Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hocheffiziente Plasmid- und Transfektion von Netzhautzellen zu erreichen, um funktionelle genetische Studien in primären Netzhautkulturen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst Hühnerembryonen im Stadium 27 des Hamburger- und Hamilton-Systems entnommen werden. Eine geeignete Inszenierung ist entscheidend, um eine optimale Effizienz zu erreichen.

Der zweite Schritt besteht darin, die embryonalen Augen zu präparieren und das pigmentierte Epithel der Netzhaut zu entfernen, wodurch die neurale Netzhaut freigelegt wird. Als nächstes wird der Netzhautbecher in eine mit Plasmidlösung gefüllte Kammer gestellt. Anschließend wird es unter optimierten Bedingungen mit Hilfe von einfach zu konstruierenden, speziell angefertigten Elektroden einer Elektroporation unterzogen.

Die letzten Schritte bestehen darin, den Glaskörper und die Linse zu entfernen und die neuronale Netzhaut in einzelne Zellen für die Primärkultur mit geringer Dichte zu dissoziieren. Letztendlich können transfizierte Zellen durch die Expression von Reportergenen oder Immunhistochemie sichtbar gemacht werden, und die effektive genetische Manipulation kann durch die Bewertung der Expression nachgeschalteter Gene und/oder phänotypischer Zellveränderungen bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Lipofektion oder der chemischen Transfektion, besteht darin, dass sie die Transfektionsrate von Netzhautzellen um das Fünffache erhöht, was zu einer Effizienz von 22 bis 25 % der gesamten Zellpopulation führt.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Photorezeptorbiologie zu beantworten, da sie die Manipulation der Genexpression in primären Netzhautkulturen mit einer Effizienz ermöglicht, die biologisch bedeutsame Erkenntnisse liefern kann. Die Auswirkungen dieser Technik gehen über die Grundlagenforschung hinaus, da sie leicht an Hochdurchsatztechnologien für die Arzneimittelentwicklung angepasst werden können. Beginnen Sie damit, befruchtete Hühnereier aus weißem Beinhorn bei 37,5 Grad Celsius und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit fünf Tage lang in einem Eierbrutkasten zu inkubieren.

Besorgen Sie sich vor dem Experiment ein Box-Filament, das normalerweise bei Mikropipettenzügen verwendet wird. Lösen Sie den quadratischen Kasten mit einer Pinzette und richten Sie das Filament zu einem langen Streifen aus. Biegen Sie dann das Filament mit einem Lineal als Führung in eine quadratische U-Form, drei Millimeter lang an der Basis und zwei Millimeter hoch an der einen Seite mit der anderen Seite, die restliche Länge des Filaments verwenden Sie eine Pinzette, um die Elektrode in 96%iges Ethanol zu tauchen und die Elektrode kurz zu flammen, um sie zu sterilisieren.

Befestigen Sie dann ein elektrisches Kabel mit einer kleinen Krokodilklemme an dem langen Arm der Elektrode. Wischen Sie anschließend die dicke Elektrode mit goldener Spitze mit 70 % Ethanol ab. Bereiten Sie dann die Elektroporationskammer vor, indem Sie den Deckel eines sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens mit einer sterilisierten Schere abschneiden und mit Klebeband mit der flachen Seite nach unten auf einer 100-Millimeter-Petrischale befestigen.

Sterilisieren Sie anschließend die Mikrodisetierwerkzeuge, indem Sie die Instrumentenspitzen in 96%iges Ethanol tauchen und kurz abflammen. Wischen Sie außerdem das Präparierskop mit 70 % Ethanol ab. Erwärmen Sie eine Flasche sterile kalzium- und magnesiumfreie Hanks balance Salzlösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Sobald es warm ist, füllen Sie damit eine 100 Millimeter sterile Petrischale, die zu drei Vierteln gefüllt ist. Stellen Sie anschließend die Elektroporationskammer unter ein sauberes Dissektionsmikroskop. Verbinden Sie dann die Elektroden mit dem Elektroporationsgerät und stellen Sie sicher, dass die maßgefertigte Elektrode mit dem Minuspol und die Elektrode mit Goldspitze mit dem Pluspol der Maschine verbunden ist.

Reinigen Sie die Eier, indem Sie die Außenseite der Schalen mit 70% Ethanol abwischen. Seien Sie vorsichtig und bewahren Sie die Sterilität während des restlichen Protokolls. Um zu vermeiden, dass eine Kontamination mit einer großen, gebogenen Maloney-Pinzette in die Kulturen gelangt, öffnen Sie vorsichtig ein Loch in der Eierschale, indem Sie vorsichtig auf die abgerundete Spitze eines Eies direkt über der Luftkammer klopfen.

