Name: Ausbreitung von Homalodisca coagulata Virus-01 Über Homalodisca vitripennis Zellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Vermehrung von HoCV-1 in Homalodisca vitripennis-Zellkulturen mittels RNA-Extraktion und qRT-PCR-Quantifizierung. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Studien viraler Replikationsmechanismen.

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Wir möchten dem Texas Pierce's Disease Research and Education Program und USDA-APHIS für ihre finanzielle Unterstützung dieses Projekts danken. Wir möchten uns auch bei Hema Kothari vom Health Science Center der University of Texas in Tyler für ihre Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie bedanken.

1. Zellkultur HINWEIS: Homalodisca vitripennis von der Dr. Wayne Hunter Labor an der USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) etablierten Zelllinien wurden verwendet, um einem Labor stock gemischten Zellstadien einschließlich Anfangs Fibroblasten und Monoschichten zu initiieren. <ol><li> Führen Sie die folgenden Verfahren in einer sterilen Laborumgebung in einem Temperaturbereich von 20-24 ° C mit 25 cm 2 Kulturflaschen gehalten. </li><li> Kultivieren und Kulturen mit H2G + Leafhopper Medium, eine modifizierte WH2 Honigbiene Medien 10 (Tabelle 1) zu halten in 25 cm 2 Zellkulturflaschen. </li><li> Kulturkolben inkubieren bei 24 ° C mit ~ 53% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei einer Gesamtvergrößerung (TM) von 100X zu Kultur Wachstum zu überwachen, zB auf eventuelle abnorme Zellwachstum überwachen für eventuelle Verunreinigungen und prüfen Wachstum Fortschritte in der Sackgassetur Oberfläche. </li><li> Führen Sie eine vollständige Mediumwechsel (~ 4 ml Kulturmedium pro Kolben) alle 7 - 10 Tagen, ohne die Kulturfläche zu stören. </li><li> Kulturen passieren, wenn das Kulturfläche von etwa 80% des Zellwachstums (konfluent) unter Verwendung von 0,25% Trypsin enthält, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellen zu dissoziieren bedeckt. Fügen ~ 2 - 3 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und setzen Kultur (en) für das Enzym für kurze Zeit (5 - 10 min), um eine vollständige Zell-Dissoziation zu erzielen. </li><li> Füge eine gleiche Menge an frischem Medium zu dem Kulturgefäß (en) (~ 2 - 3 ml) auf die Enzymaktivität zu stoppen und übertragen die gesamte Lösung in ein konisches Rohr zum Zentrifugieren. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C für 6 min bei 350 x g beträgt. </li><li> Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und fügen ~ 8 ml frisches Medium zu jedem Röhrchen. Sanft homogenisieren Zellen mit einer Pipette. </li><li> Split Kulturen bei einem 1: 2-Verhältnis von 25 cm 2-Kolben (ca. 4 ml Zell solutiauf pro Kolben) und lassen frisch geleitet Kulturen ungestört für 48 Stunden, sodass die Zellen in Suspension zu fest an der Oberfläche des Kolbens verbinden. HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen in 48-Well-Gewebekulturplatten mit sterilen mit einer Wachstumsfläche von 1 cm 2 ist ebenfalls möglich, und sie können in der gleichen Weise wie Kulturflaschen mit einer Verringerung des Volumens des Kulturmediums auf ~ 250 ul gehalten werden. </li></ol> 2. Ganzvirus-Extraktion <ol><li> Homogenisieren ganzen Körper des Virus positive H. vitripennis in Phosphatpuffer, pH ~ 7,2, mit 0,02% Natrium-Trihydrat (DETCA) durch Vortexen für ~ 10 Sekunden-Intervallen, bis es keine weitere große Klumpen von Gewebe vorliegen. Extrahieren Virus durch Super Zentrifugation bei 124.500 xg für 4 h bei 4 ° C oder 22.000 × g für 16 h bei 4 ° C ist. Wenn ein Niederschlag bildet an der Spitze, entfernen Sie sie mit einem sterilen Wattestäbchen 11. