Name: Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Lernen Sie die Messung lokaler Anaphylaxie bei Mäusen durch Bestimmung der Gefäßpermeabilität mit Evans-Blue-Farbstoff und Spektrophotometrie. Diese quantitative Methode ermöglicht präzise Allergieforschung.

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Die Autoren möchten Dr. Ellen M. Fox für ihre Arbeit bezüglich dieses Modells der lokalen Anaphylaxie danken. Diese Arbeit wurde von der Uniformed Services University of the Health Sciences mit der Fördernummer R073UE unterstützt.

1. sensibilisieren Mäuse <ol><li> Vorbereiten eines OVA-Stammlösung durch Verdünnen von OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 20 mg / ml. Einfrieren unten Aliquots in Kryoröhrchen und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung. </li><li> Bringen Sie einen oder mehrere Teilmengen von 20 mg / ml OVA Lager auf Raumtemperatur. Verdünnen OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml in einer 5 ml Polystyrolröhrchen mit rundem Boden einer Kappe. Vortex kurz zu mischen. </li><li> Halten Sie die Polystyrol-Röhrchen mit dem 1 mg / ml OVA auf einem Vortex bei mittlerer Geschwindigkeit eingestellt, das gleiche Volumen von gut homogenisiert Imject Alum (40 mg / ml) tropfenweise, während es das Rohr, um eine 1 zu produzieren vortexen: 1-Verhältnis von Alaun Immunogen. </li><li> Zeigen Kappe auf dem Rohr und Band Rohr Wirbel. Schalten Wirbel auf niedrigster Stufe und lassen OVA zu Alum 30 min zu adsorbieren. <ol><li> Erlauben nicht eine große Menge an Zeit, um zwischen der Vorbereitung OVA / Alum und Sensibilisierung Mäuse passieren. Wenn Sensibilisierung kann nicht direkt nach OVA / Alum Präparate abgeschlossen werdenIonen, speichern OVA / Alum bei Raumtemperatur. Wirbel für 1 min vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Legen Sie eine 1 ml Insulinspritze mit OVA / Alum-Mischung. Verschließen Sie die Spritze mit 27-Gauge-Nadel. </li><li> Injizieren 100 ul OVA / Alum in das Peritoneum von BALB / c-Mäusen eine Dosis pro Maus von 50 ug OVA und 2 mg Alaun. </li><li> Für eine negative Kontrolle, sensibilisieren andere Gruppe von Mäusen, die PBS. Eine 1: 1-Mischung von Alaun und PBS in derselben Weise wie oben aufgeführt, jedoch ohne OVA. </li><li> Sensibilisieren Alle Mäuse (OVA und PBS-Kontrolle) einmal pro Woche für 3 Wochen für insgesamt 3 Injektionen. Nach letzten Injektion warten mindestens 2 Wochen vor der Durchführung der lokalen Anaphylaxie-Assay. </li></ol> 2. Lokale Anaphylaxie Assay <ol><li> Bringen OVA-Stammlösung auf Raumtemperatur. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt 20 mg / ml OVA Lager bis zu einer Endkonzentration von 5 mg / ml mit PBS (1: 4-Verdünnung von OVA in 1X PBS). Vortex kurz zu mischen. </li><li> Betäuben Mäuse mit RC 2 &lt;/ Sup&gt; Nageranästhesiesystem (oder einem vergleichbaren verdampft Liefersystem). Füllen Reservoir mit Isofluran, und schalten Sie O 2 Luftstrom. Ort Mäuse in Induktionskammer und passen Isofluran Steuerregler, um 5% auf Betäubung zu initiieren. Sobald die Mäuse vollständig betäubt, durch einen Mangel an Mobilität angedeutet, stellen Isofluran Steuerregler, um 3% auf tiefe Betäubung erhalten. Der Zweck der Narkose bei diesem Verfahren ist, um das Tier zu immobilisieren. Die Ohr und Schwanzvene Injektionen verursachen keine erhebliche Schmerzen oder Leiden für das Tier. HINWEIS: Isofluran kann negative Auswirkungen auf die menschliche Fortpflanzungssystem. Achten Sie darauf, in einem gut belüfteten Raum verwenden und fügen Sie eine