Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine Proteinrezeptor-Interaktion mit Hilfe von Oberflächenplasma und Resonanz zu demonstrieren. Dies wird durch Injektion der Nickelionen über die Nitrotriessigsäure oder NTA-Matrix erreicht. Als nächstes wird eines der Proteine, das als Ligand bezeichnet wird, nach einer Blindinjektion auf dem Sensorchip immobilisiert.

Das zweite Protein, das als Analyt bezeichnet wird, wird über den immobilisierten Liganden injiziert. Um eine Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen nachzuweisen, zeigen die Ergebnisse, dass die beiden Proteine vorübergehend mit dem Analyten interagieren und vom Liganden dissoziieren. Die Affinität der Wechselwirkung kann auf der Grundlage der gemessenen Dissoziation und Dissoziationsraten der beiden Proteine berechnet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Pull-Down- oder Immunpräzipitation besteht darin, dass sie vorübergehende oder geringe Affinitätsinteraktionen identifizieren kann, die oft von großen biologischen Folgen sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zu beantworten In der Biochemie, z. B. ob das Protein von Interesse an ein anderes Protein oder ein anderes kleines Molekül bindet, kann die Art der Wechselwirkung bestimmt und die Affinität gemessen werden. Um die Probe vorzubereiten, entfernen Sie alle Aggregate aus dem gereinigten Protein, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie den laufenden Puffer vor und filtern Sie alle Puffer und Proteinproben mit Nullkommafiltern von 22 Mikron. Stellen Sie im Voraus sicher, dass die Filter proteinkompatibel sind, bevor Sie die laufende Pufferflasche an den Pumpeneinlass anschließen. Bewahren Sie 10 Milliliter des Laufpuffers in einem separaten Röhrchen beiseite .

Verdünnen Sie dann die Proben gegen den laufenden Puffer, um Pufferfehlanpassungen zu vermeiden. Als Faustregel gilt, dass für eine stabile Ligandendemobilisierung niedrige Ligandenkonzentrationen mit längeren Injektionen bei niedrigem Durchfluss im Gegensatz zu hohen Ligandenkonzentrationen verwendet werden sollten. Bei kürzeren Injektionen bei hohem Durchfluss Verdünnen Sie das konzentrierte Ligandenmaterial in Laufpuffer auf eine Endkonzentration von etwa 20 Mikrogramm pro Milliliter. Verdünnen Sie schließlich den Analyten in den Laufpuffer auf die gewünschte Konzentration.

Für ein System mit unbekannter Affinität wird ein Bereich von Analytkonzentrationen von 10 Mikromolaren bis 10 Anomolaren in zehnfachen Verdünnungen getestet. In dieser Demonstration wird ein NTA-gekoppelter Chip, der für das Einfangen von Proteinen mit einem Oli-Histidin-Tag geeignet ist, wiederverwendet. Nachdem Sie den gelagerten Chip aus dem Puffer genommen haben, spülen Sie ihn gründlich mit doppelt destilliertem Wasser ab, trocknen Sie ihn sanft ab und legen Sie ihn in die ursprüngliche Hülle.

Um den Chip an das SPR-Gerät anzudocken, öffnen Sie die Sensorchip-Klappe und legen Sie den Chip in die Hülle. Schließen Sie die Tür und drücken Sie den Dock-Chip. Stellen Sie die Temperatur der Chipzelle auf 25 Grad Celsius ein.

Stellen Sie das Probenfach auf sieben Grad Celsius ein, um das Protein während des gesamten Experiments stabil zu halten. Nach der Vorbereitung der Lösungen für das Laden und, wie im Textprotokoll beschrieben, wird das SPR-Gerät mit laufendem Puffer grundiert. Stellen Sie für den nächsten Schritt den Durchfluss auf 50 Mikroliter pro Minute ein.

Definieren Sie die Flusspfade und die Referenzsubtraktion, um die hier beschriebenen Ergebnisse zu erhalten. Legen Sie die Pfade zur Durchflusszelle Nummer eins und zur Durchflusszelle Nummer zwei und zur Durchflusszelle Nummer eins fest, subtrahiert von der Durchflusszelle Nummer zwei, nachdem Sie das geeignete Probengestell ausgewählt haben, und speichern Sie die Ergebnisdatei vor Beginn des Experiments, damit die Daten während des Laufs gespeichert werden. Jedes Experiment besteht aus Zyklen.

Führen Sie klare Aufzeichnungen über die in jedem Zyklus durchgeführten Injektionen und trennen Sie die Liganden, die die Blindinjektion des Puffers laden, und die Analytinjektion in verschiedene Zyklen. Der erste Zyklus ist die Spänevorbereitung und die Nickelbeladung. Stellen Sie sicher, dass der Durchfluss und die Pfade eingestellt sind, und injizieren Sie dann eine Minute lang 350 Millimolare EDTA, um die verbleibenden Moleküle wegzuspülen.

Stellen Sie als Nächstes den Durchfluss auf 10 Mikroliter pro Minute ein. Injizieren Sie dann zwei Minuten lang 0,5 millimolares Nickelchlorid. Nun wird das Chip-Harz mit Nickel-Ionen überzogen.

Zyklus zwei ist die Immobilisierung von Liganden. Stellen Sie den Durchfluss auf 15 Mikroliter pro Minute und den Durchflussweg auf die Durchflusszelle ein. Nummer zwei: Injizieren Sie Ligand A, bis die Werte der Ansprecheinheit oder R ru erreicht sind, die das 10- bis 20-fache des Molekulargewichts des Liganden betragen.

