Name: Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Lernen Sie gepaarte Ganz-Zell-Ableitungen in organotypischen Hippocampus-Schnitten zur Untersuchung synaptischer Schaltkreise. Diese Methode isoliert neuronale Aktivität zwischen zwei verbundenen Neuronen.

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Wir möchten uns bei den Mitgliedern der Labore in Montgomery und Madison für hilfreiche Diskussionen bedanken. Wir danken für die Finanzierung, die wir in dieser Studie aus den folgenden Quellen erhalten haben: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC und NIH.

Tierethikerklärung: Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokolle folgen den Richtlinien der Tierpflege von der University of Auckland und der Stanford University gegründet. P7 Rattenjungen wurden durch schnelle Enthauptung getötet. Hippocampus-Präparation wird dann sofort durchgeführt, wie unten beschrieben. 1. Organotypische hippokampalen Slice-Kultur <ol><li> Vorbereitung <ol><li> Bereiten Dissektion Medium (nur für das Gehirn sezieren verwendet wird). Kombinieren 200 ml Minimum Essential Medium mit 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-Pufferlösung, 2 ml 1 M Tris-Stammlösung (pH 7,2) und sterilfiltriert mit 0,22 um-Filter . Zuführen Hippocampus Dissektion in eiskaltem Dissektion Medium. </li><li> Kühlen Sie die Dissektion Medium. Platzieren Sie die Dissektion Medien im Gefrierfach etwa 1 Stunde vor dem Beginn der Präparation, bis die Flüssigkeit sehr kalt ist. Sie ermöglichen große Eis cr nichtystals zu bilden. Lagerung auf Eis, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Kulturmedium (für alles verwendet, außer Dissektion der Hippocampus). Kombinieren 100 ml Minimum Essential Medium (1x Konzentration, Flüssigkeit) w / Hank-Salze, W / L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (flüssig, 10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M Puffer Lösung, 50 ml Hanks Balanced Salt Solution, 50 ml Pferdeserum (definiert, Hitze inaktiviert) und Filter zu sterilisieren mit 0,22 um Filter. </li><li> Bereiten Sie die Kulturschalen. Platz 1 ml Kulturmedium pro 35 mm Kulturschale, und fügen Sie eine Membraneinsatzes zu jedem Gericht. Zu sieben dieser Gerichte Aufmachungen in eine 150 mm Petrischale (bezeichnet als &quot;Platte&quot; genannt). Die Platte wird in einem CO 2-Inkubator für mindestens eine Stunde, bevor die Dissektion beginnt, so dass das Kulturmedium in den Gerichten erreicht die richtige Temperatur und pH-Wert. </li></ol></li><li> Präparation der Hippocampi von Rattenjungen am postnatalen Tag 7 (P7) <ol><li> Pre-sterilisieren alle Dissektionswerkzeuge unter UV-Licht vor dem Eingriff. </li><li> Nach schneller Enthauptung, entfernen Sie das Gehirn und Ort in gekühlte Medium in eine Schüssel, und entfernen Sie sie dann auf ein Stück feuchten Filterpapier für die Dissektion. Necken die Rinde vom Mittelhirn mit stumpfen glatten Kunststoff-beschichtet Miniatur-Spatel, Aussetzen des Hippocampus. Schneiden Sie das Scheidengewölbe, und dann sanft zu arbeiten den Spatel unter dem Hippocampus, sie ausflippen (Abbildung 1A). HINWEIS: Erfolgreiche Schnittkulturen kann mit Tieren bis P10 hergestellt werden. </li><li> Schneiden Sie die isolierten Hippocampus weg vom Rest des Gehirns. Übertragen Sie die hippocampi in eine neue Kaltschale mit Dissektion Medien mit einem angefeuchteten weichen Pinsel (zB weiß Zobel # 4). </li><li> Reinigen Sie die Unterseite (dh der flacheren Seite) des Hippocampus von Plexus bei der Präparation, da diese schwammig, meninge artigen Gewebe machen es schwierig, Hippocampus trennenScheiben voneinander später. HINWEIS: Lassen Sie diese Gewebe an Ort und Stelle, wenn sie nicht entfernt sanft gehänselt werden. </li><li> Führen Sie die gesamte Präparation so schnell wie möglich, ohne den Hippocampus. HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation ist wichtiger als ein schnelles, solange die Versuchsbedingungen gekühlt werden. Schneiden Sie die hippocampi von drei Ratten gleichzeitig. Die Scheibe Gesundheit nicht beeinträchtigt wird, solange die Gesamtzeit vom Start bis zum, wenn die plattierten Scheiben in den Brutschrank gehen, ist unter 30 min. