Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, elektrophysiologisch aus dem minimalen synaptischen Schaltkreis im Gehirn aufzeichnen zu können. Dies wird durch Aufnahmen von organotypischen Schnittkulturen aus dem Hippocampus von Ratten erreicht, die in plastischen Kultureinsätzen gezüchtet wurden. Diese Scheiben stellen ausgeklügelte, aber angemessene synaptische Verbindungen her, die nach einer Periode des Wachstums in der Kultur leicht aufgezeichnet werden können.

Das Aufzeichnen in diesen Schichten ermöglicht die Isolierung der synaptischen Aktivität des minimalen synaptischen Schaltkreises, der zwischen nur zwei Neuronen stattfindet, und ermöglicht somit die Untersuchung der grundlegendsten Eigenschaften neuronaler Schaltkreise. Diese Methode kann verwendet werden, um die Funktion synaptischer Mikroschaltkreise im Hippocampus zu untersuchen, aber sie kann für jeden Bereich des Gehirns verwendet werden, in dem benachbarte Neuronen synaptisch verbunden sind. Die visuelle Demonstration sowohl der Aufzeichnungs- als auch der Präpariermethoden ist von entscheidender Bedeutung, da viele der Schritte von der genauen Identifizierung von Orientierungspunkten und Neuronen des Gehirns abhängen. Sowohl vor der Herstellung von Schnitten werden alle Lösungen als auch die Kulturplatten vorbereitet.

Jede größere Platte zum Auffangen von Scheiben enthält sieben kleinere Schalen, die während der Montage jeweils mit Medium und einem Kultureinsatz versehen sind. Setzen Sie die Einsätze schräg in das Medium ein, um Lufteinschlüsse zu vermeiden. Bewahren Sie diese Platten im Inkubator auf und entfernen Sie vorsichtig den Hippocampus von jeder Hälfte eines P 7-Nagetiergehirns, ohne Schaden zu nehmen, indem Sie das Gehirn anhand struktureller Orientierungspunkte navigieren.

Teilen Sie zunächst ein Gehirn entlang der Mittellinie. Trennen Sie dann mit feinen Spateln die Hirnrinde vom Mittelhirn. Das Gehirn wird geöffnet, um den Hippocampus freizulegen.

Als nächstes schneidest du den Fornix mit der Spitze des Spachtels ab und arbeitest den Spachtel unter dem FIA und dem Hippocampus ein. Rollen Sie nun den Hippocampus aus dem Gehirn heraus und schneiden Sie ihn vom anhaftenden Gewebe ab. Nimm den Hippocampus vorsichtig auf und lege ihn in eiskaltes Seziermedium.

Fahren Sie mit der Entnahme des zweiten Hippocampus fort. Fahren Sie mit dem Schneiden der beiden Nilpferd-Campi fort. Legen Sie sie auf die Stufe des Häckslungsblocks, der mit zwei Dicken Feuchtigkeit ausgelegt ist.

Nummer zwei, Filterpapier. Machen Sie dann aufeinanderfolgende 400-Mikron-Querscheiben, ohne eine Scheibe anzuheben. Das Ergebnis ist wie ein in Scheiben geschnittener Laib Brot.

Gleichmäßige Dicke und schonende Handhabung sind entscheidend. Rollen Sie nun mit einem weichen weißen Zobel, dem Künstlerpinsel Nummer vier, den Pinsel vorsichtig unter jeden geschnittenen Hippocampus und heben Sie ihn von der Bühne. Sobald beide Nilpferd-Campi umgefüllt sind, decken Sie die Schüssel ab und schwenken Sie sie kräftig.

Wechseln Sie häufig die Richtung. Ziel ist es, die Scheiben zu trennen. Untersuchen Sie nun unter einem Präpariermikroskop die Scheiben und entsorgen Sie alle Scheiben, die beschädigt oder kleiner als gewünscht sind.

Entsorgen Sie auch alle Scheiben, die keine deutlich sichtbaren Zellschichten aufweisen, da dies ebenfalls ein Hinweis auf eine Beschädigung ist. Alle Scheiben, die sich nicht getrennt haben, können auf ihrer Kante hochgeklappt und mit einer Dumont-Pinzette angestoßen werden, um sie auseinander zu drücken. Füllen Sie zuerst die Pipette mit Medium.

Saugen Sie dann die Scheibe vorsichtig auf und halten Sie sie in der Nähe der Öffnung. Mit leichtem Druck. Forme an der Spitze ein Tröpfchen und warte, bis sich die Scheibe in dem Tröpfchen abgesetzt hat.

Berühren Sie dann das Tröpfchen mit der Oberfläche der Gewebekultur. Einfügen. Sobald die Scheibe deutlich auf dem Einsatz liegt, ziehen Sie die Pipette heraus. Wenn die Tröpfchen nicht zu groß sind, passen drei Scheiben auf eine Membran. Einfügen.