Aufräum Kanister zur Induktionskammer zur Abgas neutralisieren. Wenn Sie bei der Verwendung von Isofluran schwanger sind, tragen eine Maske Kohlefilter, um die Exposition zu minimieren. </li><li> Last 10 ul 5 mg / ml OVA in eine 3/10 cc-Insulinspritze mit einer 31 G Nadel begrenzt. Legen Sie eine weitere 10.3 ccm Insulinspritze mit 10 ul1x PBS. </li><li> Verwendung eines Binokular injizieren 10 ul OVA in das rechte Ohr eines anästhesierten Maus für eine Expositionsdosis von 50 ug OVA. Andere Dosierungen wie 20 ug, sind ebenfalls akzeptabel. <ol><li> , Um die Injektion zu stabilisieren das Ohr, wickeln Klebeband (Klebeseite nach oben) um eine 15 ml konischen Röhrchen. Sichern die dorsale Seite der rechten Ohr auf das Band. Führen Sie die Nadel Kegel Seite nach oben zwischen die beiden Blätter des Ohres. Langsam spritzen OVA in der Mitte des Ohrgewebe, kümmert sich nicht um irgendwelche Blutgefäße betroffen. </li></ol></li><li> Unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen Verfahren injizieren 10 ul PBS in das linke Ohr als negative Kontrolle. </li><li> 3 min warten. <ol><li> Während dieser Zeit, die Maus in einem Restrainer und halten den Schwanz unter einer Wärmelampe oder in einem warmen Wasserbad für 1 min, um die Blutgefäße erweitern. </li></ol></li><li> Verwendung einer 1 ml Insulin-Spritze mit einer 27 G Nadel nach oben begrenzt, langsam injizieren 200 ul 0,5% Evans Blue-Farbstoff in den Schwanz vEin von der Maus. Schnelle Injektion kann die Gefäßstruktur, bevor die gesamte 200 ul zerstören verabreicht wird. Wenn dies geschieht, versucht, das Restvolumen des Farbstoffs in die Vene auf der gegenüberliegenden Seite des Schwanzes injiziert. </li><li> Warten Sie 10 min. </li><li> Euthanize die Maus und entfernen Sie die beiden Ohren mit einer Pinzette und chirurgische Schere. <ol><li> Greifen die Kanten des Ohres mit einer Zange, um sicherzustellen, dass kein Druck auf die Injektionsstelle in der Mitte des Ohrs aufgebracht. Entfernen Sie so viel wie möglich Ohrgewebe durch Schneiden der Nähe, aber nicht durch die Rippe der vorliegenden Knorpel an der Basis des Ohres. Kleine Mengen von Fell kann auf dem ausgeschnittenen Ohr vorhanden sein; Dies hat keine Auswirkungen auf den Test. </li></ol></li><li> Aliquoten 700 ul Formamid in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Bereiten Sie eine Röhre pro Ohr (zwei Röhren pro Maus). HINWEIS: Formamid teratogen, mutagen und reizend. Handschuhe, Schutzbrille und Gesichtsschutz tragen. Schwangere Frauen sollten beim Umgang mit dem Vorsicht verwendens Formamid kann fötotoxischen sein. </li><li> Fügen Ohren zu Formamid, Kappe die Rohre, und Inkubation über Nacht in einem trockenen Wärmebades auf 63 ° C eingestellt. Ohren können noch leicht blau nach Inkubation erscheinen; aber der Großteil des Farbstoffs in die Formamid extrahiert werden. </li><li> Geben Sie 300 ul jeder Probe, in zweifacher Ausfertigung, in eine 96-Well-Platte. Übertragen vermeiden Fell, wenn er in der Probe vorhanden ist. Sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden ist, da sie die Absorptionsmessung beeinflussen. </li><li> Fügen Sie 300 ul Formamid, in zweifacher Ausfertigung an die 96-Well-Platte. Diese Brunnen werden als Rohlinge verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption bei 620 nm messen. Subtrahieren Formamid Brunnen von jeder Probe zu lesen. HINWEIS: Alle Experimente wurden unter Protokolle, die von der Universität uniformierten Diensten Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt geführt. </li></ol>