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Schneiden Sie die hippocampi quer in 400 um Querschnitte mit einem manuellen Gewebeschneidemaschine. Das Verfahren, mit dem die Schneiddurchgeführt wird, nicht wichtig, so lange es nicht allzu schädlich für das Gewebe und erzeugt Scheiben mäßige Dicke mit gut sichtbaren Schichtarchitektur (dh Ammons ist leicht zu sehen, um in dem Gewebe erhalten werden). </li><li> Liegen die hippocampi auf der Bühne des GewebesChopper auf der Spitze eines dreifache Dicke der # 2-Filterpapier. Der Hippocampus sind vollständig, ohne irgendwelche Scheiben einzeln (; eher wie Laibe Brot in Scheiben geschnitten an dieser Stelle; 1B dh die gesamte Hippocampus ist auf der Bühne des Häckslers nach links, bis alle Schnitte vorgenommen wurden) in Scheiben geschnitten. </li><li> Übertragen Sie die hippocampi in Dissektion Medium mit einem weichen Pinsel zu jedem Hippocampus fest nächsten (weiß Zobel # 2). Drücken Sie vorsichtig jeweils Hippocampus zur Seite, um die Haftung zwischen dem Hippocampus und dem zugrunde liegenden Filterpapier brechen. Rollen Sie die Bürste unter jedem Hippocampus, um ihn abzuholen von der Bühne. Legen Sie alle hippocampi in den gleichen 35 mm Petrischale von gekühlten Dissektion Medium. Trennen Sie die hippocampi in einzelnen Scheiben durch manuelles Bewegen der Schale in Wechselstrom und gegen den Uhrzeigersinn Bewegungen. </li><li> Überprüfen Sie die Scheiben unter einem Binokular und entsorgen Sie alle, die beschädigt sind, klein, bzw. nicht deutlich sichtbar Zelle besitzenKörperschichten. HINWEIS: Es wird oft der Fall, dass nicht alle Schichten erfolgreich von ihrer Geschwister auf diese Weise getrennt werden. In diesem Fall können sie, indem sie sie auf der Kante und Drängen sie mit den Spitzen der feinen Pinzette abgetrennt werden. &quot;Gut&quot; Scheiben werden dann mit einem anderen sauberen Petrischale mit gekühltem Dissektion Medium unter Verwendung eines abgeschnitten und feuerpolierten Pasteurpipette (1C-E) übertragen. </li></ol></li><li> Lagerung <ol><li> Legen Sie die einzelnen Scheiben auf die Membranfilter-Einsätze. Mit einer Pasteurpipette abgeschnitten und Feuer poliert, um eine größere Bohrung geben, individuell Scheiben Transfer zu den Kultur-Einsätze. HINWEIS: Die Größe der Bohrung erzeugt wird, wenn das Schneiden und Feuerpolieren der Pipette ist wichtig. Zu klein und die Scheiben nicht so schnell verlassen die Pipette für die Membran. Zu groß, und die überschüssige Flüssigkeit auf der Oberfläche der Membran zusammen mit der Scheibe platziert. Die beste Bohrungsdurchmesser ist in der Regel etwa die Hälfte der diamMesser des Zylinders der Pipette. Beim Schneiden kann dieser Durchmesser durch Schneiden an der richtigen Stelle auf dem Kegel der Pipette gewählt werden. </li><li> Slice Überweisung <ol><li> Füllen Sie die Pipette mit Medium zuerst, und dann saugen eine einzelne Scheibe mit kleinen Saugkraft. Dies hält die Scheibe in der Nähe der Öffnung der Pipette und verhindert, dass zu viel Medium Vertreibung in den Einsatz, um die Scheibe zu platzieren. </li><li> Tragen Sie einen leichten Druck auf die Lampe, um einen kleinen hängenden Tröpfchen zu bilden, damit die Scheibe in diese Tröpfchen zu regeln, und berühren Sie diese Tröpfchen an der Membran und lassen Sie die Scheibe &quot;Fall&quot; auf die Membran. Regel drei Scheiben werden auf jeder Membran Einsatz gelegt. Hinweis: Wenn der Flüssigkeitströpfchen zu groß ist, werden die Tröpfchen von den drei Scheiben neigen dazu, auf der Membranoberfläche zu verschmelzen, und die Scheiben werden somit alle mit der Mitte der Membran zu sammeln, so dass es schwierig ist, sie für elektrophysiologische Aufzeichnung später zu