Name: Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Zytotoxizitätsanalyse in menschlichem Vollblut mit Einzelzellauflösung. Diese Methode nutzt Hochdurchsatz-Bildgebung und Fluoreszenzmikroskopie zur quantitativen Bewertung von Antikörper-Wirkung bei Lymphomzellen.

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Wir danken National Cancer Institute IMAT Programm von NIH für die Finanzierung dieser Arbeit [R33 CA174616-01A1].

1. Zielzellpräparation <ol><li> Aufrechtzuerhalten Zielzellen (z. B. Raji-Lymphomzellen) in Wachstumsmedium (RPMI 1640-Kulturmedium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 4 nM L-Glutamin und 500 IU / ml Penicillin / Streptomycin) bei 37 o C in einer 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe auf die Zielzellen zu pelletieren in einer 15 ml Tube. Zentrifugation Zeit schwankt mit verschiedenen Zelltypen; Zentrifuge für 3 Minuten bei 468 × g für Raji-Zellen. </li><li> Zuerst absaugen alle Blasen auf der Oberfläche des Überstandes gebildet, und entfernen Sie das gesamte Überstand. </li><li> 10 ml PBS auf die Röhre. Re-suspend die Zellen durch Pipettieren der Lösung nach oben und unten mehrmals zum Aufbrechen der Zellklumpen. </li><li> Zentrifugen die Probe für 3 Minuten bei 468 x g. </li><li> Saugen Sie keine Blasen an der Oberfläche des Überstandes gebildet, und entfernen Sie das gesamte Überstand. </li></ol> 2. Herstellung von Zellmikroarrays <ol><li> Obtain Zellhaftung 96er Platte Kits oder Einzelzellenanordnung 8 auch Kammer-Objektträgern (siehe Tabelle der Werkstoffe / Reagenzien). </li><li> Gelten 1,2 &amp; mgr; l des Aktivators zu der DNA-Reagens aus dem Satz. Verschließe das Röhrchen, invertieren, und schütteln, um die Lösung zu mischen. </li><li> Die Lösung wird für 20 min bei RT reagieren. </li><li> Anwendung der gemischten Lösung auf den Zielzellen Pellet (in der 15-ml-Röhrchen). </li><li> Hinzufügen grüne Fluoreszenz cytosolischen Farbstoffe in einer Endkonzentration von 500 nM. </li><li> Inkubieren der Zielzellen mit der gemischten Lösung und des Farbstoffs 30 Minuten lang bei RT auf einem Orbitalschüttler. </li><li> Mit 5 ml PBS Waschen Sie die Zellen zweimal, und die Zellen resuspendieren in 10 ml Wachstumsmedium. </li><li> Anwendung 100 ul der Lösung aus Schritt 2.7 in jede Vertiefung. Zählen Sie die Zellzahl durch Verwendung eines Hämacytometers. Sicherstellen Zellzahlen im Bereich zwischen 5 x 10 4 bis 1 × 10 6 Zellen pro Vertiefung. </li><li> Nach 10-15 min Inkubation bei RT, vorsichtig waschen die Proben zweimal mit 200-300 ul Wachstumsmedien, um alle ungebundenen Zellen zu entfernen. HINWEIS: Über 5-10 ul Wachstumsmedien bleibt in jeder Vertiefung nach dem Waschen. </li></ol> 3. Vollblut Zytotoxizitätsassays <ol><li> In 180 ul menschlichem Vollblut zu jeder Probe auch. </li><li> Erhalten Anti-CD20-Antikörper-Lösung auf 5 mg / ml, und führen serielle Verdünnung um 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml Anti-CD20-Antikörper-Lösung in 1,5-ml-Röhrchen. In 20 ul jeder Konzentration der Anti-CD20-Antikörper zu jeder Probe und machen dreifach. </li><li> Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 500 nM zu jeder Vertiefung. </li><li> Inkubieren der resultierenden Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 16 Stunden. </li><li> Bild der Zellen auf dem Objektträger oder 96-Well-Platten mit einer automatischen Bildsystem mit 8-facher Vergrößerung. </li><li> Verwenden Sie die Zellzählung Programm des automatischen Imaging-System, um die Ergebnisse zu quantifizieren. Hinweis: Die Software des automatischen Imaging-System bietet eine einfacheSchritt-für-Schritt-Operationen zur Zellzählung. Das Protokoll für die Verwendung dieser Software kann auf der Website Anbieters finden. </li><li> Wählen Sie [Rückblick Ergebnisse] von der Hauptseite der Software. </li><li> Wählen Sie [die gespeicherte für die Proben Datei]. </li><li> Erstes Tor FITC mittlere Intensität&gt; 50, dann Gate TxRed mittlere Intensität&gt; 20. </li><li> Wählen Sie [Teller Übersicht]. </li><li> Wählen Sie [Tabellen exportieren]. HINWEIS: Die prozentuale Zellabtötung Formel des Programms ist unten gezeigt: % Zielzelle Tötung = (Anzahl der Zellen gefärbt grün und rot / Anzahl der Zellen gefärbt grün) * 100% </li></ol>