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Sammeln Sie die Pellet-undAuflösen mit 5 ml 10 mM Phosphatpuffer (kein DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-Desoxycholsäure und 4% Polyethylenglykol Hexadecylether (Brij 52). <ol><li> Um das Pellet gut mischen, entfernen Sie das Pellet von der Seite der Röhre und zerquetschen, bis in der Lösung, wenn nötig. </li><li> Noch 10 mM Phosphat-Puffer in ~ 5 ml-Schritten zu helfen, das Pellet in Lösung gehen, wenn nötig und kombinieren in 2 Röhren 11. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 g für 15 min 11. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die heiße Lösung durch einen 0,45-um-Filter, und das Filtrat in großen Sammelrohr 11. </li><li> Übertragungs Filtrat einer Dialysemembran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze (MWCO) von 3,5 kD, mit kleinen Mengen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) nicht enthält, wenn nötig DETCA 11. </li><li> Platzieren der Dialysemembran in ein großes Becherglas mit ddH 2 O bei 4 ° C gefüllt. Ändern Sie die ddH2O jede Stunde foder 5 - 6 Stunden, bis sich ein weißer Niederschlag bildet in der Membran 11. </li><li> Sammeln des gereinigten Virus in der Membran und unterziehen die 100% Virus-Lösung zu einer 10-fachen Verdünnungsreihe durch Zugabe von 10 ul der Lösung zu 90 ul ddH 2 O. Anschließend weitere 90 ul ddH2O hinzufügen 10 ul der Verdünnung bis zu einer Verdünnung von 1: 100.000. </li><li> Shop-Virus-Lösung bei -80 ° C. </li></ol> 3. Virusreplikation <ol><li> Samenzellen in 48-Well-Kulturplatten wachsen, bis alle Zeilen Zellwachstum beträgt 80% konfluent (etwa 72 Stunden nach der Pass, wenn Zellen mit einer durchschnittlichen Rate wächst). </li><li> Impfen jede Zeile von Zellen mit der Serien verdünnten Virus einmal das Zellwachstum erreicht Konfluenz, dh eine Zeile einer Verdünnung von 1:10, eine Zeile einer 1: 100 Verdünnung, usw., mit Ausnahme der oberen Reihe. Verwenden Sie die obere Reihe als Kontrolle und fügen Sie 10 ul ddH 2 O in jede Vertiefung als Lautstärkeregler. <ol><li> Um eine Ausgangsbasis erhoben Zellkonzentration für den Vergleich mit experimentellen Zellzahl vor der ersten Impfung aller Brunnen in den Kulturen mit dem Virus zu schaffen, distanzieren und zählen Sie die erste gut jeder Zeile. </li></ol></li><li> Überwachen Kulturplatten alle 24 h nach der Virusimpfung für eine Farbänderung in dem Medium, das eine pH-Veränderung und Änderung in der Zellmorphologie. </li><li> Bild einer Spalte der Testplatte zu jedem Zeitpunkt, mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher TM. </li><li> Entfernen Sie alle Medium aus der Spalte, die bei jedem 24-Stunden-Zeitpunkt abgebildet wurde und speichern sie kurzfristig bei -20 ° C für die RNA-Extraktion und Quantifizierung viraler oder langfristig bei -80 ° C. </li><li> Distanzieren Zellen aus den Vertiefungen nach der Entfernung des Mediums, wie zuvor beschrieben, in den Schritten 1.6 - 1.9 mit nur ~ 250 ul 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität und ~ 250 ul frisches Medium zu stoppen zum Resuspendieren der Zell Pellet. </li><li> Fügen Sie 10 ul von 0,4% Trypanblau-Färbung zu jedem Röhrchen mit Zellen zu Zellzahlen nach der Zell Dissoziation für jeden Zeitraum von 24 h über eine Woche durchzuführen. Ermöglichen Fleck für 10 min, bevor Zellzahlen zu sitzen. <ol><li> Führen Zellzahlen innerhalb 1 h der Exposition gegenüber Flecken oder lebensfähige Zellen zu färben beginnt und nicht lebensfähigen Zellen Aufnahme. </li></ol></li><li> Langsam 10 ul der gefärbten Zelllösung zu jeder Seite eines Standard-Hämozytometer unter Verwendung einer Mikropipette. Lassen Sie die Lösung durch Kapillarwirkung aufgenommen werden, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen (nicht