trennen. </li></ol></li><li> Flüssigkeit Removal <ol><li> Saugen Sie überschüssiges Medium aus der Spitze der Kulturplatte Einsatz für alle Scheiben in dieser Platte (3 Scheiben pro Einsatz = 21 Scheiben pro Platte), so dass Scheiben sind nicht eingetaucht oder durch einen Pool von Dissektion Medium umgeben. </li><li> Führen Sie dies mit einer ungeschnittenen, aber feuerpolierten Pasteurpipette. Lassen Sie die Scheibe, um sich niederzulassen und sich an die Membran für eine Minute vor dem Pipettieren. Achten Sie darauf, die Scheibe bis in die Pipette zu saugen. Durchführung des Flüssigkeitsentzugs für die Einsätze, die zuerst vernickelt werden, um genügend Zeit für die Scheiben absetzen können. </li></ol></li><li> Scheibe Lagerung <ol><li> Speicher Scheibe Kulturen in einem 5,0% CO 2 Inkubator bei 37 ° C aufweist. Beachten Sie die endgültige Anordnung der Kulturen in 1E. Die einzelnen Scheiben ruhen auf einer Kulturplatte Einsatz, der eine poröse Membran eine Unterseite hat, und dieser Einsatz passend in einer Petrischale mit einer kleinen Menge an Medium gefüllt ist; auf diese Weise werden die Scheiben nicht in der mir eingetauchtdium, aber keinen Zugriff auf sie nur durch die Membran am Boden des Kulturplatteneinsatz. </li><li> Optional, entfernen Sie die Scheiben kann für das Studium entweder durch Entfernen des Kulturplatteneinsatz oder durch Ausschneiden eines Abschnitts des Einsatzes Membran, die eine Scheibe. </li></ol></li></ol></li><li> Wartung <ol><li> Tauschen Sie das Medium in den Petrischalen der Tag nach der Herstellung Kulturen. Übertragen der Kulturplatte einfügen, um eine neue Petrischale mit 1 ml frisches Kulturmedium, das in dem Inkubator für mindestens eine Stunde vor der Übertragung ins Gleichgewicht gebracht wird. </li><li> Ändern das Medium wieder in der gleichen Weise am dritten Tag nach der Herstellung Kulturen. Am dritten Tag, übertragen Sie die Kulturen zu einem Brutschrank bei 34 ° C eingestellt. Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche (alle 3-4 Tage). </li><li> Identifizieren gesunden Kulturen. Wählen Sie gesunde Kulturen für gepaarte ganze Zelle Aufnahmen. HINWEIS: Gesunde Kulturen haben eine gut definierte Kante und eine klar definierte pyramidalen Zellschicht. Kulturen Witzh dunkel (wahrscheinlich nekrotischen) Flächen vorhanden sind oder ein vakuolisiertes Aussehen mit abgeflachten Grenzen zurückgewiesen werden. Der Einsatz dieser Kriterien sind in der Regel zwei Drittel der Schnittkulturen ausreichend gesund für die Aufnahme. </li><li> Nutzen Sie diese Kulturen in einem ziemlich kleines Zeitfenster. Nicht verwendeten Gewebe, die für mehr als zwei Wochen kultiviert werden, da die Nervenzellen beginnen, leicht epileptiforme Verhalten, das sich langsam verschlechtert sich mit der Zeit zeigen. Die genaue obere Grenze der neuronalen Überlebens ist nicht bekannt, aber es ist möglich, von dem Funktionieren Pyramidenzellen so spät wie 16 Wochen Kultur zu erfassen. </li></ol></li></ol> 2. Gepaart ganze Zelle Recordings <ol><li> ACSF und der intrazelluläre Lösungen <ol><li> Vorbereitung präsynaptischen Elektrodenlösung durch Mischen (in mM) 120 Kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit KOH; Osmolarität: 290 mOsm). Während der gleichen Elektroden Lösung wird postsynaptischen Neuronen, Cäsium-Gluconat verwendet (120 mM) Wird in der Regel als Haupt Salz in der postsynaptischen Elektrode, plus 5 mM QX314 eingesetzt. HINWEIS: Diese ermöglicht eine stabile Spannungsklemm bei positiven Potentialen zu postsynaptischen NMDAR-vermittelten Ströme 8-10,13 aufzeichnen. Es verhindert auch das Kalium-induzierten Übererregbarkeit des präsynaptischen Neurons durch die interne Lösung aus der postsynaptischen Aufzeichnungselektrode fließt, bevor ein Giga-Ohm-Dichtung gemacht. </li><li> Vorbereitung postsynaptischen Elektrodenlösung Zusammen (in mM) 120 Cäsium-Gluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit CsOH, Osmolarität: 290 mOsm). Ziehen