Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Photorezeptorschicht der Maus zu isolieren. Für die Kultivierung besteht der erste Schritt darin, eine vollständige flache Netzhaut zu erhalten und sie auf einen Gelatineblock zu versiegeln. Als nächstes werden die Netzhautschichten erfolgreich durchtrennt, um die Photorezeptorschicht zu isolieren.

Der letzte Schritt besteht darin, gereinigte Photorezeptorzellen in Kultur zu säen. Letztendlich wird die Reinheit der Photorezeptorschicht durch Mikroskopie und Immunfluoreszenz bestätigt, gefolgt von der Prüfung des Stäbchen-abgeleiteten Zapfenlebensfaktors. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Laser-Mikrodissektion besteht darin, dass die Photorezeptorschicht sicher isoliert werden kann.

Die Auswirkungen dieser Technologie erstrecken sich auf die Therapie der erblichen Netzhautdegeneration. Da es sehr praktisch ist, die Photorezeptorbiologie zu untersuchen, hatten wir diese Methode ursprünglich entwickelt, um die zelluläre Interaktion zwischen Stäbchen- und Kälte-Photorezeptoren zu untersuchen. Die Transplantation von Schicht-Photorezeptoren in das Auge des frühen Mannes führte zur Identifizierung aller abgeleiteten Überlebensfaktoren.

visuelle Demonstration dieser Methoden ist von entscheidender Bedeutung, da die Möglichkeit einer flachen Bergnetzhaut schwierig durchzuführen ist, da sie schwierig ist. Bevor Sie die Netzhaut isolieren, bereiten Sie das Vibrato vor. Beginnen Sie mit Schalen aus 20%iger Gelatinelösung, die bei vier Grad Celsius aus dem Lager genommen werden.

Schneiden Sie die Gelatine mit einem Skalpell ein, drehen Sie die Gelatinescheibe um und kleben Sie sie mit einem Tropfen Sekundenkleber auf die schwarze Stützscheibe des Vibrators. Brechen Sie als nächstes eine Rasierklinge in zwei Hälften und führen Sie eine Hälfte in den Vibrator ein. Setzen Sie dann die schwarze Stützscheibe auf das Vibratorgerät ein und drehen Sie den schwarzen Knopf nach rechts.

Befestigen Sie nun den Haltebehälter am Kopf des Vibratos und bedecken Sie den Gelatineblock mit einem CO2-unabhängigen Medium. Schalten Sie das Vibrato ein, um das Setup zu testen. Schneiden Sie drei 100-Mikron-Scheiben, bis die Scheibe glatt ist und flache Scheiben entstehen.

Nachdem Sie die Augen einer Maus und andere Präparate entnommen haben, isolieren Sie die Netzhaut. Zuerst bohren Sie mit einer 18-Gauge-Nadel ein Loch in Höhe des Augengliedes. Um dann den Ziliarkörper zu entfernen, führen Sie eine gerade Schere durch das Loch in den Augenball ein und schneiden Sie die Sklera vorsichtig unterhalb der Iris und dann entlang des Umfangs des Augenballs.

Halten Sie dann den hinteren Teil des Auges mit der Netzhaut an der Sklera und entfernen Sie die Hornhaut und die Linse. Entfernen Sie mit zwei feinen Griffen den Glaskörper, der an der Netzhaut befestigt ist, ohne die Netzhaut zu beschädigen, damit die Netzhaut flach aufgelegt werden kann. Machen Sie vier radiale Schnitte darin.

Drehen Sie nun den Okularglobus nach oben und schälen Sie ihn wie eine Orange. Dann ganz vorsichtig mit einer feinen geraden Schere. Löse die Netzhaut von der Sklera und dem pigmentierten Epithel der Netzhaut.

Er sollte mit feinen Griffen auf Höhe des Sehnervs befestigt bleiben, den verbleibenden Glaskörper beginnend an der Peripherie ablösen und sich in Richtung Zentrum der Netzhaut bewegen. Wenn der gesamte Glaskörper vollständig entfernt ist, flacht die Netzhaut ab. Übertragen Sie nun die Netzhaut in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern.

Der Prozess der Versiegelung der flachen Netzhaut im Gelatineblock ist heikel und im Grunde der schwierigste Aspekt beim Schneiden des Gewebes. Entfernen Sie zunächst 20 bis 30 Milliliter Medium aus dem Vibramtank. Übertragen Sie zweitens die Netzhaut mit einer Kunststoffpipette mit breiter Öffnung auf einen Objektträger und tragen Sie einen Tropfen CO2-unabhängiges Medium auf den Objektträger auf.

Drittens, übertragen Sie die Netzhaut auf eine Gelatinescheibe mit einem Photorezeptor nach unten. Viertens: Befestigen Sie die Netzhaut an den Gelatineblock. Injizieren Sie vorsichtig warme 4%ige Gelatine auf eine Seite des Blocks zwischen der Netzhaut und dem Gelatineblock und stoßen Sie die Gelatine auf der anderen Seite aus.