fleckig) Zellen auf beiden Seiten der Zählkammer (das Äquivalent von 4 zählt der 16 Plätze in der Zählkammer). Führen Zellzahlen für jede Vertiefung der Spalte, die entfernt wurde. </li><li> Der Mittelwert der Zellzahlen aus jeder Spalte und verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzellzahl-Nummer zu erhalten: (Anzahl der Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor = Anzahl der Zellen x 10 <sup&gt; 4 ml. Dies ist die Zelldichte oder die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Kultur. </li></ol> 4. Virus Extraktion aus Zellkultur <ol><li> Entfernen behandelt H. vitripennis Zellen aus Kulturflaschen wie zuvor in den Schritten 1.6 beschrieben - 1.8, mit nur ~ 250 ul von 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität zu stoppen. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Auszug Virus von Kulturzellen nach dem Protokoll zuvor in Schritten 2.3 - 2.8. </li></ol> 5. RNA-Extraktion <ol><li> Extrahieren von RNA aus Proben, die während jedes Medium eine Woche Virus Versuch unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion für flüssige Proben nach Herstellerprotokoll, gesammelt. </li><li> Speicher extrahierten Proben bei -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Virus etablieren Standards für RT-PCR, indem Sie traditionelle PCR unter Verwendung derPrimerpaar HoCV RT-PCR-Primer 1 (vorwärts 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-Reverse ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;), mit einem Virus zu isolieren, aus ganzen Körper H. vitripennis. </li><li> Gegenstand PCR-Produkts einer Elektrophorese für 60 min in einer 2% igen Agarose-Gel, enthaltend 0,1% Ethidiumbromid-Gel bei 120 V. </li><li> Auszuschneiden die Bands aus dem Gel und reinigt mit einem Gel-Extraktions-Kits nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Pool alle ausgeschnitten und aufgereinigt Produkt weiter zu reinigen und durch Grundethanolfällung. Zugeben und das Fällungsprodukt in etwa 30 ul Tris EDTA (TE), um die Gesamtprobenkonzentration zu erhöhen. </li><li> Quantifizierung der Ebene der cDNA in gepoolten Proben über Spektrophotometrie mit 260/230 Wellenlänge Einstellungen für Nukleinsäure-Nachweis. </li><li> Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe des gereinigten Probe von 57 ng / ul bis 57 ag / ul (10 -18). Führen die Verdünnungs ähnlich der beschriebenen in 2,8 Anpassungen für den Unterschied in der Konzentration Anforderungen gestellt. </li><li> Bestimmen Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihe, indem qRT-PCR unter Verwendung eines qRT-PCR-Kit mit zuverlässige Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte. HINWEIS: Viral-Konzentrationen von weniger als 5 x 10 -3 Kopien sind nicht nachweisbar. </li><li> Extrahieren von RNA aus Versuchsproben, wie zuvor in Schritt 5.1 beschrieben und quantifiziert unter Verwendung von Spektrophotometrie analysiert. </li><li> Normalisieren alle extrahierten Proben bis 5 ng / ul mit Nuklease freiem Wasser. </li><li> Führen qRT-PCR bei allen Proben, in Dubletten, 25 ul Reaktionen mit Hilfe eines Ein-Schritt-qRT-PCR-Kit mit der Fähigkeit zu einer geringen Kopienzahl spüren wie folgt: 50 ° C zu halten für 10 min; 95 ° C halten für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec; schmelzen 50-99 ° C für 5 s auf jedem Schritt. <ol><li> Machen Sie den Master-Mix, so dass jeder Reaktionsgemisch enthält 12,5 ul 1x Master-Mix, 1,0 ul (0,3 uM) von Vorwärts-Primer, 1,0 ul (0,3 uM) der Reverse-Primer, 0,25 ul der reversen Transkriptase und variable Mengen an Template auf Basis von Standardisierung Werte. </li><li> Bringen die Gesamtreaktionsvolumen auf 25 ul mit RNase freiem Wasser. </li><li> Gehören fünf Standard-Konzentrationen