Glasmikroelektroden 5-10 MOhm Widerstand und füllen mit gefiltertem interne Lösung. </li><li> Vorbereitung künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Komposition (in mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 Glucose, pH 7,4, mit 95% O 2, 5 gesättigte % CO 2. HINWEIS: Wenn AMPAR-vermittelte rAHMEN müssen für die Prüfung der NMDAR EPSCs blockiert werden, gehören 10 uM CNQX oder NBQX in der ACSF. </li></ol></li><li> Erhalten Gekoppelte ganze Zelle Recordings <ol><li> Synaptische Übertragung zwischen zwei einzelnen Neuronen zu untersuchen, bezeichnen ein Neuron als der präsynaptischen Neuron und halten in Stromzange an Aktionspotentiale auslösen und initiieren die synaptische Übertragung. </li><li> Bestimmen Sie die zweite Neuron, wie der postsynaptischen Neuron, und halten Sie sie in Strom oder Spannung Klemme abhängig von der vom Forscher erforderlichen Informationen. Erhalten detaillierte Untersuchung der glutamatergen Strömungen, bei -65 mV mit sucht AMPAR-vermittelte EPSCs und NMDAR-vermittelte EPSCs bei +30 mV 6-16 sucht, indem die postsynaptischen Neuron in Spannungsklemme </li><li> Stellen Sie eine gepaart Aufnahme. Um eine Aufnahme zu etablieren gepaart wird der präsynaptischen Zelle ganze Aufnahme immer zuerst gewonnen, so dass mehrere aufeinander folgende postsynaptischen Neuronen, bis eine, die synaptisch ist connecte erhalten werdend erhalten wird. Bei Durchführung der synaptischen Plastizität Experimente ist es besonders wichtig, das präsynaptische Neuron zuerst als die Induktion von LTP in dem postsynaptischen Neuron müssen innerhalb von 10 min zum Erhalt der ganzen Zelle Aufnahmen Auswaschen der cytoplasmatischen Faktoren für LTP 8,19 erforderlich verhindern eingeleitet werden erhalten. </li><li> Vermeiden Sie Bewegung induzierten Zellverlust. Eine große Herausforderung bei der Durchführung gepaart ganze Zellableitungen wird die Vibration und Bewegung-induzierte Störung der ersten ganzen Zelle Aufnahme während den Erhalt der zweiten Aufnahme zu vermeiden. <ol><li> Erhalten die ersten Ganzzellaufnahme und bewegen Sie dann den Mikroskop-Objektiv 10-200 um in der x-Achse, so dass die etablierte Aufzeichnung wird am Rand der Fläche auf dem Monitor (2A) sichtbar entfernt. </li><li> Heben Sie die Linse des Mikroskops ~ 5-10 mm, während sichergestellt wird, dass die ACSF noch Kontakt mit der Linse hält. Montieren Sie die zweite Elektrode und führen in die Flüssigkeit Meniskus (2B </sTrong&gt;). </li><li> Bewegen der Elektrode in der xy-Ebene, bis er sich direkt unter der Lichtweg durch die Linse, aber immer noch deutlich über dem festgelegten Aufzeichnungselektrode. Sobald die Elektrode unter dem Mikroskop sichtbar ist, sicherzustellen, dass die Spitze am äußersten Rand des Monitors von der ersten Elektrode. </li><li> Bewegen Sie die zweite Elektrode in Folge mit dem Mikroskop Fokus, bis beide Elektroden in der gleichen Brennebene sind. Es ist wichtig, dass das Niveau der Überdruck ist stark genug, um Spitzen Blockade zu vermeiden, aber nicht zu stark, so dass die erste ganze Zelle die Aufnahme zu unterbrechen. Dies führt zu dem positiven Druck zu induzieren Bewegung in 2-3 Neuronen von der Elektrode beim Eintritt in die erste Scheibe. </li><li> Suchen Sie eine postsynaptischen Partner in einer ähnlichen Brennebene mit dem ersten präsynaptischen Aufnahme (Abbildung 2C). Die Aufnahme wird in der Regel gepaart Obtain Aufnahmen zwischen CA3 Pyramidenzellen der zweite ganze Zelle aus einer 0-200 mm Neuron der ersten recording (2C, D). HINWEIS: Synaptische Übertragung zwischen Nervenpaare sind über Zeiträume von bis zu 3-4 Stunden stabil, wenn über diese Standard-Ganzzellaufnahmetechniken. </li></ol></li></ol></li><li> Synaptische Plastizität: Es war einmal eine erfolgreiche Gewinnung synaptisch verbundenen Pyramidenzelle Paar (3A, B), untersuchen die Eigenschaften der synaptischen Übertragung und Plastizität. <ol><li> LTP Induktion. <ol><li> LTP