Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, integrationsfreie induzierte pluripotente Stammzellen aus einer kleinen Menge peripheren Blutes zu erzeugen. Dies wird durch die Kultivierung isolierter mononukleärer Zellen des peripheren Blutes in definierten Wachstumsfaktoren erreicht, um eine Erythrozyten-Vorläuferpopulation zu erhalten, die sehr gut auf Reprogrammierung reagiert. In einem zweiten Schritt werden nicht-integrierende episomale Plasmide, die Reprogrammierungsgene tragen, durch Nukleoaffektion in die Erythroblasten eingeführt, um den Reprogrammierungsprozess zu initiieren.

Als nächstes werden die vom Zellkern betroffenen Zellen auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Fibroblasten der Maus plattiert, um eine fortgesetzte Reprogrammierung zu ermöglichen, die letztendlich erfolgreich ist. Reprogrammierte induzierte pluripotente Stammzellkolonien können anhand ihrer morphologischen Eigenschaften, der alkalischen Phosphatase-Aktivität, der positiven Immunchemie für Pluripotenzmarker und der Expression endogener Pluripotenzgene identifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Reprogrammierung besteht darin, dass dieses Protokoll eine konsistente Erzeugung von integrationsfreiem IPSC gewährleistet. Das heutige Verfahren wird von Jesse, mir und Gretchen Johnson demonstriert.

Ein Techniker im Labor Beginnen Sie mit der Verdünnung des peripheren Blutes im Verhältnis eins zu eins in DPBS. Schichten Sie dann in einem 15-Milliliter-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden vorsichtig sieben Milliliter des verdünnten Blutes auf drei Milliliter mit Raumtemperatur. Nach einer 30-minütigen Trennung der Probe bei 400 GS und Raumtemperatur hat sich das pbmc in der trüben weißen Grenzschicht zwischen dem Plasma und dem fial high pack abgesetzt.

Übertragen Sie die P-BMCs mit einer sterilen Transferpipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen mit frischem DPBS auf 10 Milliliter. Dann, nachdem Sie die Zellen gezählt haben, übertragen Sie zwei mal 10 zu den sechs P-BMCs in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die restlichen Zellen herunter, frieren Sie die pelletierten Zellen bei einer Konzentration von zweimal 10 auf sechs pbmc pro Milliliter in 90 % fötalem Rinderserum mit 10 % Dimethylsulfoxid ein. Nachdem wir die beiseite gelegten P-BMCs heruntergeschleudert haben, suspendieren wir das Pellet in zwei Millilitern frisch zubereitetem Expansionsmedium und geben es in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte, inkubieren die Zellen in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und 90 % Stickstoff.

Ersetzen Sie dann am dritten und sechsten Tag das Medium, indem Sie die Zellen aus der Vertiefung sammeln. Waschen Sie die Vertiefung mit zwei Millilitern QBSF 60, um alle verbleibenden Zellen aufzufangen, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und reanimation Sie das Pellet in zwei Millilitern frischem Expansionsmedium. Setzen Sie dann die Zellen wieder auf dieselbe 12-Well-Platte zurück und setzen Sie die Inkubation fort. Pipettieren Sie am neunten Tag die Reprogrammierungsplasmide in ein steriles 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen, wie in der Tabelle beschrieben.

Mischen Sie anschließend die Nukleo-Affektionslösung mit den vom Hersteller gelieferten Nahrungsergänzungsmitteln und überführen Sie die Mischung in ein steriles 1,5-Milliliter-DPH-Röhrchen. Geben Sie dann zwei Milliliter Expansionsmedium in eine Vertiefung einer neuen 12-Well-Platte und äquilibrieren Sie das Medium im befeuchteten 37-Grad-Inkubator, bis die Zellen bereit sind. Sammeln Sie die Zellen, waschen Sie die Zellkultur gut, wie gerade gezeigt, und waschen Sie die Zellen in fünf Millilitern DPBS.