<ol><li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li>
<li>Moreno, L., Pearson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attrition+rates+be+reduced+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Informa+healthcare%22%5BJournal%5D)">Attrition rates be reduced in cancer drug discovery.</a> Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).</li>
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<li>Eastwood, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+TGN1412+trial+failure+explained+by+species+differences+in+CD28+expression+on+CD4%2B+effector+memory+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells.</a> Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).</li>
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<li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening%3A+solution-+and+cell-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+is+more+than+genomic+medicine%3A+confusion+over+terminology+impedes+progress+towards+personalized+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22PERS+MED%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare.</a> PERS MED. 9, 85(2012).</li>
</ol>

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

WCA ist ein kritischer in vitro Anti-Krebs-Screening-Tool mit Einzelzellauflösung 12-16, idealerweise nach traditionellen Zielvorführungen wie CDC und ADCC-Assays 9-11, und vor präklinischen Tierversuchen verwendet. Derzeit sind primäre Ziel Screening-Assays wie CDC oder ADCC-Assays alle in einer vereinfachten Medien oder eines Puffersystems durchgeführt. , Wirkstoffkandidaten, die Wirksamkeit in diesen vereinfachten Puffersystem zeigen, sind jedoch nicht immer wirksam in der komplexeren V...

Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem erhöhten Interesse an der Verwirklichung der spezifischen Identifikationen von Tumorzell-Antikörper und personalisierte Krebstherapien führten; sind jedoch mehrere Hindernisse in dem Verfahren auftreten. Nur 5% der Mittel, die Antikrebsaktivität in der präklinischen Entwicklung haben werden, nachdem dafür ausreichende Wirksamkeit in Phase II-III Test 1,2 lizenziert. Die vorklinische Strategien (sowohl in vitro als auch in vivo) sind suboptimal, wie viele Beispiele wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Blutkomponenten 3-5 gezeigt, dass die Antitumor-Arzneimittel in der Human- und vor allem in Labortieren unterschiedlich verhalten. Um die Notwendigkeit eines Antitumor Wirkstoff-Screening-Plattform zu wenden und eine Check-Punkt vor kostspielige Tierversuche und klinische Studien zu schaffen, ist eine menschliche Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) zur Auswertung antitumorale Wirksamkeit von Medikamenten in einer relevanten biologischen Umgebung vorgeschlagen. DieVollblut-Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die Reaktion einzelner Zellen, Antikörper und andere Wirkstoffkandidaten in menschlichem Vollblut zu bewerten. Der WCA wird durch den Einbau von Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit hohem Durchsatz und High-Content-Imaging-6 entwickelt. Durch Verwendung eines automatischen Abbildungssystem kann sowohl die Anzahl der lebenden und toten Zellen, die mit einem hohen Grad an Genauigkeit bestimmt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zielzellen auf der gleichen Brennebene immobilisiert ist WCA Lage, quantitative Zytotoxizität Analyse in Echtzeit ohne die Entfernung der roten Blutzellen bereitzustellen. Darüber hinaus stellt die automatische Abbildungssystem mehrere Vorteile, wie dass nur Zielzellen, die die angegebenen Kriterien erreicht haben (z. B. fluoreszenzmarkierten Zellen und Zellmorphologie) sind geschlossene und verarbeitet. Auch ermöglicht es die Produktion von 144 Platten pro Tag. Folglich diese Abbildungsfähigkeit und Durchsatz ermöglicht Betrieb von High-cNHALT und Hochdurchsatz-Experimenten gleichzeitig. Durch die Kombination von WCA und der Automated Imaging System können hohe Durchsatz quantitative Zellcytotoxizität Analyse innerhalb einer biologisch relevanten Umwelt erreicht werden.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Plattenkits für die Zellanhaftung&nbsp;</td><td>Adheren</td><td>AP9601</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Einzelzell-Array 8-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Adheren</td><td>SS0801</td><td></td></tr><tr><td>Adhärent Einzelzell-Array 8-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Adheren</td><td>SS0802</td><td></td></tr><tr><td>Lymphom-Zelllinie CD20+</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Raji-Zellen</td></tr><tr><td>Lymphom-Zelllinie CD20-ATCC</td><td></td> <td>CRL-8083</td><td>MC/CAR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo</td><td>SH30070.01HI</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Zytosolischer Farbstoff</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Cell Tracker Grünes</td></tr><tr><td>Rituxan (Biosimilar)</td><td>Eureka Therapeutics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Vollblut</td><td>Allcells</td><td>WB001</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodid</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Automatisches Bildgebungssystem</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Kontakt Anbieter</td><td>Cell Reporter</td></tr><tr><td>Zellzählprogramm</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Kontakt Anbieter</td><td>Cell Reporter</td></tr></tbody></table>