zu induzieren durch Paarung präsynaptischen Aktionspotentiale (1 Hz) mit postsynaptischer Depolarisation auf -10 bis 0 mV für 1 min (3C) 7-9,12-14. Initiieren Sie die Kopplung innerhalb von 10 min von Einbruch in der postsynaptischen Neuron. HINWEIS: LTP kann auch mit beiden Neuronen Stromklemme durch Paarung präsynaptischen und postsynaptischen Aktionspotentiale bei 1 Hz für 1 min, mit postsynaptischen Aktionspotentiale induziert werden gehalten ausgelöst 10 msec nach der Injektion von Strom in die präsynaptischen Neuron 8 </sbis&gt;. </li></ol></li><li> Weitere induzieren LTD durch Niederfrequenzstimulation (LFS) bei 1 Hz in Kombination mit einer leichten Depolarisation der postsynaptischen Neuron auf -55 mV für 5-10 min (3C) 9. </li></ol></li></ol>

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<li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons%3A+quantal+levels%2C+oscillations%2C+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li>
<li>Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li>
<li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn%2C+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Hier haben wir die Voraussetzungen für die Gründung erfolgreich gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen beschrieben. Gepaart Aufzeichnungen können auch in mehreren Präparaten, einschließlich akute Scheiben und dissoziiert Kultursysteme 26,27 durchgeführt werden. Während der Fokus hier ist auf die Induktion von mehr Formen der synaptischen Plastizität (LTP und LTD nämlich) gewesen ist, ist es wichtig zu betonen, dass gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen, akute...

Glutamat-Rezeptoren vermitteln die Mehrheit der erregenden synaptischen Transmission an Synapsen des zentralen Nervensystems. Die beiden wichtigsten Subtypen von ionotropen Glutamat-Rezeptoren an der Wirbelsäule Kopf der postsynaptischen Membran lokalisiert sind N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren. Bei Ruhemembranpotentiale, AMPA-Rezeptoren tragen die meisten der postsynaptischen Strom während der synaptischen Übertragung. Im Hippocampus spielt der NMDA-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Änderungen der Anzahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran: durch ein &quot;Koinzidenz-Detektor&quot; 1 wirkenden Änderungen der synaptischen Stärke 1 einzuleiten, nimmt der NMDA-Rezeptor in den synaptischen Mechanismen , die gedacht werden, um Lernen und Gedächtnis bei einem subzellulärer Ebene zu untermauern. In Reaktion auf die Depolarisation der postsynaptischen Neuron parallel präsynaptischen Transmitterfreisetzung tritt Kalzium über den NMDARezeptor AMPA-Rezeptor Einsetzen oder Entfernen 2 einzuleiten. Diese Rezeptordynamik zugrunde liegen Synapse Plastizität: eine Erhöhung der synaptischen Stärke ist Langzeit-Potenzierung 2,3 (LTP), während eine Abnahme der synaptischen Stärke ist die langfristige Vertiefung 4 (LTD). Daher AMPA-Rezeptor Bewegung gedacht für die synaptische Plastizität Expression verantwortlich zu sein, während NMDA-Rezeptoren wird angenommen, dass seine Induktion zu steuern. Die Bestimmung der genauen Mechanismen der synaptischen Übertragung und Plastizität zugrunde liegenden erfordert das Studium kleinen Populationen von Synapsen, idealerweise einzelne Synapsen. Während einige Synapsen sind sehr für Studie aufgrund der kleinen und diffuse Art der synaptischen Verbindungen geeignet auf dieser Ebene, zB der Kelch der gehaltene 5, für die meisten Populationen synaptischen das ist extrem schwierig. Zwei Hauptelektro Techniken entwickelt worden, um einzelne synaptischen Verbindungen zu untersuchen: Die erste ist eine minimale Stimulation where eine präsynaptischen Faser wird vermutet, stimuliert extrazellulär. Die zweite Technik gepaart Aufnahmen, wo zwei gleichzeitige Aufnahmen von ganzen Zelle synaptisch verbundenen Neuronen durchgeführt wird. Ein wesentlicher Vorteil der minimalen Stimulations