in jedem PCR-Lauf mit den folgenden Kopienzahl: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 und 5 x 10 -2 Exemplaren. Die Schwelle für jeden Durchgang, um nur unter einem Fluoreszenz von -2,5 bis 10x Rauschen während frühen Erwerb zu Beginn jedes Durchlaufs zu verringern. </li></ol></li></ol> 7. konfokale Mikroskopie <ol><li> Wachsen Homalodisca vitripennis Zellen in einem zwölf Well-Platte mit Deckgläschen Mess 18 mm Durchmesser in jede Vertiefung. </li><li> Beimpfen von einer Spalte auf der Platte alle 24 Stunden für einen Zeitraum von vier Tagen, wenn eine Monoschicht erreicht wird. Sicherzustellen, dass jedes cPALTE auch eine Steuer, eine niedrige Virusverdünnung (1:10) gut und eine hohe Virusverdünnung (1: 100.000) gut. Verwenden von Schritt 2.8 erhalten Virus-Lösungen. </li><li> Entfernen Sie alle Medien auf dem fünften Tag und waschen die Zellen zweimal mit 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixierung der Zellen mit kaltem 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Gib 500 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu den Zellen und waschen sie für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Dreimal Waschen Sie die Zellen. </li><li> Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 zu den Zellen, um sie zu permeabilisieren. Lassen Sie sich für 10 min bei RT. </li><li> Wasche die Zellen erneut, wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben. </li><li> Gib 500 ul einer 5% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung zu den Zellen bei RT blockieren. Lassen Sie sitzen für 2 Stunden und dann zu entfernen. </li><li> Verdünnen Lager Rhodamin rot-Phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS mit 5% BSA und 250 ul der Verdünnung auf jeweils gut Färbung für F-Aktin. </li><li> Abdeckplatte aus Aluminium fÖl, um den Farbstoff aus Bleich verhindern und Inkubation Zellen bei 4 ° CO / N. </li><li> Entfernen Sie die RCP nach 12 h Inkubation und ersetzen Sie es mit 250 ul 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (250 ug / ml) in 1x PBS mit 5% BSA, um die Kerne der Zellen zu färben . </li><li> Inkubieren der Zellen mit DAPI bei RT für 1 Stunde. </li><li> Waschen Zellen dreimal mit 1x PBS wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen und montieren auf Objektträger mit einer Montage Medien mit einer Anti-Fade Reagenz. </li><li> Die Objektträger trocknen in lichtdichten Kästen, bis unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet. Ansicht Präparate so bald wie möglich als Farbstoffe schnell verblassen. </li><li> Bild gefärbten Zellen mit einem konfokalen System mit einem Mikroskop, das eine 63X (Öl) Plan-apochromate Objektiv ausgestattet. <ol><li> Stellen Sie die Laserwellenlängen um 543 ± 10 nm Anregung und 575 ± 10 nm Emissions für Rhoadmine rot-conjucated Phalloidin, Und 369 ± 10 nm Anregung und 450 ± 30 nm Emissions für DAPI. </li><li> Identische Verstärkung und Offset-Einstellungen für den Detektor, um alle Bilder zu erhalten. </li><li> Prozessbilder mit Hilfe geeigneter Software für die Bildverarbeitung und Sortierung und Import gewünschten Bilder in eine Bildverwaltungssoftware. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Steigende Besorgnis über den Zustrom von invasiven landwirtschaftlichen Arten haben zu einer erhöhten Nachfrage nach neuen Methoden, um gegen neue Schädlinge und Krankheitserreger zur Wehr zu führen. Ein Schwerpunkt der Krankheitsprävention und-Management umfasst die Verwaltung von Vektoren und Krankheitserreger war das primäre Ziel dieser Studie. Wirtschaft spielen eine wichtige Rolle bei der Entscheidung, diese Art von Erreger zu Biopestizid Vektoren in der Landwirtschaft verwalten, weil die praktische Anwendung, um g...