Zum Schluss aspirierst du die Gelatine mit einer Glaspipette und wartest sieben bis 10 Minuten, während die Netzhaut in den Block eingeschweißt wird. Geben Sie nun CO2-unabhängiges Medium zurück in den Tank und tauchen Sie den Block und die Klinge zum Trennen von der Oberseite des Gelatineblocks aus ein. Schneiden Sie 100 Mikrometer lange serielle Abschnitte, bis die Klinge die Netzhaut erreicht.

Schneiden Sie dann mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit, z. B. ein oder zwei 100 bis 120 Mikrometer große Abschnitte der inneren Schicht der Netzhaut. Je nach Anwendung kann diese Schicht verworfen oder in flüssigem Stickstoff gelagert werden, wodurch die Geschwindigkeit an der Grenzfläche zwischen der inneren und äußeren Schicht langsam bleibt. Nehmen Sie 15-Mikron-Schnitte.

Untersuchen Sie diese Schnitte unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein von Blutgefäßen. Wenn es keine gibt, wurde die äußere Netzhaut durch die äußere Schicht erreicht. Schneiden Sie langsam 200-Mikron-Abschnitte.

Übertragen Sie diese Scheiben in eine 35-Millimeter-Schüssel mit drei Millilitern kaltem, CO2-unabhängigem Medium, das auf Eis gehalten wird. Fahren Sie mit dem Sammeln aller Abschnitte der Photorezeptorschicht von allen Netzhäuten fort, die in diese Schale geschnitten werden sollen. Beginnen Sie damit, die geschnittenen Photorezeptoren für 10 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator zu übertragen.

Trennen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig jede Photorezeptorschicht von der Gelatine und geben Sie sie in eine neue Schale, die mit drei Millilitern Ringerlösung bei Raumtemperatur gefüllt ist. Sobald alle Photorezeptoren aus der Gelatine isoliert wurden, kombinieren Sie zwei Einheiten Papain mit 25 Mikrolitern Aktivatorlösung in einem sterilen Fünf-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Um das Papain während dieser Inkubation zu aktivieren, schneiden Sie die Scheiben der Photorezeptorschicht in zwei Millimeter große quadratische Stücke und nicht viel kleiner.

Übertragen Sie diese Stücke in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit 1,5 Millilitern Ringerlösung. Saugen Sie dann die Klingeltöne an und ersetzen Sie sie für eine zweite Wäsche. Warten Sie, bis sich alle Scheiben durch Schwerkraft und Sedimentation abgesetzt haben, und entfernen Sie dann alle restliche Ringerlösung aus dem Röhrchen.

Geben Sie als nächstes 475 Mikroliter Ringerlösung in das Röhrchen mit dem aktivierten Papain und mischen Sie. Füllen Sie diese Mischung in das Röhrchen mit den Scheiben und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang. Stoppen Sie nach 20 Minuten die Papain-Verdauung, indem Sie einen Milliliter 10%FCS in DMEM hinzufügen.

Fügen Sie dann 25 Einheiten D Ns.One hinzu, um die DNA von abgestorbenen Photorezeptorzellen zu verdauen, homogenisieren Sie die Suspension sorgfältig durch Pipettieren, um die Photorezeptorzellen zu gaumen. Drehen Sie das Röhrchen sechs Minuten lang bei Raumtemperatur bei 115 g, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in supplementiertem DMEM mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Wiederholen Sie dies, drehen Sie die Suspension und reusieren Sie sie. Einmal.

Aus dem geernteten Auge sollten nun eine bis 1,5 Millionen Zellen bereit für die Aussaat sein. Sie werden mit 100.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgesät und fünf Tage lang kultiviert, bevor sie nachgelagert werden. Mit den beschriebenen Methoden wurden Kulturen von Photorezeptorzellen von Wildtyp-Mäusen am achten postnatalen Tag hergestellt. Ohne FCS wurden die Zellen fixiert und für Anti-Row oder einen früheren Marker Anti-Sag gefärbt.

Weniger Zellen waren positiv für die Anti-Reihe, da SAG der ROE-Expression vorausgeht. Photorezeptoren wurden auch von 35 Tage alten Mäusen präpariert, um die Expression von mRNA, von RO sag und dem Zapfen, der GA zwei transduziert, zu untersuchen. Diese Gene werden im Vergleich zum gesamten Gehirn am stärksten in den Photorezeptoren exprimiert.

G NAT zwei wird spezifisch durch Zapfen exprimiert. Die Proteinexpression von RO und g. NAT zwei in den Photorezeptoren wurde durch den Vergleich der Zellen der Photorezeptorschicht mit den Zellen der inneren Netzhautschicht untersucht.

Dies geschah mit Wildtyp- und mit RD-mutierten Mäusen. Die mutierten Mäuse zeigten an Tag 35 keine Expression eines der beiden Proteine. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine richtig gereinigte Photorezeptorschicht erhalten.

Diese Technik kann in etwa fünf bis sechs Stunden für vier bis acht Netzhäute durchgeführt werden, wenn sie nach diesem Verfahren richtig durchgeführt wird. Es können auch Methoden wie das westliche Blut durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Proteinexpression während der Degeneration von Photorezeptoren nach seiner Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Netzhautbiologie den Weg, das Transkript, das Proteom und den Stoffwechsel relevanter Tiermodelle zu untersuchen.