ist, dass es schnell und relativ einfach durchzuführen, mit Platzierung einer extrazellulären Stimulationselektrode in das axonale Trakt, während gleichzeitig der Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron. Das Hauptanliegen bei der Verwendung dieser Technik ist, dass zuverlässige Stimulation einer einzelnen Zelle nur selten gewährleistet Studie nach Studie werden. Im Laufe der letzten fünfzehn Jahre haben wir routinemäßig verwendet zwei synaptisch verbunden Pyramidenzellen 6-17 gepaart Ganzzellableitungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass nur eine präsynaptische Neuron konsistent und zuverlässig stimuliert. Außerdem können nicht nur elektro Charakterisierung auch pharmakologische Manipulation der präsynaptischen Neuron 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit von synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen gering, so verbundenen Paaren schwierig bis 19 zu erhalten. Die Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturen umgeht dieses Hindernis als synaptischer Verbindungen wieder hergestellt werden kann in vitro und außerdem die Art der resultierenden Verbindungs ​​ist ähnlich zu der des natürlichen Gehirngewebe 20. Darüber hinaus organotypischen Kulturen auszudrücken LTP, LTD 7-10,12-15,21 und weitere Formen der kurzfristigen synaptischen Plastizität gepaart mit Puls-Erleichterung (PPF) und Depression (PPD) 6,22,23, so dass Plastizität Mechanismen zur in Paaren von Neuronen untersucht werden. Hier beschreiben wir die detaillierte Methode erfolgreich erreichen gepaart Aufnahmen in diesem in vitro-System beteiligt. Diese Information kann leicht in anderen experimentellen Systemen, einschließlich akuter Scheiben und anderen Hirnregionen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td></td><td></td><td>Stabile motorisierte Mikromanipulatoren&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Flaches Gewebebad</td></tr><tr><td>HEPES Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>DIC Kamera</td></tr><tr><td>1 M Tris Stammlösung</td><td></td><td></td><td>Verstärker</td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>Computer</td></tr><tr><td>Pferd Serum&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Schwingungsisolationstisch</td></tr><tr><td>Kunststoffbeschichteter Miniaturspatel</td><td></td><td></td><td>Aufrechtes Mikroskop</td></tr><tr><td>Soft-Pinsel</td><td></td><td></td><td>Software zur Datenerfassung und -analyse</td></tr><tr><td>Manueller Gewebezerkleinerer</td><td></td><td></td><td>Elektrodenabzieher</td></tr><tr><td>#2 Filterpapier</td><td></td><td></td><td>Faradayscher Käfig</td></tr><tr><td>#5 Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membraneinlagen CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Haube</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gepaart ganze zelle recordings in organotypische hippocampus

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paaraufzeichnungen beinhalten gleichzeitige Patch-Clamp-Aufzeichnungen ganzer Zellen von zwei synaptisch verbundenen Neuronen, was nicht nur eine direkte elektrophysiologische Charakterisierung der synaptischen Verbindungen zwischen einzelnen Neuronen ermöglicht, sondern auch eine pharmakologische Manipulation entweder des präsynaptischen oder des postsynaptischen Neurons. Bei der Durchführung in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Neuronen synaptisch verbunden sind, signifikant erhöht. Dieses Präparat ermöglicht leicht die Identifizierung von Zelltypen, und die Neuronen behalten ihre Morphologie und Eigenschaften der synaptischen Funktion bei, ähnlich wie im nativen Hirngewebe. Ein großer Vorteil von gepaarten Ganzzellaufzeichnungen sind die hochpräzisen Informationen, die sie über die Eigenschaften der synaptischen Übertragung und Plastizität liefern können, die mit anderen, gröberen Techniken der extrazellulären axonalen Stimulation nicht möglich sind. Gepaarte Ganzzellaufzeichnungen