Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Einebenenbeleuchtungsmikroskopie mit einem Lichtblattanregungsmodul für inverse Mikroskope durchzuführen und auf dreidimensionale Zellsphäroide anzuwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst mit einer Pipette ein Zellsphäroid aus der Vertiefung einer Mikrotiterplatte in eine zweite Vertiefung übertragen wird, um nach dem Waschen zu inkubieren. Das S-Sphäroid wird dann in eine rechteckige Kapillare eingeführt.

Der zweite Schritt besteht darin, das Lichtblattbeleuchtungsmodul an der Grundplatte des inversen Mikroskop-Positioniertisches zu montieren. Als nächstes wird die Kapillare, die das Steroid enthält, in einen speziellen Probenhalter für die Mikroskopie gegeben. Der letzte Schritt besteht darin, die Übereinstimmung zwischen dem Lichtblatt und der Brennebene der Mikroskopobjektivlinse im Detektionspfad einzustellen.

Letztendlich können dreidimensionale Fluoreszenzmessungen durch Variation der Fokusebene innerhalb des Zellsphäroids durchgeführt werden, um Informationen über Einzelbilder oder Zacks über die Aufnahme von Medikamenten oder die Struktur des S-Sphäroids zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Lichtblattmikroskopen besteht darin, dass sie kostengünstig und sehr vielseitig ist, da sie aus einem Modul besteht, das an ein vorhandenes Mikroskop angepasst werden kann und einen großen Freiheitsgrad für die Forschung bietet. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Erforschung von Medikamenten und Wirkstoffen, die für Therapie und Diagnose eingesetzt werden, insbesondere da die Adaption des mikrofluidischen Systems die Untersuchung schneller Prozesse unter Strömungsbedingungen ermöglicht.

Nun kann diese Anregungsmethode in Kombination mit jeder anderen Nachweistechnik Einblicke in lebende Zellsteroide bei niedrigen Lichtdosen geben. Es kann auch auf andere lebende Systeme wie Cipro-Fische, Artial-Embryonen sowie optische CLE-Gewebeproben angewendet werden. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter erhitztes 1,5 Aeros in Nährmedium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und lassen Sie es ein bis zwei Stunden lang erstarren.

Dann säen etwa 150 MCF sieben Brustkrebszellen in jede Vertiefung der vorbereiteten 96-Well-Platte brutto S für fünf bis sieben Tage, bis zu einem Durchmesser von etwa 200 bis 300 Mikrometern in einem Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Als nächstes inkubieren Sie die Zellsteroide mit dem Anthrazyklin-Antibiotikum Doxorubicinhydrochlorid für sechs Stunden in einer Konzentration zwischen zwei Mikromolaren und acht Mikromolaren in Kultur. Medium Nach der Inkubation waschen Sie die OID der Zellen vor der Mikroskopie mit Kultur, Medium oder Earl's Balance Salzlösung.

Verwenden Sie ein inverses Mikroskop und montieren Sie das Einzelebenenbeleuchtungsmikroskopie- oder SPM-Anregungsmodul auf die Grundplatte des Positioniertisches. Statten Sie das Mikroskop mit einer 10-fachen oder 20-fachen Vergrößerung und einem entsprechenden Langpassfilter im Detektionspfad des Mikroskops aus. Montieren Sie dann eine integrierende Kamera an der Detektionsöffnung des Mikroskops.

Verwenden Sie einen parallel sortierten Strahl eines Lasers oder einer Laserdiode mit einer Anregungswellenlänge von vorzugsweise 470 Nanometern und bringen Sie ihn auf das Spin-Modul auf. Drehen Sie als Nächstes die zylindrische Linse um 90 Grad, wodurch das Lichtblatt in eine vertikale Position gebracht wird, um eine axiale Anpassung der Strahltaille des Lichtblatts zu ermöglichen. Legen Sie eine Kapillare mit einer Flüssigkeit mit einem fluoreszierenden Farbstoff in den Probenhalter.

Befestigen Sie den Probenhalter mit der Kapillare am Positioniertisch des Mikroskops. Richten Sie die Position der Kapillare so aus, dass sie zentriert ist und die Strahltaille des Lichtblatts scharf ist. Stellen Sie die Strahltaille durch Variation der axialen Position der Zylinderlinse selbst ein.

Drehen Sie das Objektiv nach der Einstellung zurück. Platzieren Sie das Zellsteroid separat oder in Gruppen innerhalb rechteckiger Bo-Silikatglaskapillaren mit einem inneren Querschnitt von 600 x 600 Mikrometern und einer Wandstärke von 120 Mikrometern. Um dies zu erreichen, nehmen Sie die leere Kapillare mit Daumen und Mittelfinger aufrecht und verschließen Sie die obere Öffnung mit dem Zeigefinger.

