nicht, drücken Sie &quot;Nein&quot;. </li><li> Extrahieren der Sehschärfe, die durch die Software durch Bestimmen der Schwelle der Raumfrequenz des optokinetischen Stimulus unter &quot;Ergebnisse&quot; im Menü berechnet wurde. </li></ol> 4. Histologie <ol><li> Einschläfern Der Zebrafisch durch eine Überdosis von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat- (200-300 mg / L) und entkernen Sie die Augen. </li><li> Fixierung der ganzen Augen in 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C für 12 h und dann Dehydratisierung der Proben in einer abgestuften Alkoholreihe. </li><li> Einbetten der Proben in Paraffin, schneiden 5 um Schnitte durch den Sehnervenkopf (Papille) und montieren sie auf einen Glasobjektträger. </li><li> Färben die deparaffized Paraffinschnitten mit Hämalaun für 4 min und tauchen die Dias zweimal in destilliertem Wasser, gefolgt von 0,2% iger acid und 0,8% Ammoniak. Färben die Schnitte mit Eosin für 3 min nach der Entwicklung der Hämalaun-Färbung in Leitungswasser für mindestens 10 min (H &amp; E). </li><li> Betten Sie die Folien in dehydriert Montagemedium und unter dem Lichtmikroskop beobachten die Folien. </li></ol> 5. Immunhistochemie <ol><li> Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) <ol><li> Inkubiere die entparaffinierten Schnitte mit 20 ug / ml Proteinase K bei Raumtemperatur für 15 min. Dreimal mit Tris waschen Sie die Abschnitte Kochsalzlösung (TBS) für jeweils 5 min. </li><li> In einer feuchten Kammer inkubieren die Abschnitte mit 50 ul TUNEL Reaktionsmischung (10% Markierungslösung und 90% Enzym-Lösung) bei 37 ° C für 60 min. Dreimal waschen mit TBS für jeweils 5 min. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien. </li></ol></li><li> Wuchernden Cell Nuclear Antigen (PCNA) Färbung <ol><li> Man kocht die entparaffiniert Abschnitte in Antigen-Retrieval-Puffer (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) für 3 min und dreimal mit TBS für jeweils 5 min. Block mit 100 ul Blockierungslösung (TBS + 10% Ziegennormalserum + 1% Rinderserumalbumin, pH 7,6) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Fleck mit Anti-PCNA primäre Antikörper in einer 1: 200-Verdünnung in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Dreimal für je 5 min waschen mit TBS + Tween 20. </li><li> Beenden Sie die Erkennung mit den entsprechenden Sekundärantikörper in einer 1: 500-Verdünnung bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
<li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-N-Nitrosourea+%28MNU%29%3A+A+positive+control+chemical+for+p53%2B%2F-+mouse+carcinogenicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li>
<li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea%3A+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li>
<li>Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).</li>
<li>Tappeiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+rod+regeneration+in+a+novel+zebrafish+retinal+degeneration+model+using+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU).</a> PLOS One. 12, (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Fleisch, C., Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Behavior+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visual Behavior in Zebrafish.</a> Zebrafish. 3, 191-201 (2006).</li>
<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10(2012).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Bisher hat unsere Gruppe die MNU Modell der Photorezeptordegeneration von Nagetieren in den Zebrafisch-System 9 übertragen. Die folgenden Ereignisse wurden beschrieben und anschließend für bis zu 30 Tage. In dieser Zeit trat vollständige Netzhaut morphologischen Degeneration und Regeneration nach der ersten Behandlung. Erstens zeigt die Histologie eine reduzierte Stange Zellzahl von Tag 3 auf mit einem Minimum an Tag 8. Entsprechend identifiziert TUNEL-Färbung Apoptose von Stäbchen-Photorezeptoren 3 Tage nach...