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis Germar 1821) hat als vorherrschende Vektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) in Nordamerika 1 identifiziert worden, die Erreger der Pierce-Krankheit der Weinrebe (PD). Insektenpopulation Management hat sich schnell zum Mittelpunkt der Forschung werden in Kalifornien und über den Süden der Vereinigten Staaten gegen diese verheerende Problem für den Weinbau Industrie. Ein positiv Sinn, Einzelstrang-RNA-Virus aus der Familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) bei Wild H. identifiziert vitripennis Bevölkerung und gezeigt, dass die Sterblichkeit in diesen Bevölkerungsgruppen 2-4 zu erhöhen, bei gleichzeitiger Senkung des Insekts Widerstand gegen Insektizide. Entwicklung von Methoden, um effektiv hinten infiziert H. vitripennis in einer Laborumgebung Erwachsenenalter schwierig gewesen, weil <em&gt; H. vitripennis unterschiedliche Phase-spezifische Ernährungsbedürfnisse, die eine Vielzahl von Wirtspflanzen 5-8 erfordern. Spezifische Ausstattung und hinten Live H. erforderlich vitripennis in den Vereinigten Staaten; Daher ist die Zellkultur kostengünstiger und eine praktikable Alternative sowie zunehmend wichtig für HoCV-01-Erkennung und Replikation 2,9. Während die grundlegenden Methoden zur Festlegung von Zellkulturen von H. vitripennis beschrieben sind diese Verfahren noch nicht für eine kommerzielle Produktion von biologischen Bekämpfungsmittel verwendet worden, wie beispielsweise Viren 2. Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, eine hohe Konzentration von HoCV-01 eignet sich für den Einsatz als biologische Bekämpfungsmittel zu produzieren. Virale Replikation erfordert eine lebende Zelle, weshalb erfolgreich zu kultivieren und zu optimieren H. vitripennis Kulturen ist von entscheidender Bedeutung für den Fortschritt der Herstellung eine gewinnbringende Virus.

<table><tbody><tr><td>Corning Zellkulturflaschen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Oberfläche 25 cm2, schräger Hals, Kappe (Steckdichtung)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Inverses Mikroskop und</td></tr><tr><td>Kamera Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0,25%, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen, 2,5 g Schweinetrypsin und 0,2 g EDTA &bull; 4Na pro Liter Hanks&prime; Balanced Salt Solution mit Phenolrot</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Multiwell-Kulturplatten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 Wells (TC behandelt mit Deckel)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Natriumdiethyldithiocarbamat-Trihydrat</td></tr><tr><td>Corning Flaschenaufsatz-Vakuumfiltersystem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Celluloseacetat-Membran, Porengröße 0,45 &mu; m, Membranfläche 54,5 cm2, Filterkapazität 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyethylenglykolhexadecylether</td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Empfangen als 100 mM verdünnt auf 10 mM mit sterilem Wasser</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Für Elektrophorese</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagenz, für die Molekularbiologie, Pulver</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagenzqualität, kristallin</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin rot konjugiertes Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamin Phalloidin ist eine hochaffine F-Aktin-Sonde, die an den rot-orangefarbenen Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin</td></tr><tr><td>DAPI Sigma</td><td>Aldrich</td><td>D9542</td><td></td> konjugiert ist</tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Konfokales System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insektenmedium (ergänzt, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ Zikade mittelkomponentig</td></tr><tr><td>L-Histidin-Monohydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ Zikade mittelkomponentig</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ Zikade mittelkomponentig</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ Zikade mittelgroße Komponente</td></tr><tr><td>Hank' s Ausgewogene Salze (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>MEM, Aminosäuremischung (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>1 M MgCl-Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Pen-Strep (mit / </td><td>Glutamin)Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ Zikade mittlere Komponente</td></tr></tbody></table>

ausbreitung von<em&gt; homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Über<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; zellkultur

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis) ist ein hoch vagile und polyphagen Insekten gesamten Südwesten der Vereinigten Staaten gefunden. Diese Insekten sind die vorherrschenden Vektoren Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), eine Xylem-Bakterium, das begrenzt die Erreger der Pierce-Krankheit (PD) der Weinrebe ist. Pierce-Krankheit ist wirtschaftlich schädlich; damit, H. vitripennis haben ein Ziel für Erreger-Management-Strategien geworden. Ein dicistrovirus als Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) identifiziert, mit einer erhöhten Mortalität in Verbindung gebracht H. vitripennis Populationen. Da eine Wirtszelle für HoCV-01-Replikation benötigt, stellt der Zellkultur eine gleichförmige Umgebung für die gezielte Replikation logistisch und Biopestizid Produktion wirtschaftlich wertvoll ist. In dieser Studie wurde ein System für großflächige Ausbreitung von H. vitripennis Zellen durch Gewebekultur entwickelt, providing einen viralen Replikationsmechanismus. HoCV-01 wurde aus den ganzen Körper Insekten extrahiert und verwendet, um kultivierte H. inokulieren vitripennis Zellen auf verschiedenen Ebenen. Das Kulturmedium wurde alle 24 h für 168 h, RNA extrahiert und mit qRT-PCR analysiert entfernt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und gezählt, um die Überlebensfähigkeit Zelle quantifizieren mittels Lichtmikroskopie. Ganzvirus-Partikel wurden bis zu 96 Stunden nach der Infektion, die das bestimmt zu sein, bevor die Gesamtzellkultur Zusammenbruch aufgetreten Zeitpunkt war extrahiert. Die Zellen wurden auch Fluoreszenzfärbung unterzogen und unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um virale Aktivität auf F-Actin-Bindung und Kerne Integrität zu untersuchen. Das Fazit dieser Studie ist, dass H. vitripennis Zellen, die kultiviert und zur Massenproduktion von HoCV-01 auf einen geeigneten Pegel zur Herstellung eines Biopestizids ermöglichen.