<ol><li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li>
<li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Allergy+and+Asthma+Reports%22%5BJournal%5D)">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li>
<li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li>
<li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li>
<li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li>
<li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds%3A+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li>
<li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat%2C+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li>
<li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li>
<li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+%28PCA%29+using+a+hand-held+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li>
<li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Zahlreiche Markierungen von allergischen Erkrankungen verwendet werden, um die Stärke der allergischen Reaktionen nach Allergenprovokation, einschließlich Änderungen in der Konzentration von zirkulierendem Histamin, Th2-Cytokin Produktion und Zellrekrutierung in der bronchoalveolären Flüssigkeit in der Umgebung der Atemwegs Herausforderung zu bewerten. Während die Überwachung Änderungen dieser Parameter ist wichtig für die Untersuchung allergischen Reaktionen, biologische Marker nicht immer mit klinischen allergischen E...

Typ-I-Hypersensitivität durch Antigen-induzierte Vernetzung von IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen vermittelt. Dies führt zu zellulären Degranulation und Freisetzung vasoaktiver und proinflammatorische Mediatoren, wie Histamin, Tryptase und Plättchen-aktivierender Faktor 2. Nach der Veröffentlichung der vorgeformten Mediatoren während der Degranulation, Mastzellen zu synthetisieren und frei Prostaglandinen und Leukotrienen, die Gefäßdurchlässigkeit 3 weiter zu erhöhen. Die ersten klinischen Reaktion schnell erfolgt und wird als eine &quot;sofortige Reaktion&quot; bezeichnet. In der Haut, ist eine Quaddel-und-Flare Reaktion innerhalb von Minuten nach Antigenexposition gut sichtbar. In Abhängigkeit von der Dosis der Herausforderung ist es möglich, ein &quot;Spätphasenreaktion&quot; ein paar Stunden später zu beobachten. Spätphase Schwellung ist durch lokalisierte Ödeme und die Rekrutierung von Leukozyten in das Gewebe 2. Histamin, allgemein als der Hauptmediator sein, die anallergische Sofortreaktionen, wirkt auf Histamin-Rezeptor-1 (HR1) bezogen auf die Gefäße und Histamin-Rezeptor-2 (HR2) bezogen auf die glatte Muskulatur. Die kombinierte Wirkung erhöht den Blutfluss und die vaskuläre Permeabilität in der Entzündungsstelle 4. Eine Vielzahl von Tiermodellen für Allergie haben, um die Mechanismen bei allergischen Entzündungen beteiligt, darunter Modelle von allergischem Asthma, systemische Anaphylaxie, und lokale Anaphylaxie studieren entwickelt. Intravenöse Verabreichung Farbstoff verwendet wurde, um lokalisierte allergische Reaktionen in Tiermodellen für fast ein Jahrhundert zu messen, mit Veröffentlichungen, die diese Technik aus dem 1920er Jahren 5. Kaninchen und Meerschweinchen waren die ersten Tiermodelle verwendet werden, um sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen zu testen, und die empfindlichsten Antworten wurden in der Regel im Ohr 5,6 gefunden. Der Test wurde später für den Einsatz in Ratten und Mäusen 7 8 validiert. Historischeine Vielzahl von experimentellen Methoden verwendet worden, einschließlich der Injektion des Antigens vor der Injektion von Farbstoff Injektion von Farbstoff vor der Injektion des Antigens, und gleichzeitiges Einspritzen von Farbstoff und Antigen. Intravenöse Verabreichung Farbstoff als ein Mittel zum Messen allergischen Reaktionen ist ein vielseitiges Assay kann zur Messung aktiv, passiv verwendet werden, und Rückwärts passive Reaktionen 5,9. Zahlreiche Farbstoffe wurden verwendet, um allergische Reaktionen, einschließlich Trypanblau, Pontamine Sky Blue, Evans-Blau, Blau 536 Geigy, und Tusche 5,6,9 bewerten. Eine Lösung von 0,5% Evans-Blau ist derzeit der Standard-Farbstoff zum Messen allergischen Reaktionen in der Haut. Der anaphylaktische Reaktion auf Herausforderung ist vergänglich; maximale Intensität innerhalb von 10 erreicht - 15 min der Farbstoffinjektion, und keine Reaktion ist sichtbar, wenn Farbstoff mehr als 30 min nach der Exposition verabreicht werden, unabhängig von der zugrunde 9 Tiere. Quantifizierung der Farbstoff Extravasation war ursprünglichly erhalten durch Messung Quaddel Größe wie durch den blauen Farbstoff 7-9 angegeben. Zusätzlich können Zählungen degranulierten Mastzellen durch Ausschneiden Hautgewebe von der Stelle der Reaktion und Färbung mit Toluidinblau 7 quantifiziert werden. Mastzelldegranulation wird oft als Marker für Haut, IgE-vermittelten allergischen Reaktionen verwendet werden, wie Mastzellen sind die wichtigsten lokalen Zellpopulation des hochaffinen IgE-Rezeptors FcsRI ausdrückt. Spektrophotometrische Techniken zur Messung Farbstoff Extravasation in das Gewebe wurde für die passive kutane Anaphylaxie (PCA) bei Ratten 10 und der Maus 11 in den 1990er Jahren entwickelt. Die folgenden lokalen Anaphylaxie Assay-Protokoll wurde von Kojima et al angepasst. 1 und nutzt Hühnerei Ovalbumin (OVA) als Antigen für die Auslösung allergischer Reaktionen. Jedoch können andere als OVA-Antigene, wenn gewünscht, verwendet werden. Der Assay verwendet dann Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären permeabilit überwacheny, die durch Zell IgE Vernetzung und Freisetzung von Histamin Mast auftreten.