Vision ist der wichtigste Sinn für den Menschen und seine Wertminderung hat einen hohen sozioökonomischen Auswirkungen. In der entwickelten Welt sind degenerativer Netzhauterkrankungen die häufigste Ursache für Sehverlust und Erblindung bei älteren Erwachsenen 1. Die Ursache der meisten degenerativen Netzhauterkrankungen ist nur teilweise verstanden und therapeutische Lösungen, um verlorene Vision wieder sehr eingeschränkt. Retinitis pigmentosa ist ein typisches Beispiel einer degenerativen Netzhauterkrankungen mit primären Photorezeptorverlust 2-3. N-Methyl-N -nitrosourea (MNU) induziert Degeneration der Netzhaut und ist deshalb weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um Krankheiten mit primären Photorezeptorzelle Tod 4-Modell. Es ist ein Alkylierungsmittel und führt zu gutartigen und bösartigen Tumoren, die in der Regel werden mehrere Monate nach der Belichtung 5-7. Darüber hinaus werden spezifische Photorezeptor Zelltod bewirkt, dass es innerhalb eines kurzen Zeitbeobachtungszeitraum. Dadurch wird der Verlust an retinalen Schicht structure und der wesentlichen Netzhautverdünnung wurden in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet. Netzhaut-Gliazellen aktiviert wurden, aber keine Änderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE) wurden gefunden. Endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress-Apoptose scheint der Hauptweg von MNU Aktion in der Netzhaut 8 sein. Wir haben vor kurzem MNU als chemisches Modell Photorezeptordegeneration im Zebrafisch 9 induzieren. Neben anderen Gründen ist der Zebrafisch (Danio rerio) ist wegen der Ähnlichkeiten der visuellen System zu anderen Wirbeltieren 10 in der visuellen Forschung wichtig. Die äußere Netzhaut enthält den Photorezeptoren, die in vier verschiedenen Zapfentypen mit Spitzenempfindlichkeiten in den ultravioletten, kurze, mittlere und lange Wellenlängen des sichtbaren Spektrums und eine Stange Photorezeptor-Typ gruppiert werden können. In der inneren Körnerschicht (INL) werden die Zellkörper der bipolaren, horizontalen und amacrine Inter gefunden, als well als Zellsoma Müller Gliazellen. In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) die synaptischen Kontakte zwischen Photorezeptoren und der inneren Netzhaut gebildet werden, wohingegen die Zellschicht am nächsten an der Linse ist die Ganglienzellschicht (GC), die Bestandteile lange Axone, die den Sehnerv und die Sehbahn bilden . Synaptischen Kontakte zwischen Ganglienzellen und die Zellen in der inneren Kernschicht in der inneren plexiformen Schicht (IPL) 11 ausgebildet sind. Die RPE liegt außerhalb der neurosensorischen Netzhaut und umgibt die Photorezeptoraußensegmente mit langen apikalen Mikrovilli 12. Weiterhin ist die Zebrafisch hoch regenerativen und Verletzungen ist in der Lage, Gehirn, Retina, Rückenmark, Herz und anderen Geweben 13 nachwachsen. Wenn Netzhautschädigung auftritt, Zellen in der INL, die vermutlich Müller Zellen werden aktiviert und das Potential haben, in verschiedenen Netzhautzelltypen zu differenzieren. Darüber hinaus erzeugen sie auch Stange Vorläufern, die in der ONL befinden. Ein weiteres source, die die Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch mit neuen Zellen liefert die ciliary Randzone. Diese Quelle ist erforderlich, um eine konstante Dichte der Stäbchen-Photorezeptoren in den kontinuierlich wachsenden Zebrafischauge 14 zu erzielen. Die MNU-Modell kann als eine einfache und reproduzierbare Degeneration / Regeneration Ansatz für Netzhautgewebe eingesetzt werden. Aufgrund bestimmter Ähnlichkeiten der biologischen Prozesse im Zebrafisch und in den Menschen könnte dies die Türen zu öffnen, sich zu engagieren Zelltod Wege zu identifizieren und mögliche neuroprotektive Medikamente auszusortieren. Basierend auf einer früheren Studie aus unserer Gruppe, jetzt haben wir veranschaulichen die Methoden dieser MNU-induzierte Zebrafisch-Modell der Netzhaut De- und konsequente Regeneration einschließlich funktionelle Veränderungen mit nach Labor Videos 9.