werden oft als zu schwierig empfunden. Obwohl diese Technik herausfordernde Aspekte aufweist, können gepaarte Aufzeichnungen von jedem durchgeführt werden, der in der Ganzzell-Patch-Klemmung geschult ist, vorausgesetzt, dass bestimmte Hardware- und methodische Kriterien eingehalten werden. Die Wahrscheinlichkeit, synaptisch verbundene gepaarte Aufzeichnungen zu erhalten, steigt signifikant mit gesunden organotypischen Schnitten und stabiler Mikromanipulation, die eine unabhängige Erstellung von prä- und postsynaptischen Ganzzellaufnahmen ermöglichen. Während CA3-CA3-Pyramidenzellpaare am häufigsten in der organotypischen Schnitt-Hippocampus-Präparation verwendet werden, war diese Technik auch bei CA3-CA1-Paaren erfolgreich und kann an alle Neuronen angepasst werden, die in derselben Schnittpräparation synaptisch verbunden sind. In diesem Manuskript stellen wir die detaillierte Methodik und die Anforderungen für die Etablierung dieser Technik in jedem für Elektrophysiologie ausgestatteten Labor dar.

Synaptischer Verbindungen ist offensichtlich durch die Stimulation der präsynaptischen Neuron ein Aktionspotential, indem ein Stromimpuls depolarisiert (typischerweise 20-50 pA für 20 msec) über den Aufzeichnungselektroden ausgelöst. Die postsynaptischen Stromspur wird dann für das Vorhandensein einer monosynaptische EPSC sucht evozierte kurzfristig (&lt;5 ms) und konsistente Latenzen nach dem Höhepunkt der präsynaptischen Aktionspotential (3A). In den meisten Experimenten mehrere postsynaptischen Neuro...

Pair-Aufzeichnungen sind simultane Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von zwei synaptisch verbundenen Neuronen, die eine präzise elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der Synapsen zwischen einzelnen Neuronen ermöglichen. Hier beschreiben wir die detaillierte Methodik und die Anforderungen für die Etablierung dieser Technik in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen in jedem Labor, das für Elektrophysiologie ausgestattet ist.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, elektrophysiologisch aus dem minimalen synaptischen Schaltkreis im Gehirn aufzeichnen zu können. Dies wird durch Aufnahmen von organotypischen Schnittkulturen aus dem Hippocampus von Ratten erreicht, die in plastischen Kultureinsätzen gezüchtet wurden. Diese Scheiben stellen ausgeklügelte, aber angemessene synaptische Verbindungen her, die nach einer Periode des Wachstums in der Kultur leicht aufgezeichnet werden können.Das Aufzeichnen in diesen Schichten ermöglicht die Isolierung der synaptischen Aktivität des minimalen synaptischen Schaltkreises, der zwischen nur zwei Neuronen stattfindet, und ermöglicht somit die Untersuchung der grundlegendsten Eigenschaften neuronaler Schaltkreise. Diese Methode kann verwendet werden, um die Funktion synaptischer Mikroschaltkreise im Hippocampus zu untersuchen, aber sie kann für jeden Bereich des Gehirns verwendet werden, in dem benachbarte Neuronen synaptisch verbunden sind. Die visuelle Demonstration sowohl der Aufzeichnungs- als auch der Präpariermethoden ist von entscheidender Bedeutung, da viele der Schritte von der genauen Identifizierung von Orientierungspunkten und Neuronen des G

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

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Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

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Photostimulation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen in Hippocampus-Schnitten der Maus

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Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Lernen Sie gepaarte Ganz-Zell-Ableitungen in organotypischen Hippocampus-Schnitten zur Untersuchung synaptischer Schaltkreise. Diese Methode isoliert neuronale Aktivität zwischen zwei verbundenen Neuronen.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

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