Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der Gefäßpermeabilität zu messen und lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Tiere zunächst für ein Allergen, wie z. B. O-Albumin, sensibilisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Ohren mit einer intradermalen Injektion des Allergens herauszufordern.

Dann wird Evans blauer Farbstoff in die Schwanzvene injiziert. Der letzte Schritt besteht darin, den Farbstoff aus den betroffenen Ohren zu extrahieren, indem sie über Nacht inkubiert werden. In Form von Amid wird die Spektrophotometrie verwendet, um die Menge an Farbstoff zu quantifizieren, die in das Ohr gelangt ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Farbstoffextravasation spektrometrisch gemessen wird. Das bedeutet, dass der Assay nicht so leicht einer Beobachterverzerrung ausgesetzt ist. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da intradermale und Schwanzveneninjektionen technisch anspruchsvoll sind und viel Übung erfordern, um die Kenntnisse zu erlangen.

Beginnen Sie damit, ein Aliquot der Eizellstammlösung zur Verwendung auf Raumtemperatur zu bringen. Bei Raumtemperatur wird der Eizellstock auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in einem XPBS verdünnt. Verwenden Sie ein Fünf-Milliliter-Polystyrolrohr mit rundem Boden.

Wirbeln Sie das Röhrchen bei mittlerer Geschwindigkeit vor und fügen Sie vorsichtig ein gleichmäßiges Volumen gründlich homogenisierter Röhrchen hinzu. Injizieren Sie Alaun tropfenweise in die Eizelllösung. Parallel dazu wird mit der gleichen Technik eine Negativkontrolllösung aus Alaun hergestellt, die in PBS gemischt wurde.

Verschließen Sie dann die Röhrchen und befestigen Sie sie am Wirbel. Lassen Sie den Wirbel eine halbe Stunde lang auf niedrigster Stufe laufen, während die Schläuche angebracht sind. Wenn die Lösungen fertig sind, fahren Sie sofort mit der Sensibilisierung der BAB-Mäuse fort.

Geben Sie die Eizellen-Alaun-Mischung in eine Ein-Milliliter-Spritze. Injizieren Sie dann mit einer 27-Gauge-Nadel 100 Mikroliter in das Peritoneum jeder Maus. Wiederholen Sie dies für die Negativkontrollmäuse mit der Alaunlösung ohne Eizellen in den nächsten drei Wochen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Injektionen pro Maus nach der letzten Injektion und warten Sie mindestens zwei Wochen, bevor Sie den lokalen Anaphylaxie-Assay aus gefrorenem Eizellbestand durchführen. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Arbeitslösung von fünf Milligramm pro Milliliter in PBS. Strudeln Sie es kurz mit 5% ISO Fluor ein.

Betäuben Sie eine sensibilisierte Maus, und wenn sie unbeweglich wird, verringern Sie den ISO-Fluorgehalt auf 3 %Laden Sie nun eine Spritze mit drei 10 Insulinen mit 10 Mikrolitern des Eizellenpräparats, verschließen Sie sie mit einer 31-Gauge-Nadel und laden Sie eine zweite Spritze mit 10 Mikrolitern eines XPBS. Wickeln Sie dann ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit transparentem Klebeband mit der klebrigen Seite nach außen unter ein Präpariermikroskop und befestigen Sie die dorsale Seite des linken Ohrs einer anästhesierten Maus am Röhrchen. Führen Sie die Nadel der PBS-Spritze mit der schrägen Seite nach oben zwischen die beiden Ohrblätter ein und injizieren Sie langsam die vollen 10 Mikroliter

Vermeiden Sie es, Blutgefäße zu treffen. Eine erfolgreiche Injektion führt zu einem offensichtlichen intradermalen Ausrutscher. Es ist wichtig, das gesamte Volumen in das Ohr zu injizieren.

Wenn Flüssigkeit aus der Injektionsstelle austritt, kann das Tier nicht für die Analyse verwendet werden. Auch wenn die Nadel vollständig durch das Ohr geht oder die Oberfläche des Ohrs zerkratzt, ist der Assay ungültig, da dieses Trauma die Ergebnisse im rechten Ohr verfälscht. Verwenden Sie die gleiche Methode, um die Eizellen während des Zeitraums von drei Minuten zu injizieren.