Ziehe alle Schalenteile mit einer weiteren Pinzette heraus. Entfernen Sie die Membranen und sammeln Sie den Embryo, indem Sie ihn vorsichtig aus der Eizelle schöpfen. Legen Sie den Embryo in eine Petrischale mit der vorgewärmten kalzium- und magnesiumfreien Hanks Balance Salzlösung.

Wenn eine angemessene Anzahl von Embryonen entnommen wurde, stellen Sie sicher, dass sie sich alle im richtigen Stadium befinden. Nach dem Hamburger- und Hamilton-Staging-System für eine optimale Effizienz müssen sich die Embryonen im Stadium 27 befinden. Euthanasieren Sie die Embryonen durch Enthauptung mit einer Maloney-Pinzette und verwenden Sie dann eine Dumont-Pinzette, um die Augen vorsichtig zu entkernen.

Übertragen Sie die Augen in eine neue Petrischale mit kalzium- und magnesiumfreiem HBSS. Beginnen Sie im hinteren Teil jedes Auges in der Nähe des Sehnervenkopfes und führen Sie dann eine Spitze jeder Dumont-Pinzette zwischen die neurale Netzhaut und das pigmentierte Epithel der Netzhaut ein. Arbeiten Sie vom hinteren Teil des Auges nach vorne und verwenden Sie die Pinzette, um das pigmentierte Epithel der Netzhaut vorsichtig zu präparieren.

Seien Sie vorsichtig, um die neuronale Netzhaut nicht zu beschädigen. Richten Sie den Elektroperter so ein, dass er fünf Rechteckimpulse von 15 Volt mit einer Dauer von 50 Millisekunden und einem Intervall von 950 Millisekunden liefert. Füllen Sie anschließend die Elektroporationskammer mit 120 Mikrolitern Plasmidlösung in einer Konzentration von 1,5 Mikrogramm pro Mikroliter in PBS.

Platzieren Sie dann die U-förmige negative Elektrode in der Elektroporationskammer des Mikrozentrifugendeckels. Mit einer gebogenen Dumont-Pinzette. Übertragen Sie einen Netzhautbecher in die Elektroporationskammer und platzieren Sie ihn in der U-förmigen Elektrode.

Positionieren Sie die Netzhaut so, dass der hintere Teil der Netzhaut zum unteren Rand der Elektrode zeigt und die Linse nach oben zeigt. Platzieren Sie als Nächstes die Anode so, dass sie den vorderen Teil des Auges neben der Linse berührt. Benutze dann das Fußpedal des Elektro-Raiders, um fünf elektrische Impulse abzugeben.

Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie den elektroporierten Netzhautbecher in eine neue Petrischale, die mit kalzium- und magnesiumfreiem HBSS gefüllt ist. Wiederholen Sie den Elektroporationsvorgang mit jeder weiteren Netzhautpfanne. Bis zu sechs Netzhautbecher können mit derselben Plasmidlösung elektroporiert werden, ohne dass die Transfektionseffizienz signifikant abnimmt.

Verwenden Sie als Nächstes eine gezahnte Pinzette, um die Linse und den Glaskörper vorsichtig von jeder elektroporierten Probe zu entfernen, während Sie das Auge mit der Rückseite der gebogenen Dumont-Pinzette an Ort und Stelle halten. Sobald Sie entfernt wurden, fahren Sie mit der Dissoziation und Kultur der elektroporierten Netzhautzellen unter Verwendung von Standardtechniken fort. Die hier gezeigten Netzhautzellen wurden mit einer GFP-Expression elektroporiert, plasmidiert, dissoziiert und vier Tage lang kultiviert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigten Feuchtfärbungskerne und GFP-exprimierende Netzhautzellen.

Zur Identifizierung von Photorezeptorzellen wurde eine Anti-Visin-Antikörperfärbung durchgeführt. Die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter wurden optimiert, um nach vier Tagen eine transfekte Effizienz von durchschnittlich 22 % im Vergleich zur Gesamtpopulation zu erzielen. In Kultur steigt diese Messung auf eine durchschnittliche Effizienz von 25 %, wenn nur die Photorezeptorpopulation als einmal beherrscht gilt.

Diese Technik von der Embryonenentnahme bis zur Elektrooperation kann in weniger als 30 Minuten für sechs Augen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass zwischen der Entnahme der Embryonen und der dissoziierten Zellplattierung nicht mehr als drei Stunden vergehen sollten, um eine Kultur von guter Qualität zu erhalten. Diese Technik kann auf die Überexpression oder Korrelation von Genen angewendet werden, z. B. unter Verwendung eines RNAi-Systems.

Darüber hinaus kann Netzhaut, die nach diesem Verfahren transfiziert wurde, für organotypische Netzhautkulturen verwendet werden.