Name: Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Lichtscheibenmikroskopie mit einem SPIM-Modul für invertierte Mikroskope zur hochauflösenden Bildgebung dreidimensionaler Zellspheroide. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht präzise Untersuchungen in der Zellbiologie.

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Dieses Projekt wurde vom Land Baden-Württemberg sowie von der Europäischen Union, Europäischer Fonds finanziert für sterben Regionale entwicklung. Die Autoren danken Rainer Wittig (ILM Ulm) für die Bereitstellung der U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Zelllinie und Claudia Hintze für geschickte technische Hilfe.

1. Zell Sphäroid wächst und Inkubation <ol><li> Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert <ol><li> Bereiten Agarose 1,5% im Kulturmedium durch Zugabe von 0,45 g Agarose auf 30 ml Kulturmedium (ausreichend für 6 Platten). </li><li> Das Gemisch aus Schritt 1.1.1 auf mindestens 80 ° C unter Rühren von Zeit zu Zeit. </li><li> Füllen Sie 50 ul der erhitzten Mischung aus Schritt 1.1.2 in jedes Well einer 96-Well-Platte und lassen Sie es in 1-2 Stunden fest werden. Lagern Sie die Platten geschlossen und abgedeckt im Kühlschrank bei 5 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Samen etwa 150 MCF-7-Brustkrebszellen in jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 96 Vertiefungen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit Ham F-12-Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin / Streptomycin . </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 3776, c. </li><li> Die Zell Sphäroide mit der Anthracyclin-Antibiotikum Doxorubicin-Hydrochlorid für 6 Stunden Inkubation bei einer Konzentration im Bereich zwischen 2 um und 8 um (in Kulturmedium) in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Die Zell Sphäroiden mit Kulturmedium oder Earle-Balanced Salt Solution (EBSS) vor der Mikroskopie zu waschen. </li></ol></li><li> Versuch 2: Oxidationsprozess in Sphäroiden eine Redox-Sensor zum Ausdruck <ol><li> Samen etwa 400 U251-MG-L106 Glioblastomzellen permanent mit der Glutathion-empfindliche grün fluoreszierenden Redoxsensor Grx1-roGFP2 in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) transfiziert einer 96-Well-Platte in DMEM Kulturmedium mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 ug / ml) ergänzt. </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; #181; l Wasserstoffperoxid-Lösung (purum pa, ≥ 30%) auf 990 ul bi-destilliertem Wasser zu einer 100 mM Stammlösung zu schaffen, um innerhalb von 12 Stunden verwendet werden. </li><li> Von der Stammlösung aus Schritt 1.2.3 bis 50 um in EBSS direkt vor dem Experiment. </li><li> Während der Messung mit Wasserstoffperoxid 50 um EBSS zur Oxidation des Redox-Sensor die Zellkügelchen über das mikrofluidische System zu inkubieren. </li></ol></li><li> Versuch 3: Initiation und Kennzeichnung von zellulären Nekrose innerhalb Sphäroiden <ol><li> Samen etwa 400 Zellen (zB U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Glioblastomzellen) in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) einer Platte mit 96 Vertiefungen in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 mg / ml). </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Inkubieren Sie die ZelleSphäroide mit der mitochondrialen Elektronentransportinhibitor Rotenon für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 uM in einem Kulturmedium, um zelluläre Nekrose induzieren. Die gleichzeitige Inkubation mit einem grünen Farbstoff Zytotoxizität für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 ul in 1 ml Kulturmedium zu nekrotischen Zellen zu markieren. </li><li> Mit Kulturmedium oder EBSS vor Mikroskopie Waschen Sie die Zell Sphäroiden. </li></ol></li></ol> 2. Lichtblatt Anpassung Hinweis: Zur Erzielung bester Ergebnisse ist darauf zu achten, dass die Strahltaille des Lichtblattes ist in der Fokusebene der Objektivlinse ist. Die Position der Strahltaille kann nur durch Beobachten der Lichtblatt in vertikaler Position in bezug auf die Kapillare ausgerichtet werden (siehe Schritte 2,5-2,8). <ol><li> Verwenden Sie ein inverses Mikroskop und montieren Sie die SPIM Anregung Modul, wie in Lit. beschrieben. 