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>294993</td><td>0,80</td></tr>%<tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Eindeckmedium</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>E10521</td><td>Tricain</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, Schweiz&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Normales Serum für Ziegen</td><td>Dako, Glostrup, Dänemark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>320331</td><td>0,20</td></tr>%<tr><td>In situ Kit zur Feststellung des Zelltods</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Schweiz</td><td>11684795910</td><td>TUNEL Kit</td></tr><tr><td>Mayer's Hämalum Lösung</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Methylnitrosourea (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>N4766</td><td>Toxische</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Kanada</td><td>n.a.Paraformaldehyd</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-PCNA&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch (Danio rerio) AB (Oregon) Stamm</td><td>Universität Fribourg, Abt. für Biologie</td><td>n.a.Eigene</td> <td>Fischanlage</td></tr></tbody></table>

methylnitrosoharnstoff (mnu) induzierten netzhautdegeneration und regeneration im zebrafisch: die histologische und funktionelle eigenschaften

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Degenerativer Netzhauterkrankungen, beispielsweise Retinitis pigmentosa, mit daraus resultierenden Schäden Konto Photorezeptor für die Mehrheit der Verlust der Sehkraft in der industriellen Welt. Tiermodelle sind von zentraler Bedeutung, um solche Krankheiten zu studieren. In diesem Zusammenhang wird der Photorezeptor-spezifischen N-Methyl-N-Toxin -nitrosourea (MNU) ist weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um pharmakologisch herbeiNetzHautDegeneration. Bisher haben wir eine MNU-induzierte Degeneration der Netzhaut-Modell in der Zebrafisch, ein weiteres beliebtes Modellsystem in der visuellen Forschung etabliert. Eine faszinierende Unterschied zu den Säugetieren ist die anhaltende Neurogenese im erwachsenen Zebrafisch Netzhaut und ihre Regeneration nach der Beschädigung. Um diese Beobachtung haben wir Sehschärfe Messungen im erwachsenen Zebrafisch eingesetzt quantifizieren. Dabei wurde die optokinetischen Reflex verwendet, um funktionelle Veränderungen in nicht-narkotisierten Fische folgen. Dies wurde mit der Histologie sowie immunhistochemischen staini ergänztng für die Apoptose (TUNEL) und Proliferation (PCNA), die Entwicklungs morphologischen Veränderungen zu korrelieren. Zusammenfassend, die Apoptose von Photorezeptoren erfolgt drei Tage nach MNU Behandlung, die durch eine deutliche Verringerung der Zellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) folgt. Danach wird die Proliferation von Zellen in der inneren Kernschicht (INL) und ONL beobachtet. Hier offenbaren wir, dass nicht nur eine vollständige histologische sondern auch eine funktionelle Regeneration über einen Zeitraum von 30 Tagen auf. Jetzt zu veranschaulichen wir die Methoden zur Quantifizierung und Follow-up Zebrafisch Netzhaut De- und Regeneration mit MNU in einem Video-Format.

Sehschärfe: Der Versuchsaufbau [Ortsfrequenz: 0,042 Kreise / Grad (C / D); Kontrast: 100%; Driftgeschwindigkeit: 20 Grad / Sekunde (d / src); Hintergrundbeleuchtung Helligkeit: 152 cd / m 2] der Studie aktiviert OKR Beurteilung der erwachsenen Zebrafisch. Die mittlere Dauer der VA Messung war etwa 5 - 10 Minuten für jeden Zebrafisch, die das Verfahren gut vertragen. Sehschärfe vor MNU Exposition war 0,577 ± 0,014 Zyklen / Grad (c / d). Abbildung 1 zeigt den Verlau...