Bringen Sie die untere Öffnung in die Nähe des Zellsphäroids in der umgebenden Flüssigkeit, lassen Sie den Zeigefinger aus der oberen Öffnungsflüssigkeit mit dem Steroid frei. Es wird sofort durch Kapillarkräfte eingesaugt. Die Position des S-Sphäroids innerhalb der gefüllten Kapillare wird durch die Schwerkraft eingestellt.

Alternativ können Sie das Steroid durch Pipettieren auf die Kapillare auftragen. Achten Sie darauf, dass die Öffnung der Pipettenspitze einerseits groß genug für die Sphäroidgröße ist und andererseits kleiner oder gleich groß ist wie der Innendurchmesser der Kapillare. Legen Sie anschließend die Kapillare mit dem S-Sphäroid in einen speziellen Probenhalter aus der Mikroskopie.

Befestigen Sie den Probenhalter mit der Kapillare an dem Positioniertisch des Mikroskops und richten Sie die Position des Zellsteroids so aus, dass es zentriert und fokussiert ist. Stellen Sie die Übereinstimmung zwischen dem Lichtblatt und der Brennebene der Mikroskopobjektivlinse im Detektionspfad ein, indem Sie die Position des Reflexionsspiegels und der Zylinderlinse anpassen. Füllen Sie die Kapillare 30 Minuten lang mit fötalem Kälberserum oder FCS, um die spätere zelluläre Adhäsion eines Zellsteroids an der inneren Glasoberfläche zu unterstützen.

Lassen Sie die verbleibende FCS-Beschichtung in der erschöpften Kapillare mindestens 12 Stunden lang trocknen, nachdem Sie das Zellsteroid in die FCS-beschichtete Kapillare eingeführt haben. Lassen Sie die Kapillare wie zuvor weitere zwei bis vier Stunden im Inkubator, um eine zelluläre Adhäsion des Steroids zu bewirken. Als nächstes richten Sie den flx-Teil des mikrofluidischen Systems ein, einschließlich einer Blasenfalle.

Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um den Flx des Schlauchs mit Kulturmedium zu füllen, das den Fluoreszenzfarbstoff enthält. Klemmen Sie zuerst die blasenfreie Kapillare an den Ausblasschlauch und klemmen Sie dann die andere Seite der Kapillare an den Ablaufschlauch. Stellen Sie die Flüssigkeitstemperatur des Wasserbades auf den gewünschten Wert ein.

Stellen Sie dann die Schlauchpumpe auf die gewünschte Pumpengeschwindigkeit ein. Sammeln Sie die gepumpte Flüssigkeit in einem Behälter mit einem offenen Regelkreis für die Datenerfassung und -analyse. Stellen Sie die Laserleistung und die Integrationszeit für die Bildaufnahme ein.

Stellen Sie das Inkrement für den ZS-Stack auf einen Wert zwischen fünf und 10 Mikrometern ein, was für die dreidimensionale Datenanalyse vorzuziehen ist. Da die Dicke der Lichtschicht etwa 10 Mikrometer beträgt, fahren Sie mit der Durchführung von Messungen von Einzelbildern oder Zacks durch Variation der Fokusebene innerhalb des Zellsteroids fort. Gezeigt wird ein Zack-Scan eines mc siebenzelligen Steroids, das zuvor sechs Stunden lang mit achtmikromolarem Doxorubicin inkubiert wurde.

Die Bilder geben detaillierte Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin und dessen Abbau. Das Produkt innerhalb der äußeren Zellschicht des Steroids rot fluoreszierendes Doxorubicin ist hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, während in den inneren Sphe-Roid-Bereichen grün fluoreszierend, das von einem Abbauprodukt abgegeben wird, in der Zellmembran dominant wird. Die Aufnahme des Chemotherapeutikums Doxorubicin in die native mc 7 humane Brustkrebszelle S ist für eine einzelne Zellschicht dargestellt, die mit spm ausgewählt wurde.

Bei Anwendung von zwei Mikromolaren und Kulturmedium innerhalb des Flusssystems nahm die rote und grüne Fluoreszenz von Doxorubicin und seinem Abbauprodukt kontinuierlich zu. Bei Anwendung von zwei mikromolaren Doxorubicin in Kulturmedium innerhalb des Flusssystems nahm die rote und grüne Fluoreszenz von Doxorubicin und seinem Abbauprodukt kontinuierlich zu. Einmal gemeistert, dauert es von der Montage des Lichtblatteliminierungsmoduls bis zur Aufnahme von Fluoreszenzbildern von 3D-Proben nur wenige Minuten. Bei der Messung und den Strömungsbedingungen ist es am wichtigsten, sicherzustellen, dass die Probe an der Innenfläche der Kapillare haftet und zu vermeiden, dass Luftblasen in die Probe gelangen, die sie von der Kapillare lösen könnten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Lichtblattbeleuchtungsmikroskopie mit dem vielseitigen Modul haben, das an verschiedene Mikroskope angepasst werden kann.