<table><tbody><tr><td>BALB/c Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Qualität Biologisches</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Vor Gebrauch gründlich mischen</td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>295876</td><td>99%+ Spektrophotometrisches</td></tr><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>1cc Insulinspritzen</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulinspritze mit 31 G Nadel</td><td>Terumo</td><td>NDC 100861</td><td></td></tr><tr><td>27 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>F.S.T.14070-12</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td> Medical <td>Supply Partners</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konische Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC2 Nagetier-Anästhesiesystem</td><td>VetEquip</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Modell G560 mit 3-Zoll-Plattform</td></tr></tbody></table>

mess lokale anaphylaxie bei mäusen

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergische Reaktionen sind das Ergebnis der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und die nachfolgende Freisetzung von vasoaktiven und proinflammatorische Mediatoren. Exposition gegenüber einem Allergen in einem sensibilisierten Individuum kann in der klinischen Symptome, die von leichten Hautrötung bis zu lebensbedrohlichen Anaphylaxie variieren führen. Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt worden, um die Mechanismen, die allergische Reaktionen zu verstehen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Veränderungen der vaskulären Permeabilität, um lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Die lokale Anaphylaxie-Assay wurde in den 1920er Jahren berichtet, und hat sich von der von Kojima et al Technik angepasst. 2007. 1 In diesem Test Mäuse-OVA sensibilisiert sind im linken Ohr mit Vehikel und im rechten Ohr mit OVA in Frage. Dies wird durch eine intravenöse Injektion von Evans Blue-Farbstoff gefolgt. Zehn Minuten nach der Injektion von Evans Blue, wird das Tier getötet und der Farbstoff, der in den Gefäßen hatin den Ohren wird über Nacht in Formamid extrahiert. Die Absorption der extrahierten Farbstoffs wird dann mit einem Spektrophotometer quantifiziert. Diese Methode zuverlässig eine visuelle und quantifizierbare Manifestation einer lokalen allergischen Reaktion.