echtzeit-zytotoxizitätsassays in menschlichem vollblut

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Ein Live-zellbasierten Vollblut Zytotoxizitätstest (WCA), die Zugriff auf Zeitinformation des gesamten Zell-Cytotoxizität kann mit Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie entwickelt. Die gezielten Tumorzellpopulationen werden zuerst die Immobilisierung in ein Array-Format vorprogrammiert und mit grün fluoreszierenden cytosolischen Farbstoffen markiert. Im Anschluss an die Zellenanordnung Bildung werden Antikörper-Medikamenten in Kombination mit menschlichem Vollblut zugegeben. Propidiumiodid (PI) wird dann zugegeben, um den Zelltod zu bewerten. Die Zellenanordnung ist mit einem automatischen Abbildungssystem analysiert. Während cytosolischen Farbstoff beschriftet die gezielte Tumorzellpopulationen, Etiketten PI die toten Tumorzellpopulationen. Somit kann der Anteil der Ziel-Krebszelltötung durch die Berechnung der Anzahl der überlebenden Zellen gezielt auf die Anzahl der toten Zielzellen zu quantifizieren. Mit diesem Verfahren können die Forscher zeitabhängig und dosisabhängige Zell-Cytotoxizität Informationen zuzugreifen. Bemerkenswert ist, keine gefährliche RadioChemikalien verwendet werden. Die hier vorgestellte WCA hat mit Lymphom, Leukämie und soliden Tumorzelllinien getestet. Daher ermöglicht WCA Forscher Wirksamkeit von Medikamenten in einem hoch relevanten ex vivo Zustand zu beurteilen.

Anti-CD20-Antikörper und Lymphomzellen (Raji-Zellen und MC / CAR) wurden als Modellsystem, um die Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) 7,8 demonstrieren gewählt. Raji-Zellen hatte eine hohe Kopienzahl von CD20 auf der Zelloberfläche, während MC / CAR Zellen hatten niedrige Kopienzahl von CD20 auf ihrer Membran. Zielzellen wurden zunächst grün mit grünen Fluoreszenz cytosolischen Farbstoffen gefärbt und auf der 96-Well-Platte angeordnet. 10,000 - 50,000 Ziellymphomzellen wurden in jede Vertiefung immobilisiert. ...

Das Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ist ein Zytotoxizitätstest durch Einbau Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildverarbeitung entwickelt. Hier beschreiben wir, wie Lymphom-Zellen mit einem anti-CD20-Antikörper behandelt werden können, in Echtzeit in menschlichem Vollblut zur quantitativen Analyse bereitzustellen zelluläre Zytotoxizität untersucht werden.

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zytotoxizität von Zielkrebszellen im menschlichen Vollblut mit Einzelzellauflösung zu messen. Zunächst wird ein Einzelzellarray von Zielkrebszellen erzeugt. Menschliches Vollblut wird dem Zellarray zugesetzt und Medikamente wie Antikörper werden appliziert. Die Zellen werden dann mit einem Zellviabilitätsfarbstoff wie Propidium, Jodid inkubiert, und die Hochdurchsatzbildgebung wird verwendet, um die Anzahl der toten Zielkrebszellen zu messen, die rot gefärbt sind, was letztendlich die Wirksamkeit der Zytotoxizität des Arzneimittels gewährleistet.Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden wie LDH- und Chrom-Assays besteht darin, dass die Abtötung von Krebszellen in menschlichem Vollblut mit Bildgebungsfunktionen durchgeführt werden kann. Mit dieser Methode kann die Zytotoxizität von Antikörpern in vitro vor der Tierstudie bewertet werden. Beginnen Sie mit der Erlangung der Zellanheftung 96. Well-Platten-Kits oder Acht-Well-Kammer-Objektträger mit Einzelzellrate, hier wird die 96-Well-Platte verwendet.Tragen Sie 1,2 Mikroliter des Aktivators auf das Röhrchen mit dem DNA-Reagenz aus dem Kit auf, verschließen Sie das Fläschchen

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Forschung

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Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung der Aktivität von CAR-T-Zellen gegen Krebszellen durch elektrische Impedanzmessungen in Echtzeit. Die Verfolgung von Impedanzänderungen bewertet die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen bei der Induktion der Zytolyse von Krebszellen und gibt Einblicke in ihre zytotoxischen Fähigkeiten.

Ein Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von CAR-T-Zellen

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Diese Arbeit beschreibt einen fortgeschrittenen Arbeitsablauf zur genauen und schnellen Bestimmung der NK-Zellzahl (Natural Killer) und der Zytotoxizität von NK-Zellen in menschlichen Blutproben.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Vollblutbasierte Immunoassays bieten ein einfaches und ressourceneffizientes Werkzeug zur Analyse der antigenspezifischen Immunität für Diagnose- und Forschungszwecke. Dieser Artikel bietet ein optimiertes Vollblut-basiertes Protokoll mit dualer Co-Stimulation für eine umfassende Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger, einschließlich einer Version mit geringem Volumen für pädiatrische Patienten und Kleintiere.

Vollblutassay mit dualer Co-Stimulation zur antigenspezifischen Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Echtzeit-Zytotoxizitätsanalyse in menschlichem Vollblut mit Einzelzellauflösung. Diese Methode nutzt Hochdurchsatz-Bildgebung und Fluoreszenzmikroskopie zur quantitativen Bewertung von Antikörper-Wirkung bei Lymphomzellen.

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

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