16 an der Grundplatte des Positionierungstisches (siehe Abbildung 1a). </li><li> Rüsten Sie das Mikroskop mit einer 10X / 0,3 oder 20x / 0,5 Mikroskopobjektivlinse und ein geeignetes Tiefpassfilter (beispielsweise λ ≥ 515 nm) in dem Detektionspfad des Mikroskops. </li><li> Halterung eine integrierende Kamera auf den Detektionsanschluss des Mikroskops. </li><li> Eine parallele kollimierten Strahl eines Lasers oder einer Laserdiode mit einer Anregungswellenlänge von vorzugsweise 470 nm und es auf dem SPIM Modul. </li><li> Drehen die Zylinderlinse von 90 Grad, die das Licht Blatt in einer vertikalen Position für eine axiale Einstellung der Strahltaille des Lichtbogenüber. </li><li> Platzieren einer Kapillare eine Flüssigkeit mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der in den Probenhalter enthält. </li><li> Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Kapillare, so dass er zentriert ist und die Strahltaille des Lichtblattes im Fokus ist. </li><li> Einstellen der Strahltaille durch Veränderung der axialen Position der Zylinderlinse sich. Drehen Sie die Linse nach Anzeigenstellung. </li></ol> 3. Zell Sphäroid Anwendung und Mikroskop-Feed Synchronisation <ol><li> Küvette Sphäroide einzeln oder in Gruppen in dem rechteckigen Borosilikatglas Kapillaren 16 mit einem Innenquerschnitt von 600 um x 600 um und einer Wanddicke von 120 um. Zwei Verfahren für die Anwendung eines Zell-Sphäroiden haben sich als erfolgreich erwiesen. <ol><li> Nehmen Sie die leeren Kapillare senkrecht mit Daumen und Mittelfinger und dichten die obere Öffnung mit dem Zeigefinger. Bringen Sie die untere Öffnung in der Nähe der Zell-Sphäroiden in seiner Umgebung Flüssigkeit (EBSS oder Kulturmedium). Lassen Sie den Zeigefinger von der oberen Öffnung. Flüssigkeit mit der Zell-Sphäroiden in sie sofort durch Kapillarkräfte eingeweicht werden. Einstellen der Position des Sphäroids innerhalb der gefüllten Kapillare durch Schwerkraft in den jeweiligen aufrechten Position der Kapillare. </li><li> Alternativ gelten die Zelle Sphäroid auf die Kapillare über Pipettieren. Achten Sie darauf, that die Öffnung der Pipettenspitze ist, die einerseits groß genug für das Sphäroid Größe und andererseits kleiner oder gleich groß wie der Innendurchmesser der Kapillare. </li></ol></li><li> Platzieren der Kapillare mit dem Sphäroid in ihm in einem speziellen Probenhalter für die Mikroskopie. </li><li> Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Zell-Sphäroiden, daß sie zentriert und ausgerichtet. </li><li> Stellen Sie die Anpassung zwischen dem Lichtbogen und der Brennebene des Mikroskopobjektivlinse in dem Detektionspfad durch Einstellen der Position des Reflexionsspiegels und der zylindrischen Linse (siehe Einstellschraube in 1B). </li><li> Einstellen der Mikrometerschraube (siehe Figur 1B) entsprechend den Brechungsindices und der numerischen Apertur der Objektivlinse, um das Aquarium Effekt zu kompensieren. Anmerkung: verschiedene Brechungsindizes der Probe, und die sie umgebenden Medien ter die Objektivlinse zu einer Differenz zwischen der Verschiebung der Objektivlinse und der Verschiebung der Brennebene. Da der Lichtbogen wird durch die Objektivrevolver bewegt wird, wird die Fehlanpassung zwischen der Verschiebung des Lichtbogen (entsprechend der Verschiebung der Objektivlinse) und die Verschiebung der Fokusebene durch einen Hebelarm kompensiert (siehe Abbildung 1b). Die Mikrometerschraube wird verwendet, um den Abstand zwischen den oberen und den unteren Stift anzupassen, um die Verschiebung des Lichtbogens gemäß der numerischen Apertur der Objektivlinse und der Brechungsindizes ändern. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500"> Abbildung 1. (A) Bild von der an der Grundplatte des Stelltisch von einem inversen Mikroskop montiert einzigen Ebene Beleuchtungsmodul, (B) Aufbau der einzelnen Ebene BeleuchtungModul und das Mikroskop Feed Synchronisation auf die Hebe-Mismatch (Aquarium-Effekt) zwischen Brennebene und Beleuchtungsebene auszugleichen. Az o zeigt die Verschiebung der Objektivlinse und Az f die Verschiebung der Brennebene und der Lichtbogen. Die Einlage zeigt Querschnitte von Sphäroiden enthält Kapillaren. Links: rechteckige Kapillare mit Innendurchmesser von 600 um (Wand 120 um). Rechts: Setup für die Rotation eingesetzt. Einen inneren runden Kapillare (Innendurchmesser 400 um, Außendurchmesser 550 um) in dem äußeren rechteckigen Kapillare gedreht. Der Raum zwischen den beiden Kapillaren mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt ist. 4. Messung in dynamischen flüssigen Umgebung HINWEIS: Die bisherige Protokoll wird für die statische Inkubation vor einer Messung, bei der die Zelle Sphäroid zuvor in der Kapillare durch einfache Gravitation inkubiert und dann an Ort und Stelle gehalten wurde verwendet. Es besteht keine Notwendigkeit für eine weitere Befestigungsauf. Für Messungen in strömenden Medien, in denen eine dynamische Inkubation und daher ist eine dynamische Umgebung wünschenswert Aufnahmekinetik messen, kann diese Unterprotokoll auszuführen. Schritte 4,5-4,9 sind entscheidend, um Luftblasen Erreichen der Probe zu vermeiden. <ol><li> Füllen der Kapillare mit FCS für 30 min später zelluläre Adhäsion einer Zelle Sphäroid mit dem inneren Glasoberfläche zu unterstützen. </li><li> Lassen die restlichen FCS Beschichtung im abgereicherten Kapillare austrocknen mindestens 12 Stunden. </li><li> Einführung der Zell-Sphäroiden in die FCS beschichtet Kapillare, wie in Schritt 3.2 beschrieben. </li><li> Verlassen die Kapillare im Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C für weitere 2-4 h auf zelluläre Adhäsion des Sphäroids verursachen. </li><li> Den Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems (siehe Abbildung 2). Verwenden eine peristaltische Pumpe, um die Zuströmung des Schlauchs zu füllen (Innendurchmesser: 0,89 mm) mit Kulturmedium, das den Fluoreszenzfarbstoff, Arzneimittel oder Mittel. </li><li> Connect der Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems zu einer Blasenfalle (siehe Abbildung 2). </li><li> Erste Klemme der Kapillare blasenfrei an den Zulauf Rohr und klemmen dann die andere Seite der Kapillare an der Ablaufschlauch. </li><li> Abstimmung der Temperatur der Flüssigkeit von dem Wasserbad zu dem gewünschten Wert (zB 37 ° C). </li><li> Einstellen der Schlauchpumpe auf die gewünschte Pumpengeschwindigkeit (zB Flußrate: 9 ml / min, Pumpengeschwindigkeit in der Kapillare: 25 mm / min). </li><li> Sammeln Sie die gepumpte Flüssigkeit entweder in einem Empfänger (Open-Loop-Setup), führen Sie es zurück zu seiner Quelle (Closed-Loop-Setup) oder führen Sie es direkt in den Schlauch der Schlauchpumpe (tight Closed-Loop-Setup). </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500"> Abbildung 2. Mikrofluidik-Setup (Open-Loop-und Closed-Loop fest); Inlay: Beleuchtung eines spheroid innerhalb einer Mikro-Kapillare mittels Lichtbogen auf der Basis der Fluoreszenzmikroskopie zu einem inversen Mikroskop gekoppelt. 5. Datenerfassung und Auswertung <ol><li> Eingestellt, die Laserleistung und die Integrationszeit für die Bildaufnahme. </li><li> Achten Sie darauf, dass die in Schritt 5.1 festgelegten Parameter nicht Licht Dosiswerte etwa 50-100 J / cm 2 für native Zellen oder 10-20 J / cm 2 für Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert oder mit einem fluoreszierenden Protein kodierenden Plasmid transfiziert nicht überschreiten Phototoxizität zu vermeiden (Details siehe Ref. 12). </li><li> Stellen Sie die Schrittweite für die Z-Stapel, um Az = 5-10 um was bevorzugt für 3-dimensionale Datenanalyse ist als das Licht Blechdicke etwa 10 um. </li><li> Führen Messungen von Einzelbildern oder Z-Stapel durch Variation der Brennebene innerhalb des Zell-Sphäroiden. </li></ol>