Tiere, die den Test bestanden haben, müssen Haut und Augen, die blau erscheinen. PBS sensibilisierten Tieren sollte nicht entweder PBS oder OVA Herausforderung reagieren, daher beide Ohren sollten weiß (1A) bleiben. In OVA sensibilisierten Tieren, das Ohr Erhalt der PBS Herausforderung (links) sollte entweder ganz weiß oder in einer lokalisierten Weise an der Injektionsstelle leicht blau. Das Ohr Erhalt der OVA Herausforderung (rechts) sollten schrittweise dunkleres Blau während der 10 Minuten nach der ...

Allergischen Reaktionen, gekennzeichnet durch die Aktivierung von Mastzellen und Basophilen, durch die Quervernetzung von IgE und Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren zurückzuführen. Eine quantitative Beurteilung von allergischen Reaktionen können mit Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären Permeabilität nach Allergenprovokation überwachen erreicht werden.

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der Gefäßpermeabilität zu messen und lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Tiere zunächst für ein Allergen, wie z. B. O-Albumin, sensibilisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Ohren mit einer intradermalen Injektion des Allergens herauszufordern.Dann wird Evans blauer Farbstoff in die Schwanzvene injiziert. Der letzte Schritt besteht darin, den Farbstoff aus den betroffenen Ohren zu extrahieren, indem sie über Nacht inkubiert werden. In Form von Amid wird die Spektrophotometrie verwendet, um die Menge an Farbstoff zu quantifizieren, die in das Ohr gelangt ist.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Farbstoffextravasation spektrometrisch gemessen wird. Das bedeutet, dass der Assay nicht so leicht einer Beobachterverzerrung ausgesetzt ist. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da intradermale und Schwanzveneninjektionen technisch anspruchsvoll sind und viel Übung erfordern, um die Kenntnisse zu erlangen.Beginnen Sie damit, ein Aliquot der Eizellstammlösung zur Verwendung auf Raumtemperatur zu bringen. Bei Raumtemperatur wird der Eizellstock auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in einem XPBS verdünnt. Verwenden Sie ein Fünf-Milliliter-Polystyrolrohr mit rundem Boden.Wirbeln Sie das Röhrchen bei mittlerer Geschwindigkeit vor und fügen Sie vorsichtig ein gleichmäßiges Volumen gründlich homogenisierter Röhrchen hinzu. Injizieren Sie Alaun tropfenweise in die Eizelllösung. Parallel dazu wird mit der gleichen Technik eine Negativkontrolllösung aus Alaun hergestellt, die in PBS gemischt wurde.Verschließen Sie dann die Röhrchen und befestigen Sie sie am Wirbel. Lassen Sie den Wirbel eine halbe Stunde lang auf niedrigster Stufe laufen, während die Schläuche angebracht sind. Wenn die Lösungen fertig sind, fahren Sie sofort mit der Sensibilisierung der BAB-Mäuse fort.Geben Sie die Eizellen-Alaun-Mischung in eine Ein-Milliliter-Spritze. Injizieren Sie dann mit einer 27-Gauge-Nadel 100 Mikroliter in das Peritoneum jeder Maus. Wiederholen Sie dies für die Negativkontrollmäuse mit der Alaunlösung ohne Eizellen in den nächsten drei Wochen.Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Injektionen pro Maus nach der letzten Injektion und warten Sie mindestens zwei Wochen, bevor Sie den lokalen Anaphylaxie-Assay aus gefrorenem Eizellbestand durchführen. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Arbeitslösung von fünf Milligramm pro Milliliter in PBS. Strudeln Sie es kurz mit 5% ISO Fluor ein.Betäuben Sie eine sensibilisierte Maus, und wenn sie unbeweglich wird, verringern Sie den ISO-Fluorgehalt auf 3 %Laden Sie nun eine Spritze mit drei 10 Insulinen mit 10 Mikrolitern des Eizellenpräparats, verschließen Sie sie mit einer 31-Gauge-Nadel und laden Sie eine zweite Spritze mit 10 Mikrolitern eines XPBS. Wickeln Sie dann ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit transparentem Klebeband mit der klebrigen Seite nach außen unter ein Präpariermikroskop und befestigen Sie die dorsale Seite des linken Ohrs einer anästhesierten Maus am Röhrchen. Führen Sie die Nadel der PBS-Spritze mit der schrägen Seite nach oben zwischen die beiden Ohrblätter ein und injizieren Sie langsam die vollen 10 Mikroliter.Vermeiden