Zellwachstums wurde innerhalb von 48 h Durchgang in kleinen und großen Kulturflaschen aus Primärkulturen und setzte Passagen gesehen. Fibroblasten-Wachstum und die Entwicklung wurde auch innerhalb dieses Zeitrahmens beobachtet. Wenn neu ausgesät Kolben wurden vor 48 Stunden gestört, gab es eine sichtbare Rückgang der Zellhaftung, was zu langsameren wachsenden Kulturen und manchmal keine Bindung oder das Wachstum überhaupt. Zellen wurden etwa 80% konfluente innerhalb einer Woche nach der Übergabe und eine Monoschicht geb...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert.

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zu bestimmen, ob das Homalodisca coagulata Virus eins oder HOCV-eins mittels Zellkulturen von Homalodisca vitripennis repliziert und anschließend für weitere nachgeschaltete Anwendungen isoliert werden kann. Dies wird erreicht, indem H. vitripennis erfolgreich kultiviert und mit gereinigtem HOCV-eins infiziert wird, um eine Replikation zu ermöglichen. Als zweiter Schritt werden das Medium und die Zellen, die das Virus enthalten, aus der Kultur entfernt und anschließend einer Virus- und RNA-Extraktion unterzogen.Anschließend wird die aus den infizierten Kulturen gewonnene RNA einer PCR unterzogen, um festzustellen, ob sich virale RNA in den Zellen befindet. Die Ergebnisse zeigen, dass HOCV eine in vivo-Replikation aufweisen kann, basierend auf Lebendzellzahlen vor und nach der Infektion sowie auf der qRT-PCR-Analyse.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zucht infektiöser lebender Insekten liegt darin, dass sie kostengünstiger ist und mit minimalen Einrichtungen und Geräten leicht zu handhaben ist. Die Anwendung dieser Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der biologischen Schädlingsbekämpfung zu beantworten. Beispielsweise: Kann ein Insektenvirus oder ein Virus, das spezifisch für eine Insektenart ist, im großen Maßstab zur Bekämpfung eines Schädlings eingesetzt werden?Obwohl diese Methode Einblicke in das Management dieses spezifischen Insekts ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise auf die Bekämpfung der Roten Feuerameise durch einen Virus derselben Familie wie HOCV. Vor Beginn dieses Verfahrens kultivieren und pflegen Sie Kulturen in 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturgefäßen unter Verwendung von H2G plus Blattlaus-Medium, einem modifizierten WH-two-Honigbienen-Medium. Homogenisieren Sie die gesamten Körper von viruspositiven H. vitripennis in Phosphatpuffer mit 0,02 % DETCA durch Vortexen in Intervallen von etwa zehn Sekunden, bis keine größeren Gewebeklumpen mehr vorhanden sind. Extrahieren Sie das Virus durch Ultrazentrifugation bei 22.000 ×g über 16 Stunden bei vier Grad Celsius.Nachdem das Überstand entfernt wurde, sammeln Sie das Pellet und lösen es in fünf Millilitern 10-Millimolar-Phosphatpuffer, der 0,4 % Natriumdesoxycholsäure und 4 % Polyethylenglykol-Hexadesaether enthält. Um das Pellet gut zu vermischen, entfernen Sie es von der Röhrenwand und zerkleinern es gegebenenfalls. Anschließend zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 300 ×g. Entfernen Sie den Überstand und filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,45-Mikrometer-Filter. Sammeln Sie das Filtrat in einem großen Sammelröhrchen.