Laden Sie beispielsweise einen Liganden von 50 Kilodalton auf zwischen 501.000 rus. Führen Sie Aufzeichnungen über den erreichten RU-Wert. Stellen Sie dann den Durchfluss auf 15 Mikroliter pro Minute und den Flussweg zur Flusszelle Nummer eins ein, injizieren Sie den Kontrollliganden B bis zum gleichen RU-Wert wie der des Liganden a überwachen Sie die Subtraktion, sensori Graham online, um die Injektionslänge zu kontrollieren.

Stellen Sie als Nächstes den Durchfluss auf 50 Mikroliter pro Minute und den Durchflussweg zur Durchflusszelle Nummer eins und zur Durchflusszelle ein. Nummer zwei: Waschen Sie das System fünf bis 20 Minuten lang, bis sich die Grundlinie stabilisiert hat. Der dritte Zyklus ist die Blindinjektion.

Diese Injektion dient der Blanksubtraktion. Schließen Sie daher alle Komponenten ein, die mit dem Analyten injiziert werden, mit Ausnahme des Analyten selbst. Die Injektionslänge kann je nach der Zeit, die benötigt wird, um das Gleichgewicht zu erreichen, variieren.

Stellen Sie den Durchfluss auf 15 Mikroliter pro Minute ein und stellen Sie den Durchflussweg auf Durchflusszelle Nummer eins und Durchflusszelle Nummer zwei sowie Durchflusszelle Nummer eins ein, subtrahiert von der Durchflusszelle. Nummer zwei: Geben Sie den Befehl weight 30 Sekunden lang ein, um eine stabile Basislinie zu erreichen. Injizieren Sie dann den laufenden Puffer für 13 Sekunden.

Warten Sie 120 bis 600 Sekunden, um die Dissoziationsphase aufzuzeichnen. Die Länge dieses Schritts variiert je nach kd. Je langsamer die Dissoziation ist, desto länger muss dieser Schritt sein.

Der vierte Zyklus ist die Analytinjektion. Kopieren Sie die genauen Bedingungen, die im dritten Zyklus verwendet wurden, und fügen Sie sie ein, damit diese beiden Injektionen später subtrahiert werden können. Ändern Sie die Position des Steckplatzes im Rack von dem Steckplatz, in dem sich die Kontrolllösung befindet, in den Steckplatz, der die Analytlösung enthält.

Wählen Sie eine Konzentration, die leicht über der erwarteten Gleichgewichtsdissoziationskonstante liegt. Wenn keine Vorkenntnisse vorhanden sind, wählen Sie einen Mikromolaren als guten Ausgangspunkt. Nachdem Sie die Pufferinjektion und die Analytinjektion ein zweites Mal durchgeführt haben, führen Sie die Chipsauslösung des siebten Zyklus durch.

Stellen Sie den Durchfluss auf 50 Mikroliter pro Minute ein und injizieren Sie dann eine Minute lang 350 Millimolar EDTA. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal. Verwenden Sie keine einmalige Injektion von drei Minuten, da dies den Chip beschädigen kann.

Injizieren Sie anschließend eine Minute lang 0,25% Natriumdcalsulfat. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Verwenden Sie keine einmalige Injektion von drei Minuten, da dies den Chip beschädigen kann. Nach der Nickelbeladung wird der interessierende Transporter auf der Durchflusszelle Nummer zwei bis zu 3.500 R rus immobilisiert.

Dann wird der Kontrollligand bei gleicher Durchfluss- und Injektionsdauer in die Durchflusszelle Nummer eins injiziert, wobei er zunächst nur bis zu 3000 R reicht, um sicherzustellen, dass auf beiden Flusszellen ähnliche Proteinmengen immobilisiert werden. Der Kontrollligand wird mit kürzerer Injektion weiter beladen, während die Beladung bis zu 3.500 RDUs überwacht wird. Die Treppenform stellt die allmähliche Zunahme der Masse an der Durchflusszelle Nummer eins bei jeder Injektion dar, hier ist die Flusszelle Nummer eins, subtrahiert von der Durchflusszelle.

Zweitens ist es wichtig, die Dauer der Ligandeninjektion zu variieren, um eine gleichmäßige Belastung zu erreichen. Im Gegensatz dazu muss die Dauer der Analytinjektion für alle verwendeten Konzentrationen konstant gehalten werden, um quantitative Daten zu erhalten. Es wird eine Reihe von Analytkonzentrationen injiziert.

Hier sind Injektionen unterschiedlicher Analytkonzentrationen mit konstanter Injektionslänge dargestellt. Die verschiedenen Analytkonzentrationen werden in zufälliger Reihenfolge injiziert und die Doppelblind-Sensorikgramme werden vor der Analyse auf der x-Achse ausgerichtet, um die Affinitäts- und Geschwindigkeitskonstante abzuleiten. Es wird eine Modellanpassung angewendet.

Die berechnete Gleichgewichtsdissoziationskonstante für die mod BCA-Wechselwirkung beträgt ungefähr dreimal 10 hoch minus sechs molar mit einer mäßig schnellen KA und schnellen KD Einmal gemeistert. Diese Technik kann innerhalb weniger Stunden nach dem Ansehen dieses Videos durchgeführt werden. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein SPR-Experiment mit Ihrem interessierenden Protein entwerfen und durchführen.