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<li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li>
<li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007(2013).</li>
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<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li>
<li>Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , EP 13 184 931.7 (2013).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) Gerät, das für 3-dimensionale Zellsysteme optimiert ist, zB, mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). Drei beispielhafte Anwendungen umfassen (1) die Aufnahme eines Zytostatikums und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt (deren Beitrag zur chemotherapeutischen Wirksamkeit bleibt ausgewertet werden), (2) Messung des Redox-Zustand durch Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor auf Zugabe eine...

Neben den gut etablierten Methoden (oder konfokalen Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 1-4, Structured Illumination Microscopy 5,6) Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) hat sich als eine wertvolle Methode der 3D-Bildgebung 7,8 sein, 9. Von besonderem Interesse ist die Anwendung eines 3-dimensionalen Zellkulturen, beispielsweise multizellulären Tumor-Sphäroide (MCT), die zunehmend für die Wirkstoffforschung 10,11 verwendet werden. Darüber hinaus ist eine bevorzugte Methode SPIM, wenn auch bei langfristiger Exposition oder sich wiederholende Messungen schlechten Licht Dosen sind erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten, da für die Messung von jeder Ebene der Probe nur diese Ebene dem Licht ausgesetzt wird. Dies steht im Gegensatz zu anderen Mikroskopietechniken, wobei zur Detektion der jeweiligen Brennebene die gesamte Probe beleuchtet wird, so daß bei der Aufzeichnung einer Vielzahl von Ebenen, die die Lichtdosis summiert und kann die Probe 12 zu beschädigen. </p&gt; Lichtschnittmikroskopie oder SPIM auf Beleuchtung der Probe in Richtung senkrecht zur Beobachtungspfad entweder durch die Verwendung einer Zylinderlinse oder durch Abtasten des anregenden Laserstrahls (für eine Übersicht siehe Ref. 8) basiert. Dies erfordert oft spezielle Probenkammern 13,14 oder Matrizen, zB Agarose 7,15, in speziellen High-Cost-Mikroskopen implementiert. Als Alternative zu diesen Systemen eine vergleichsweise einfache Beleuchtungseinrichtung für SPIM wurde entwickelt und mit einem herkömmlichen inversen Mikroskop 16 (siehe Figur 1) angepaßt ist. Es besteht aus einem Laserstrahl auf einen Durchmesser von 8 mm durch eine Zylinderlinse (Fokuslänge: 50 mm, numerische Apertur: 0,08) erweitert und fokussiert, um einen Lichtschnitt von 6-10 um Dicke über eine Schärfentiefe von etwa 100 um . Proben werden in einer rechteckigen Kapillare mit 600-900 um Innendurchmesser vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet len ​​befindets für die Fluoreszenzdetektion. Diese Hauptmerkmale werden gegenwärtig abgeschlossen und durch die Verwendung von fortschrittlichen Mikrokapillare Ansätze zum Halten und zum Drehen der Proben, die synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtblatt (in axialer Richtung) und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion (identischen optischen Pfad eingesetzt optimiert Längen Verschiebung erfordern eine Korrektur der mechanischen Vorschub) und die Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von fluoreszierenden Farbstoffen, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Arzneimitteln, damit die erforderliche Menge und Kosten zu minimieren.

<table><tbody><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>Für das Wachstum von Sphäroidzellen</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>Für die Zellsphäroid-Züchtung</td></tr><tr><td>MCF-7 Zelllinie</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td></td></tr><tr><td>Zelllinie U251-MG-L106 Zelllinie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zelllinie DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Zellkulturergänzungsmittel</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratorien&nbsp; &nbsp;</td><td>P02-015</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Fluoreszierender Farbstoff (ACHTUNG: akute Toxizität)</td></tr><tr><td>Grüner Zytotoxizitätsfarbstoff</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluoreszierender Zytotoxizitätsfarbstoff</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Zellulärer Inhibitor (VORSICHT: akute Toxizität)</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Reagenz zur Oxidation (ACHTUNG: akute Toxizität)</td></tr><tr><td>Kapillares</td><td>VitroCom&nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-Kamera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-Kamera</td></tr><tr><td>AxioVision Datenerfassungssoftware</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>Version 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Laserdiode</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Verwendet mit Treiber PDL800-B</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Neu kalibriert, um die minimale Pumpendrehzahl um 1/10&nbsp;</td></tr><tr><td>Silikonschläuche</td><td>IDEX Health & Germany Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

einzigen ebene beleuchtungsmodul und micro-kapillar-ansatz für ein weitfeld-mikroskop