Überführen Sie das Filtrat unter gegebenenfalls Verwendung kleiner Mengen eines 10-Millimolar-Phosphatpuffers ohne DETCA in eine Dialysismembran mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 3,5 Kilodalton. Legen Sie die Dialysismembran in einen großen Becher, der mit doppelt destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius gefüllt ist. Wechseln Sie das Wasser jede Stunde über einen Zeitraum von fünf bis sechs Stunden, bis sich ein weißer Niederschlag in der Membran bildet. Zu diesem Zeitpunkt beimpfen Sie Zellen in 48-Well-Kulturplatten.Wenn das Zellwachstum 80 % konfluent ist, impfen Sie jede Zellreihe mit dem seriell verdünnten Virus an. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in jedes Brunnen als Volumenkontrolle. Um eine Startgrundlinie der Zellkonzentration für den Vergleich mit den experimentellen Zellzahlen zu etablieren, lösen Sie vor der ersten Animpfung der Kulturen mit Virus das erste Brunnen jeder Reihe ab und zählen Sie die Zellen.Entfernen Sie anschließend das gesamte Medium von der Säule, die zu jedem 24-Stunden-Zeitpunkt abgebildet wurde, und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius zur RNA-Extraktion und Virusquantifizierung. Extrahieren Sie nach der Extraktion des Virus aus den Kulturzellen gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll RNA aus den während jedes einwöchigen Virustests gesammelten Mediumproben mithilfe einer Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, die für flüssige Proben gemäß Herstellerprotokoll konzipiert ist. Für die RT-PCR legen Sie virale Standardreihen an, indem Sie eine herkömmliche PCR mit dem HOCV-RT-PCR-Primer-Eins-Primerpaar und einem Virusisolat aus dem gesamten Körper von H. vitripennis durchführen.Danach eine zehnfache serielle Verdünnungsreihe der gereinigten Probe durchführen, die von 57 Nanogramm pro Mikroliter bis 57 Attogramm pro Mikroliter reicht. Die Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihe mittels qRT-PCR mit einem qRT-PCR-Kit bestimmen, das eine zuverlässige Quantifizierung seltener Transkripte ermöglicht.Nachdem die RNA wie zuvor beschrieben aus den experimentellen Proben extrahiert wurde, erfolgt die Quantifizierung mittels Spektrophotometrie. Führen Sie anschließend eine qRT-PCR an allen Proben in Duplikaten als 25-Mikroliter-Reaktionen mit einem One-Step-qRT-PCR-Kit durch, das in der Lage ist, geringe Kopienzahlen nachzuweisen, wie folgt. Stellen Sie den Mastermix so her, dass jede Reaktionsmischung 12,5 Mikroliter eines 1x-Mastermixes, 1,0 Mikroliter eines 0,3-Mikromolar-Vorwärtsprimers, 1,0 Mikroliter eines 0,3-Mikromolar-Rückwärtsprimers, 0,25 Mikroliter Reverse Transkriptase sowie variable Mengen an Template entsprechend den Standardisierungswerten enthält. Anschließend wird das Gesamtvolumen der Reaktion mit RNA-freiem Wasser auf 25 Mikroliter aufgefüllt. Jeder PCR-Lauf sollte fünf Standardkonzentrationen enthalten: fünf mal 10 hoch minus eins, 10, fünf mal 10 hoch minus acht, fünf mal 10 hoch minus sechs, fünf mal 10 hoch minus vier und fünf mal 10 hoch minus zwei Kopien. Setzen Sie die Schwellenwertlinie (Threshold) für jeden Lauf knapp unter eine Fluoreszenz von 10 hoch minus 2,5, um Rauschen während der frühen Erfassungsphase zu Beginn jedes Laufs zu reduzieren. Nachdem Homalodisca vitripennis-Zellen in einer 12-Loch-Platte mit darin enthaltenen Glasdeckgläsern kultiviert wurden, wird jeden Tag über einen Zeitraum von vier Tagen eine Spalte mit dem extrahierten Virus infiziert. Sobald eine vollständige Zellschicht (Monolayer) erreicht ist, fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit kaltem 4 %igen Paraformaldehyd. Anschließend geben Sie 500 Mikroliter 1× PBS zu den Zellen hinzu und waschen sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit. Nach dreimaligem Waschen geben Sie 500 Mikroliter 0,1 %ige TritonX-100-Lösung hinzu, um die Zellen zehn Minuten lang zu permeabilisieren.Nachdem die