Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke, Aedes albopictus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, transkriptionelle Komponenten der photoperiodischen Diapausenreaktion zu identifizieren. Bei einer Nicht-Modell-Mücke des Ellenbogen-Pictus der Achtziger Jahre wird dies erreicht, indem zunächst biologisch replizierte Proben von Diapause- und Nicht-Diapause-Eiern über verschiedene photoperiodische Behandlungen hergestellt werden. In einem zweiten Schritt wird aus jedem Replikat RNA für die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung extrahiert.

Die RNA-Sequenzen werden dann rechnerisch verarbeitet, um sie zu Congs zusammenzusetzen und zu annotieren. Letztendlich können Variationen in der Genexpression als Reaktion auf Diapause induzierende versus nicht Diapause induzierende Photoperioden aus Reeds MAP auf die RNA-Assemblierung abgeleitet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. einer Mikrostrahlenanalyse, besteht darin, dass keine vorherigen genetischen Ressourcen wie die Genomsequenz oder ein Microarray erforderlich sind, um globale Schätzungen der Genexpression als Reaktion auf Diapausebedingungen zu erhalten.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der ökologischen Genomik zu beantworten, z. B. was die transkriptionelle Grundlage von DPOs ist oder andere wichtige ökologische Anpassungen in Nicht-Modellorganismen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig sein kann, ausreichende Mengen an Diapause- und Nicht-DPO-Eizellen zu erhalten, und die nachgelagerte bioinformatische Analyse eine Herausforderung darstellen kann. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechnologien immer erschwinglicher wurden und eine deduzierbare Methode zur Erstellung von Expressionsprofilen des gesamten Genoms in Nicht-Modellorganismen anboten, bevor wir mit dem Verfahren begannen.

Stellen Sie zwei Photoperiodenschränke mit programmierbarer Beleuchtung auf 21 Grad Celsius ein, um einen optimalen Diapausenausdruck und eine relative Luftfeuchtigkeit von ca. 80 % zu erzielen. Programmieren Sie einen Schrank für eine nicht diapauseinduzierende Fotoperiode mit einem Dunkelzyklus von 16 acht Lichtern und den anderen für einen Diapausen-induzierenden Zyklus von acht 16 Lichtern, wobei das Licht gleichzeitig eingeschaltet ist, damit beide Schränke die zirkadiane Zeit zwischen den Fotoperioden synchronisieren. Tauchen Sie dann Eierpapier für die entsprechende Anzahl von Eiern in 500 Milliliter entionisiertes Wasser und fügen Sie einen Milliliter gemahlenes Hundefutter und Salzgarnelenfuttergülle hinzu. Decken Sie den Behälter mit einem Netz ab und legen Sie ein Gummiband um das Netz, um es an Ort und Stelle zu halten.

Dann brüten Sie die Eier etwa 24 Stunden lang in den 16 acht hellen dunklen Langzeit-Fotoschrank. Am nächsten Tag werden etwa 30 geschlüpfte Larven pro Gruppe in einzelne 10 mal 10 mal zwei Zentimeter große Petrischalen umgefüllt, die mit 90 Millilitern entionisiertem Wasser gefüllt sind. Setzen Sie die Larven alle 48 bis 72 Stunden in eine saubere Schüssel um und füttern Sie sie bei jedem Transfer mit frischer Futtergülle.

Nach etwa sechs Tagen legen Sie den Boden von drei bis vier Käfigen für erwachsene Tiere für jede photoperiodische Behandlung mit nassem Filterpapier aus und befeuchten Sie das Filterpapier mit ausreichend deionisiertem Wasser, um die lokale Luftfeuchtigkeit im Käfig zu erhöhen und stehendes Wasser zu vermeiden. Notieren Sie sich den Fotozeitraum, das Startdatum der Replikationsnummer und andere für das Experiment relevante Informationen mit einem Permanentmarker an der Seite des Käfigs. Übertragen Sie dann 10 Tage lang jeden zweiten Tag den Puy in kleine Tassen mit sauberem Wasser mit nicht mehr als 50 Puy pro 25 Milliliter Wasser in die entsprechenden Käfige für Erwachsene für das Experiment und legen Sie organische Rosinen auf das obere Netz des Käfigs, um die geschlüpften Erwachsenen mit Zucker zu versorgen Um die Position der Eizellen vier bis fünf Tage nach der ersten Blutmahlzeit zu stimulieren, Füllen Sie dunkle 50-Milliliter-Becher, die mit einem strukturierten, nicht gebleichten Papiertuch ausgelegt sind, zur Hälfte mit entionisiertem Wasser und stellen Sie einen Becher in jeden Käfig, um die Eier zu sammeln und aufzubewahren.

Ersetzen Sie das Eierpapier in jedem Käfig durch frisches Papier, legen Sie das kürzlich entfernte Papier in Petrischalen und bewahren Sie es in dem acht 16 hellen dunklen Kurztag-Fotoschrank auf, um verwirrende Effekte auf die Eilagerung zu vermeiden. Trocknen Sie das Eipapier ca. 48 Stunden nach der Entnahme an der frischen Luft so, dass es sich schlaff und leicht feucht anfühlt, aber nicht so nass, dass es vom Wasser dunkel wird oder das Schlüpfen anregt. Um die Diapause-Vorfälle zu messen, notieren Sie die Anzahl der Eier auf jedem Eierpapier.