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Ein Modul für Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einem umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert, zB mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). SPIM Anregungsmodul Formen und lenkt das Licht, so dass die Probe durch einen Lichtschnitt senkrecht zur Detektion Gang des Mikroskops beleuchtet. Das System wird durch Verwendung einer rechteckigen Kapillare zur Aufnahme (und in einer erweiterten Version auch durch eine Mikrokapillare Ansatz zum Drehen) der Proben, durch synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtbogen und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird, sowie dadurch gekennzeichnet, durch Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen. Ein Protokoll für die Arbeit mit diesem System gegeben wird, und einige technische Details berichtet. Repräsentative Ergebnisse umfassen (1) Messungen der bisnehmen eines Zytostatikums (Doxorubicin) und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt, (2) Redox-Messungen unter Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor bei Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette. Unterschiede und Vorteile der vorliegenden SPIM Modul im Vergleich mit bestehenden Systemen diskutiert.

Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert Ein Z-Stapel-Scan eines zuvor inkubiert MCF-7-Zell-Sphäroiden (8 uM Doxorubicin, 6 h) wird in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt ausführliche Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin 17 und seinem Abbauprodukt 18,19. In der äußeren Zellschicht der Sphäroid roten Fluoreszenz Doxorubicin wird hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, während in de...

Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.

Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Einebenenbeleuchtungsmikroskopie mit einem Lichtblattanregungsmodul für inverse Mikroskope durchzuführen und auf dreidimensionale Zellsphäroide anzuwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst mit einer Pipette ein Zellsphäroid aus der Vertiefung einer Mikrotiterplatte in eine zweite Vertiefung übertragen wird, um nach dem Waschen zu inkubieren. Das S-Sphäroid wird dann in eine rechteckige Kapillare eingeführt.Der zweite Schritt besteht darin, das Lichtblattbeleuchtungsmodul an der Grundplatte des inversen Mikroskop-Positioniertisches zu montieren. Als nächstes wird die Kapillare, die das Steroid enthält, in einen speziellen Probenhalter für die Mikroskopie gegeben. Der letzte Schritt besteht darin, die Übereinstimmung zwischen dem Lichtblatt und der Brennebene der Mikroskopobjektivlinse im Detektionspfad einzustellen.Letztendlich können dreidimensionale Fluoreszenzmessungen durch Variation der Fokusebene innerhalb des Zellsphäroids durchgeführt werden, um Informationen über Einzelbilder oder Zacks über die Aufnahme von Medikamenten oder die Struktur des S-Sphäroids zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehende

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

In vielen biologischen und klinischen Situationen ist es vorteilhaft, zelluläre Prozesse zu untersuchen, wie sie sich entwickeln in ihrer Muttersprache Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Montage und die Verwendung eines Low-Cost-Glasfaser-Mikroskop, das Echtzeit-Bildgebung in der Zellkultur, Tierversuche und klinische Patientenstudien bieten kann.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

A ohne Linsen auskommt, On-Chip-Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattform wird gezeigt, dass kann image fluoreszierende Objekte über einen ultra-wide field-of-view von z. B.&gt; 0,6-8 cm2 mit &lt;4 &amp;mgr; m Auflösung mit einem Druck-Sampling-Basis Decodieralgorithmus. Eine solche kompakte und wide-field fluoreszierenden On-Chip-Bildgebungsverfahren könnte wertvoll für High-Throughput-Zytometrie, seltene Zellen Forschungs-und Microarray-Analyse.

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

Die komplette Konstruktion eines eigenen, real-time konfokalen Scanning Imaging-System beschrieben wird. Dieses System, das leicht für Video-rate-Mikroskopie und Mikroendoskopie verwendet werden kann, erlaubt eine Reihe von Imaging-Geometrien und-Anwendungen nicht zugänglich mit handelsüblichen konfokale Systeme, zu einem Bruchteil der Kosten.

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Lensfree optischen Tomographie ist eine dreidimensionale Mikroskopie-Technik, die eine räumliche Auflösung von &lt;1 um bietet × &lt;1 um x &lt;3 &amp;mgr; m in x-, y-und z-Dimensionen jeweils über einen großen Imaging-Volumen von 15-100...

Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

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Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Erfahren Sie die Lichtscheibenmikroskopie mit einem SPIM-Modul für invertierte Mikroskope zur hochauflösenden Bildgebung dreidimensionaler Zellspheroide. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht präzise Untersuchungen in der Zellbiologie.

Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

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