Sie es, Blutgefäße zu treffen. Eine erfolgreiche Injektion führt zu einem offensichtlichen intradermalen Ausrutscher. Es ist wichtig, das gesamte Volumen in das Ohr zu injizieren.Wenn Flüssigkeit aus der Injektionsstelle austritt, kann das Tier nicht für die Analyse verwendet werden. Auch wenn die Nadel vollständig durch das Ohr geht oder die Oberfläche des Ohrs zerkratzt, ist der Assay ungültig, da dieses Trauma die Ergebnisse im rechten Ohr verfälscht. Verwenden Sie die gleiche Methode, um die Eizellen während des Zeitraums von drei Minuten zu injizieren.Bringen Sie die Maus in einen Rückhalteapparat und legen Sie sie unter eine Wärmelampe. Injizieren Sie dann langsam 200 Mikroliter 0,5%Evans Blue Farbstoff in die Schwanzvene. Die Verwendung einer 27-Gauge-Nadel kann eine schnelle Injektion schädlich sein, wenn das Gefäß zerstört wird, bevor der gesamte Farbstoff injiziert wurde.Fahren Sie mit der Injektion auf der gegenüberliegenden Seite des Schwanzes fort. Warten Sie nun 10 Minuten und euthanasieren Sie die Maus dann mit Kohlendioxid, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Sobald das Tier eingeschläfert wurde, verwenden Sie eine Zange und eine Schere, um die Ohren zu entfernen.Fassen Sie mit der Pinzette den Ohrrand, ohne Druck auf die Injektionsstelle auszuüben. Schneiden Sie dann in der Nähe, aber nicht durch den Knorpelkamm am Ohransatz. Sammeln Sie so viel Gewebe wie möglich.Unter den richtigen Vorsichtsmaßnahmen aliquotieren Sie nun 700 Mikroliter Formamid für jedes Ohr in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie ein Ohr in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 63 Grad Celsius in einem trockenen Wärmeblock, am nächsten Tag wird der größte Teil des Farbstoffs extrahiert, aber die Ohren können leicht blau erscheinen. Geben Sie 300 Mikroliter jeder Probe in doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte.Vermeiden Sie das Übertragen von Fell und bilden Sie keine Blasen für Rohlinge. Beladen Sie zwei Vertiefungen mit 300 Mikrolitern Formamid. Messen Sie dann die Absorption bei 620 Nanometern.Subtrahieren Sie die Werte vom Hintergrund und analysieren Sie die Ergebnisse. PBS-sensibilisierte Tiere reagierten nicht auf die Eizellen- oder PBS-Provokation. Wie erwartet blieben beide Ohren weiß.In dem Jahr, in dem die PBS-Challenge bei OVAs-sensibilisierten Tieren erhielt, war es entweder vollständig weiß oder leicht blau, lokalisiert an der Injektionsstelle, wo seine Ohren, die die Ova-Challenge erhielten, 10 Minuten nach der Verabreichung des Farbstoffs zunehmend dunkler wurden. Das IDE-behandelte Ohrgewebe der PBS-sensibilisierten Tiere wies sowohl nach der PBS- als auch nach der OVA-Challenge vernachlässigbare Absorptionswerte auf. Bei Eizellen-sensibilisierten Tieren führte die PBS-Injektion im Allgemeinen zu einem mittleren Absorptionswert von 0,13. Umgekehrt führte eine 50-Mikrogramm-Eizellen-Provokation zu einem mittleren Absorptionswert von 0,58.Die Anzahl der für die Challenge verwendeten Eizellen kann in Grenzen angepasst werden. Zum Beispiel führte eine 20-Mikrogramm-Challenge zu einer mittleren Absorption von 0,30. Eine Herausforderung von weniger als 20 Mikrogramm führte jedoch nicht zu zuverlässigen Ergebnissen.Obwohl es eine Herausforderung ist, sobald eine Person die intradermalen und intravenösen Injektionen beherrscht, kann diese Technik an einem Tier in etwa 15 Minuten durchgeführt werden, wobei zwei Personen zusammenarbeiten, von denen eine die Ohrinjektionen und die andere die Schwanzveneninjektionen durchführt. Der Eingriff kann an 10 Tieren in etwa einer Stunde durchgeführt werden. Dieser Assay ist sehr vielseitig, da er sowohl für die aktive als auch für die passive kutane Anaphylaxie verwendet werden kann.Es kann auch für eine Vielzahl von Allergenen verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass Fluor negative Auswirkungen auf das menschliche Fortpflanzungssystem haben kann. Verwenden Sie es nur in einem gut belüfteten Raum und befestigen Sie einen Spülkanister an der Induktionskammer, um das Abgas zu neutralisieren, wenn Sie schwanger sind.Tragen Sie bei der Verwendung von Isof-Fluor eine Kohlefiltermaske, um die Exposition zu minimieren.