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Netzhautdegeneration und die anschließende Regeneration im erwachsenen Zebrafisch mit Hilfe von n Methyl und Nitro ueaa zu induzieren. Dies wird erreicht, indem Wildtyp-Zebrafische zunächst in Wasser inkubiert werden, das N, Methyl, N, salpetriger Harnstoff oder MNU enthält. Die nächste Sehfunktion wird quantifiziert, indem die optokinetische Reaktion oder OKR gemessen und die Sehschärfe zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet wird.Nach der Behandlung werden die Zebrafische eingeschläfert und die Augen für histologische Untersuchungen mittels H- und E-Färbung entkernt, um morphologische Veränderungen im Netzhautgewebe zu beobachten. Schließlich werden zelluläre Veränderungen in der Netzhaut sichtbar gemacht, mit einer spezifischen Färbung für Zelltod und -proliferation. Letztendlich werden die Messung der Sehschärfe und die Quantifizierung morphologischer und zellulärer Veränderungen verwendet, um die retinale D und die Regeneration sichtbar zu machen.Der Hauptvorteil dieses pharmakologischen Modells besteht darin, dass es einfach und schnell anzuwenden ist und bei erwachsenen Zebrafischen eine zuverlässige regionale Degeneration und Regeneration induziert. Um eine NM-Methyl-N-Nitroso-Harnstoff- oder MNU-Behandlung durchzuführen, beginnen Sie mit der Aufbereitung von Wasser mit 150 Milligramm pro Liter trockenem MNU. Gehen Sie bei der Arbeit mit nm-Methyl- und salpetrigem Harnstoff mit Vorsicht vor, da er giftig ist und Krebs, vererbbare genetische Schäden oder Schäden verursachen kann. Ein ungeborenes Kind hält während des Typs AB Stamm, Zebrafisch sechs bis 12 Monate alt unter Standardbedingungen.Setzen Sie die Zebrafische in das MNU-Wasser um und brüten Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie den Fisch dann mit frischem Wasser schnell ab, bevor Sie ihn in ein neues Aquarium ohne MNU umsetzen. Halten Sie den Fisch so lange wie gewünscht unter Standardbedingungen für Experimente.Bereiten Sie die Messung der Sehschärfe vor, indem Sie das Motorsystem starten. Wählen Sie dann im Menü Test und stellen Sie die Optionen auf einfache Treppe ein. Installieren Sie eine mit 500 Millilitern Wasser gefüllte Infusionsflasche etwa einen Meter über dem Motorsystem.Legen Sie einen Zebrafisch in die Untersuchungskammer und schließen Sie ihn an die Infusionsflasche an. Platzieren Sie dann die Untersuchungskammer im Automotive-System. Starten Sie anschließend die Messung und beobachten Sie die Augenbewegung in Echtzeit auf dem Computerbildschirm.Eine positive Antwort oder Ja ist definiert als aufeinanderfolgende Sekunden in die richtige Richtung, während eine negative Antwort oder Nein zufällige Augenbewegungen darstellt, ähnlich denen, die bei stationären Gittern beobachtet werden. Wenn die Augen des Zebrafisches drei oder mehr aufeinanderfolgende optokinetische Reaktionen oder OKRs zeigen, drücken Sie Ja. Wenn nicht, drücken Sie Nein.Extrahieren Sie unter Ergebnisse im Menü die Sehschärfe, die von der Software berechnet wurde, indem sie die Schwelle der Ortsfrequenz des optischen kinetischen Reizes bestimmt, um eine histologische Analyse durchzuführen. Nach dem Einschläfern des Zebrafisches gemäß dem Textprotokoll und beim Keimen verwenden die Augen eine Stärke von 4 % Formaldehyd in PBS, um die intakten Augen 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius zu fixieren, bevor sie eine abgestufte Alkoholreihe verwenden, um die Proben zu dehydrieren, die Proben in Paraffin