Tauchen Sie dann die einzelnen Papiere vollständig in eine 90 Milliliter Petrischale mit ca. 80 Millilitern entionisiertem Wasser. Um das Schlüpfen zu stimulieren, fügen Sie etwa 0,25 Milliliter Speisegülle hinzu und geben Sie die Petrischale nach 24 Stunden auf eine schwarze Oberfläche. Platzieren Sie nun eine Lichtquelle auf einer Seite des Lichts, die Larven bewegen sich vom Licht weg, so dass eine klare Zählung des Individuums zuerst in den Sternlarven möglich ist.

Verwenden Sie eine Pipette, um jede Larve nach dem Zählen zu entfernen, um ein erneutes Zählen von Individuen zu verhindern. Dann die Eierpapiere in eine neue Petrischale geben, um sie rot trocknen zu lassen. Nachdem eine Woche später eine zweite Charge Jungtiere gezählt wurde, legen Sie das Eipapier mit den restlichen nicht geschlüpften Eiern in neue 90-Milliliter-Petrischalen mit etwa 80 Millilitern frischer Bleichlösung und achten Sie darauf, dass die Papiere vollständig in die Bleichlösung eingetaucht sind.

Lassen Sie die Papiere über Nacht unter einem Abzug liegen und verwenden Sie dann am nächsten Tag ein Lichtmikroskop, um die Anzahl der nicht geschlüpften Eier zu zählen. Wenn eine Eizelle embryoniert ist, zeigt sie eine cremefarbene Farbe, wobei die Augen als zwei kleine schwarze Punkte erscheinen, die sich auf der Rückenseite gegenüberliegen. Reinigen Sie die Bank zunächst vorsichtig mit RNA-Dekontaminationslösung, um alle verbleibenden Nukleasen zu entfernen und einen RNA-Abbau zu vermeiden.

Verwenden Sie als Nächstes eine Kamelhaarbürste, um mindestens 400 Mückeneier zu bürsten, die sich während der Entwicklungszeit entwickelnde Embryonen enthalten. Interessanter Punkt in Glasschleifmaschinen. Geben Sie in einen Abzug einen Milliliter Triol und mahlen Sie die Eier, bis sie vollständig pulverisiert sind, und führen Sie dann die RNA-Extraktion in Triol durch, gefolgt von einer Isopropanol-Fällung gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Verwenden Sie nun bis zu einem Mikroliter D ns pro bis zu 10 Mikrogramm RNA in 50 Mikrolitern Reaktion für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie die Reaktion anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in fünf Mikrolitern suspendiertem DNA-Inaktivierungsreagenz. Die Suspension während der Inkubationszeit dreimal sanft vortexen.

Zentrifugieren Sie dann die RNA-Extrakte 1,5 Minuten lang bei 10.000-fachem G und Eloqua, der RNA, die Überstände enthält, in frische Röhrchen für die Sequenzierung. Im Begleittext finden Sie Einzelheiten zur Verarbeitung der resultierenden Next Generation Sequencing-Daten vom Lesen über die Aufbereitung, Assemblierung und Annotation bis hin zur differentiellen Expressionsanalyse. In dieser ersten Abbildung zeigt die Fluorometrie von zwei repräsentativen RNA-Proben zwei Banden bei etwa 2000 Nukleotiden.

Die ribosomale RNA des Insekts 28 besteht aus zwei Polynukleotidketten, die durch Wasserstoffbrückenbrücken zusammengehalten werden, die leicht durch kurzes Erhitzen oder durch Wirkstoffe, die Wasserstoffbrückenbrücken aufbrechen, gestört werden können. Die resultierenden zwei Komponenten sind ungefähr so groß wie eine 18 s ribosomale RNA in der zweiten RNA-Probe; in diesem repräsentativen Experiment kann ein hoher Abbau beobachtet werden. Die photoperiodische Behandlung einer repräsentativen Gruppe von a albopictus-Mücken führte zu einer hohen Diapause bei kurzaufgezogenen Mücken und zu einer niedrigen Diapause bei langtägigen aufgezogenen Mücken.

Obwohl es einige Unterschiede zwischen den Replikaten gab, wies beispielsweise die Gruppe mit dem kurzen Tag zwei eine geringere Diapausenrate auf als die anderen Replikate. Eine Trinity-Assemblierung von digital normierten Reads ergab 76.377 Contigs mit einer mittleren Conig-Länge von 1020 3.1 und einer maximalen Conti-Länge von 20.892. Beachten Sie, dass die Verteilung der Conti-Längen stark in Richtung kürzerer Contigs verzerrt ist.

Dies ist typisch für die Assemblierung des Denovo-Transkriptoms. In dieser abschließenden Grafik zeigen die differentiellen Expressionsanalysen eines ähnlichen Arbeitsablaufs von Embryonen, die 11 und 21 Tage nach der Eiposition unter Diapause-induzierenden Bedingungen aufgezogen wurden, 3.128 differentiell exprimierte Gene zwischen diesen beiden Zeiträumen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis acht Monaten nach der Gewebeerzeugung und der göttlichen Informatikanalyse abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass der Erfolg bei jedem Schritt überprüft werden sollte, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Vergewissern Sie sich beispielsweise, dass die Versuchsbedingungen DPAs und Eier ohne Diapause hervorgebracht haben, bevor Sie die RNA-Integrität nach diesem Verfahren testen. Andere Methoden, wie z.B. quantitative R-T-P-C-R oder vergleichende Genomik-Analysen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur gewebe- oder entwicklungsspezifischen Expression der interessierenden Gene und/oder Prozesse der molekularen Evolution zu beantworten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Triol äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Handschuhen, einem Laborkittel und einem Abzug getroffen werden sollten.