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Forschung

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Der Verlust des Stellreflexes ist seit langem als ein Standard-Verhaltens Surrogat für Bewusstlosigkeit serviert, auch als Hypnose, bei Labortieren. Änderungen in volatilen Anästhetikums Empfindlichkeit durch pharmakologische Interventionen verursacht werden, können mit einer sorgfältig kontrollierten Hochdurchsatz-Bewertungssystems, die für die Lieferung von inhalativen Therapie angepasst werden können, erkannt werden.

Beurteilung von Veränderungen in volatilen Vollnarkose Empfindlichkeit von Mäusen nach lokalen oder systemischen pharmakologischen Intervention

Elektronische von-Frey-Messungen sind eine effektive und verbesserte Alternative zu klassischen von-Frey-Filamenten, da sie eine schnelle und präzise Messung der Veränderungen der mechanischen Entnahmeschwellen von Nagetieren bei kontinuierlich angelegten Druckreizen vor und nach einem Entzündungsereignis ermöglichen.

Messung von Veränderungen in Taktile Empfindlichkeit in der Hinterpfote von Mäusen unter Verwendung eines elektronischen von Frey Apparat

Beschrieben, ist die Vorbereitung von Antigenen liposomalen Nanopartikeln und ihre Verwendung in anregenden B-Zell Aktivierung in Vitro und in Vivo. Konsistente und robuste Antikörperantworten führte zur Entwicklung eines neuen Modells der Erdnuss-Allergie. Das Protokoll zur Erzeugung von Antigenen Liposomen kann auf verschiedene Antigene und Immunisierung Modelle ausgedehnt werden.

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

Hier präsentieren wir eine neue Methode, um Körper Temperaturunterschiede im passiven systemische Anaphylaxie (PSA) und Lebensmittel Allergie-Maus-Modellen mit Infrarot-Thermometer messen. Dieses Verfahren wurde in früheren PSA Ergebnisse genau dupliziert.

Maus-Körper-Temperaturmessung mit Infrarot-Thermometer während Passive systemische Anaphylaxie und Essen Allergieabklärung

Hier stellen wir drei Methoden zur Beurteilung der Neutrophilenmigration und -infiltration sowohl in vivo als auch in vitro vor. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapeutika zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.

Erkennung von Migration und Infiltration von Neutrophilen bei Mäusen

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.

Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis

Hier beschreiben wir die Methoden zur Induktion einer allergischen Kontaktdermatitis in Mäuseohren durch 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB) und wie der Schweregrad der allergischen Kontaktdermatitis beurteilt werden kann.

Ein Mausohrmodell zur Beurteilung der allergischen Kontaktdermatitis

Lernen Sie die Messung lokaler Anaphylaxie bei Mäusen durch Bestimmung der Gefäßpermeabilität mit Evans-Blue-Farbstoff und Spektrophotometrie. Diese quantitative Methode ermöglicht präzise Allergieforschung.

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

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