Zellen mit 1X PBS gewaschen wurden, 500 Mikroliter einer 5 %igen Lösung von Rinderserumalbumin hinzufügen, um die Zellen bei Raumtemperatur zu blockieren. Nach zwei Stunden die Lösung von den Zellen entfernen. Anschließend 250 Mikroliter einer verdünnten Stammlösung von Rhodamin-Rot-konjugiertem Phalloidin in jede Vertiefung geben, um F-Aktin anzufärben. Die Platte mit Aluminiumfolie abdecken, um ein Ausbleichen des Farbstoffs zu verhindern, und die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Rhodamin-Lösung entfernen und durch 250 Mikroliter DAPI, verdünnt in 1X PBS mit 5 % BSA, ersetzen, um die Zellkerne anzufärben. Nach einer einstündigen Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur diese dreimal wie zuvor beschrieben mit 1X PBS waschen.Entfernen Sie abschließend vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen und montieren Sie sie auf Objektträgern mit einem Einbettmedium, das ein Antifade-Reagenz enthält.Die Zelladhäsion und die Entwicklung von Fibroblasten wurden innerhalb von 48 Stunden nach der Passagierung in kleinen und großen Kulturkolben beobachtet. Bei Störung der frisch beimpften Kolben kam es zu einer Abnahme der Zelladhäsion, was zu langsamer wachsenden Kulturen führte und manchmal keine Anheftung oder kein Wachstum zur Folge hatte.Die Zellen erreichten innerhalb einer Woche etwa 80 % Konfluenz und bildeten in 10 bis 14 Tagen eine Monolayer. Infizierte Kulturen zeigten Anzeichen für eine abnehmende Integrität der Zellform, und scheinbar große Löcher waren 48 Stunden nach der Infektion auf den Zelloberflächen sichtbar. Die Zellen zogen sich zusammen und lösten sich etwa 72 bis 96 Stunden nach Infektion mit undiluiertem HOCV-one von der Kulturoberfläche ab. Die mittleren Zahlen lebender Zellen wurden grafisch dargestellt, um Unterschiede in der Häufigkeit lebender Zellen zwischen verschiedenen Viruslasten im Zeitverlauf zu veranschaulichen. Die Gruppen mit höherer Virusbehandlung zeigen einen deutlich stärkeren Rückgang der Kulturgesundheit mit einem erheblichen Abfall der lebenden Zellen zwischen 48 und 72 Stunden. Die Gruppen mit niedrigerer Virusbelastung nahmen hingegen langsam ab, bis sie etwa nach 144 Stunden stark einbrachen. Die Überlebenswahrscheinlichkeit von Zellen, die mit höheren Virusdosen infiziert wurden, war geringer, wie durch Kaplan-Meier-Kurven getestet wurde, was mit den Analysen der mittleren Anzahl lebender Zellen korreliert. Obwohl nicht signifikant, legen die Daten nahe, dass Zellen, die dem Virus ausgesetzt waren, im Zeitverlauf um 88 % wahrscheinlicher niedrigere Überlebensraten aufweisen. Der Rückgang der vorhandenen Kerne sowie das verzerrte Erscheinungsbild von F-Aktin in den Zellen, die HOCV-one ausgesetzt waren, weisen auf eine erhebliche Beeinträchtigung der Kultur hin.Gesunde Zellen, die der höheren Dosis von 10 Viruslast ausgesetzt waren, zeigten stärkere Schädigungen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Schritt des Protokolls zeitnah abzuschließen, da einige Schritte zeit- und temperaturabhängig sind. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie ELISA verwendet werden, um zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise, wie viel Virus in einer Zellkultur vorhanden ist, nachdem unterschiedliche Mengen des Virus in diese Zellkultur inokuliert wurden? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Insektenzelllinie verwendet, um ein RNA-Virus zu replizieren, das Virus anschließend zu isolieren und mittels qRT-PCR zu quantifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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