einzubetten, dann Fünf-Mikrometer-Abschnitte durch den Sehnervenkopf oder ONH zu schneiden und sie auf Glasobjektträger zu montieren. Verwenden Sie anschließend Alam, um die entkarbonisierten Abschnitte fünf Minuten lang zu färben, bevor Sie die Objektträger zweimal in destilliertes Wasser tauchen, gefolgt von 0,2 % Salzsäure und 0,8 % Ammoniak.Legen Sie die Objektträger für mindestens 10 Minuten in Leitungswasser. Übertragen Sie die Schnitte für drei Minuten in Eosin, nachdem Sie die Objektträger gewaschen und mit einer Ethanolserie dehydriert haben. Verwenden Sie ein Einbettmedium, um sie einzubetten, und ein Lichtmikroskop, um die Proben auf Terminal, die Oxynukleotidtransferase, die DUPT-Nick-N-Markierung oder den Tunnel zu untersuchen.Geben Sie 20 Mikrogramm Pronase K pro Milliliter zu den Vergleichsabschnitten und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen haben, geben Sie 50 Mikroliter des Tunnelreaktionsgemisches zu den Schnitten und inkubieren Sie sie in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Nachdem die Proben gewaschen und dreimal für jeweils fünf Minuten gefüttert wurden, verwenden Sie ein Eindeckmedium, das Dappy enthält, um die Objektträger vor ihnen unter einem Fluoreszenzmikroskop zu montieren und eine Färbung des proliferierenden Zellkernantigens oder PCNA durchzuführen.Legen Sie die Proben in eine Antigen-Entnahme, puffern Sie sie und kochen Sie sie drei Minuten lang, bevor Sie sie in TB S3 einmal pro Stunde fünf Minuten lang mit einem Blockierungspuffer waschen und die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dann mit einer Verdünnung von 1 bis 200 Anti-PC NA. Primärantikörper, inkubieren Sie die Proben über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius, nachdem Sie die Proben 23 Mal für jeweils fünf Minuten mit TBS plus Tween gewaschen haben. Verwenden Sie eine Verdünnung von 1 bis 500 Sekundärantikörpern, um die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.Nachdem die Objektträger mit dpi-haltigem Eindeckmedium eingefasst wurden, betrachten Sie sie unter dem Fluoreszenzmikroskop. Diese Abbildung zeigt den Visusverlauf bei adulten Zebrafischen nach der Gabe von 150 Mikrogramm pro Liter MNU. Beginnend mit dem ersten Tag zeigten die Messungen eine deutliche Abnahme der Sehschärfe, die am dritten Tag Minimalwerte erreichte, bevor sie anstieg.Die Behandlung wurde am achten Tag fortgesetzt und erreichte eine vollständige Genesung an Tag 30, wie die histologische Analyse der Netzhautdegeneration des Zebrafischaugens zeigte, die 30 Tage lang nach der MNU-Behandlung beobachtet wurde, einschließlich einer Störung des INL mit Kavitätenbildung des ONL ab dem dritten Tag und mit maximalem Verlust des Stäbchen-ONL, der am achten Tag durch positive Tunnelfärbung in verschiedenen Schichten der sensorischen Netzhaut beobachtet wurde. Es wurde beobachtet, dass die Netzhautdegeneration nach der MNU-Behandlung durch Apoptose verursacht wurde, wobei die Mehrheit der tunnelpositiven Zellen am dritten Tag im ONL gefunden wurde. Zur gleichen Zeit wurden jedoch auch im INL sterbende Zellen gesichtet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Netzhautdegeneration bei erwachsenen Zebrafischen mit m and u-Behandlung induziert und wie man funktionelle und morphologische Veränderungen mit Hilfe von OKR-Messungen und immunhistochemischen Verfahren quantifiziert.

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften (Video) | JoVE Journal

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