Dann reanimation, suspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Nucle Affektion Solution plus Nahrungsergänzungsmittel, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen, und übertragen Sie die Zellsuspension in das Röhrchen mit dem Reprogrammierungsplasmid. Mischen Sie die Zellen, indem Sie einmal auf und ab pipettieren und die gesamte Lösung auf den Boden eines Zellkerns übertragen. Setzen Sie dann den Vete in die Nucle-Krankheitmaschine ein und führen Sie das Programm T 0 1 9 aus.

Geben Sie nun 100 Mikroliter des EQUILIBRIERTEN Expansionsmediums in das Nucle Affection Vete und sammeln Sie sofort die gesamte Probe, vermeiden Sie weiße, schwebende tote Zellreste und legen Sie sie in die Vertiefung des vorgewärmten Mediums. Legen Sie die Zellen dann am 10. oder 11. Tag wieder in den befeuchteten Inkubator. Beschichten Sie jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen mit Gelatine mit einem Milliliter 0,1 % Gelatine in HBSS und legen Sie die Platte dann in den befeuchteten Inkubator oder übertragen Sie mindestens fünf Minuten während der Inkubation ein Fläschchen mit Auftauen, zweimal 10 auf die sechs 3000 Grad Celsius bestrahlten Maus-, Embryonal-, Fibroblasten- oder mes-Medien in 10 Milliliter vorwarmes Meth-Medium. und zentrifugieren Sie dann die Zellen, während sich die Zellen nach unten drehen.

Aspirieren Sie die Gelatinelösung aus der Sechs-Well-Platte und resuspendieren Sie das mes dann in 12 Millilitern frischem Meth-Medium. Geben Sie sofort zwei Milliliter OFMs in jede Vertiefung der mit Gelatine beschichteten Gelatine. Sechs. Platte gut ausschütten und die Platte bis zum 12. Tag wieder in den befeuchteten Inkubator legen.

Sammeln Sie an Tag 12 die vom Zellkern betroffenen Zellen aus der Vertiefung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Vertiefung, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Nach dem Schleudern der Zellen suspendieren wir das Pellet in 12 Millilitern frisch zubereitetem Reprogrammierungsmedium und geben zwei Milliliter Zellen in jede Vertiefung der Feeder-Zellen ab. Zentrifugieren Sie die Platte anschließend in der Sechs-Well-Platte 30 Minuten lang bei 75 GS und Raumtemperatur und setzen Sie die Platte dann wieder in den befeuchteten Inkubator ein, wobei Sie das Medium ein bis zwei Wochen lang jeden zweiten Tag wechseln.

Sobald die induzierbaren pluripotenten Zellkolonien erscheinen, beginnen Sie drei Tage nach der Zellinfektion und vor dem Plattieren mit den Zellen mit frisch vorbereitetem humanem embryonalem Stammzellmedium, das Histon-Deacetylase-Hemmer enthält, die vom Kern betroffenen Zellen auf das induzierbare Meth. Die Effizienz einer erfolgreichen nuklearen Affektion von NU sollte durch Fluoreszenzmikroskopie abgeschätzt werden. Für EGFP ist hier zum Beispiel ein typisches Experiment zur Schädigung von Kernen gezeigt, bei dem etwa fünf bis 10% der gesamten Zellpopulation EGFP-reprogrammierte induzierbare pluripotente Stammzellkolonien exprimieren, die etwa zwei Wochen nach der nuklearen Affektion von NU auftreten. Die Kolonien sind im Allgemeinen kreisförmig mit gut definierten Grenzen und können durch ihre charakteristische Morphologie menschlicher embryonaler Stammzellen identifiziert werden, einschließlich kleiner, dicht gepackter Zellen mit einem hohen Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und sichtbaren Nukleolen der repräsentativen Linien, die vollständig charakterisiert wurden.

Alle Tests positiv auf alkalische Phosphatase-Aktivität exprimieren die Standard-Pluripotenzmarker und reaktivieren endogene Pluripotenzgene Sobald sie gemeistert sind. Diese Technik kann in vier Wochen konsistent integrationsfreies IPSC erzeugen, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können Differenzierungsstudien durchgeführt werden, um Fragen zu jedem Gewebetyp zu beantworten.