Bringen Sie die Maus in einen Rückhalteapparat und legen Sie sie unter eine Wärmelampe. Injizieren Sie dann langsam 200 Mikroliter 0,5%Evans Blue Farbstoff in die Schwanzvene. Die Verwendung einer 27-Gauge-Nadel kann eine schnelle Injektion schädlich sein, wenn das Gefäß zerstört wird, bevor der gesamte Farbstoff injiziert wurde.

Fahren Sie mit der Injektion auf der gegenüberliegenden Seite des Schwanzes fort. Warten Sie nun 10 Minuten und euthanasieren Sie die Maus dann mit Kohlendioxid, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Sobald das Tier eingeschläfert wurde, verwenden Sie eine Zange und eine Schere, um die Ohren zu entfernen.

Fassen Sie mit der Pinzette den Ohrrand, ohne Druck auf die Injektionsstelle auszuüben. Schneiden Sie dann in der Nähe, aber nicht durch den Knorpelkamm am Ohransatz. Sammeln Sie so viel Gewebe wie möglich.

Unter den richtigen Vorsichtsmaßnahmen aliquotieren Sie nun 700 Mikroliter Formamid für jedes Ohr in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie ein Ohr in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 63 Grad Celsius in einem trockenen Wärmeblock, am nächsten Tag wird der größte Teil des Farbstoffs extrahiert, aber die Ohren können leicht blau erscheinen. Geben Sie 300 Mikroliter jeder Probe in doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte.

Vermeiden Sie das Übertragen von Fell und bilden Sie keine Blasen für Rohlinge. Beladen Sie zwei Vertiefungen mit 300 Mikrolitern Formamid. Messen Sie dann die Absorption bei 620 Nanometern.

Subtrahieren Sie die Werte vom Hintergrund und analysieren Sie die Ergebnisse. PBS-sensibilisierte Tiere reagierten nicht auf die Eizellen- oder PBS-Provokation. Wie erwartet blieben beide Ohren weiß.

In dem Jahr, in dem die PBS-Challenge bei OVAs-sensibilisierten Tieren erhielt, war es entweder vollständig weiß oder leicht blau, lokalisiert an der Injektionsstelle, wo seine Ohren, die die Ova-Challenge erhielten, 10 Minuten nach der Verabreichung des Farbstoffs zunehmend dunkler wurden. Das IDE-behandelte Ohrgewebe der PBS-sensibilisierten Tiere wies sowohl nach der PBS- als auch nach der OVA-Challenge vernachlässigbare Absorptionswerte auf. Bei Eizellen-sensibilisierten Tieren führte die PBS-Injektion im Allgemeinen zu einem mittleren Absorptionswert von 0,13. Umgekehrt führte eine 50-Mikrogramm-Eizellen-Provokation zu einem mittleren Absorptionswert von 0,58.

Die Anzahl der für die Challenge verwendeten Eizellen kann in Grenzen angepasst werden. Zum Beispiel führte eine 20-Mikrogramm-Challenge zu einer mittleren Absorption von 0,30. Eine Herausforderung von weniger als 20 Mikrogramm führte jedoch nicht zu zuverlässigen Ergebnissen.

Obwohl es eine Herausforderung ist, sobald eine Person die intradermalen und intravenösen Injektionen beherrscht, kann diese Technik an einem Tier in etwa 15 Minuten durchgeführt werden, wobei zwei Personen zusammenarbeiten, von denen eine die Ohrinjektionen und die andere die Schwanzveneninjektionen durchführt. Der Eingriff kann an 10 Tieren in etwa einer Stunde durchgeführt werden. Dieser Assay ist sehr vielseitig, da er sowohl für die aktive als auch für die passive kutane Anaphylaxie verwendet werden kann.

Es kann auch für eine Vielzahl von Allergenen verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass Fluor negative Auswirkungen auf das menschliche Fortpflanzungssystem haben kann. Verwenden Sie es nur in einem gut belüfteten Raum und befestigen Sie einen Spülkanister an der Induktionskammer, um das Abgas zu neutralisieren, wenn Sie schwanger sind.

Tragen Sie bei der Verwendung von Isof-Fluor eine Kohlefiltermaske, um die Exposition zu minimieren.