Sobald alle Scheiben übertragen wurden, verwenden Sie eine Weidepipette, um das Medium vorsichtig um jede Scheibe herum zu aspirieren. Führen Sie eine Flüssigkeitsentfernung für die Einsätze durch, die plattiert wurden. Erstens, um den Scheiben ausreichend Zeit zum Absetzen zu lassen.

Decken Sie nun jede kleine Schale, dann die große Schale ab und inkubieren Sie die Baugruppe. Füttern Sie die Scheiben am Tag nach dem Schneiden. Füttern Sie sie dann am dritten Tag nach dem Schneiden erneut.

Bringen Sie sie nach der zweiten Fütterung in einen 34 Grad Celsius heißen Inkubator, 5 % CO2 und füttern Sie die Kulturen danach zweimal pro Woche. Organotypische Scheiben können zwischen einer und zwei Wochen nach dem Schneiden aufgenommen werden. Entfernen Sie am Aufnahme-Rig eine einzelne Scheibe, indem Sie mit dem Skalpell die Unterseite des Kultureinsatzes vollständig durchschneiden und um die Scheibe herum schneiden.

Entfernen Sie den ausgeschnittenen Kunststoffkreis mit einer Dumont-Pinzette und legen Sie ihn in die Aufnahmekammer am Elektrophysiologie-Rig. Bewegen Sie die Scheibe mit einer Pinzette in die Aufnahmekammer. Fokussieren Sie sich nun immer noch und scannen Sie die Oberfläche des Slices unter 10-facher und dann 40-facher Vergrößerung, um die CA-Körperschicht mit drei Zellen zu lokalisieren.

Sobald die Zielzellen identifiziert wurden, wird das Objektiv so weit wie möglich angehoben, ohne den Flüssigkeitsmeniskus zwischen dem Objektiv und dem A-Liquor in der Aufnahmekammer zu brechen. Platzieren Sie dann eine Ganzzell-Aufzeichnungselektrode unter dem Objektiv und fokussieren Sie nach unten, um die Spitze der Elektrode zu finden, bis die Elektrode Kontakt mit einem Zielneuron aufnimmt. Achten Sie darauf, einen positiven Druck auf die interne Lösung der Elektrode aufrechtzuerhalten, um die Elektrode frei von Schmutz zu halten.

Senken Sie nun die Elektrode und das Objektiv gemeinsam ab, bis sich die Elektrode nahe der Oberfläche der Scheibe befindet. Senken Sie dann die Elektrode weiter in das Gewebe ab und schieben Sie sie sanft in die Seite des Zielneurons. Entfernen Sie nun den Überdruck und saugen Sie die innere Lösung sanft an, um eine Giga-Ohm-Versiegelung auf der Membran des Neurons zu erzeugen.

Sobald die Versiegelung hergestellt ist, brechen Sie die Membran unter der Elektrode mit Saugimpulsen auf oder durch Überkompensation der Kapazität des Verstärkers durch eine Ganzzellenaufzeichnung. Heben Sie das Objektiv wieder an und richten Sie die zweite Elektrode so ein, dass Bewegungen minimiert werden, die die erste Aufnahme stören würden. Halten Sie den Überdruck auf der zweiten Elektrode gering.

Eine relativ geringe Strömung induziert Bewegungen in einem Abstand von zwei bis drei Neuronen. Sobald die zweite Ganzzellaufzeichnung etabliert ist, sollte die synaptische Übertragung für ein bis vier Stunden stabil sein. Die synaptische Konnektivität wird dadurch deutlich, dass das präsynaptische Neuron dazu angeregt wird, im Aktionspotential zu feuern, und dann innerhalb von fünf Millisekunden monos-synaptische EPCs im postsynaptischen Neuron gesehen werden.

Etwa ein Drittel der getesteten ca-3-Zellen waren monos, die durch eine aktive Verbindung synaptisch an eine andere ca-drei Zellen gekoppelt waren. Die Amplitude der AMPA-Rezeptor-vermittelten Ströme variierte zwischen den Versuchen innerhalb einer gepaarten Aufzeichnung und war in verschiedenen aktiven Verbindungen unterschiedlich. EPCs können weniger als 10 Pikoampere oder mehr als 800 Pikoampere betragen.

Die Ausfallraten variierten bei Verwendung von Standard-Induktionsmethoden stark. Sowohl LTP als auch LTD konnten zuverlässig bei etwa drei bis drei Synapsen induziert werden, und beide Formen der Plastizität blieben über zwei Stunden erhalten. Die gesamte Dauer der Aufzeichnung synaptischer Hemmereignisse wurde häufig zwischen den drei Parametall-Neuronenpaaren von CA beobachtet.

Sie waren jedoch nicht pharmakologisch blockiert, da sie aufgrund der langen Latenzen zwischen diesen Ereignissen die neurosynaptischen Ströme nicht signifikant beeinträchtigten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische Hippocampus-Schnitte erstellt und wie man sie verwendet, um duale Ganzzellaufnahmen von synaptisch verbundenen Neuronenpaaren zu machen.