Name: Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Erzeugung von iPS-Zellen aus peripherem Blut mittels episomaler Plasmide und HDAC-Inhibitoren. Diese integrationsfreie Methode minimiert das Risiko insertionaler Mutagenese.

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Die Autoren möchten die folgenden Zuschüsse aus dem NIH für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) und K12HL0806406 (SKS); und die JP McCarthy Foundation (AR).

Eine schriftliche Einverständniserklärung, wie sie durch die Institutional Review Boards des Fred Hutchinson Cancer Research Center und die Kinder &quot;s Hospital von Philadelphia genehmigt wurde von Patienten vor dem Sammeln peripheren Blutproben erhalten. Alle institutionellen Richtlinien festgestellt. Alle Tierversuche einschließlich MEF Erzeugung und Teratom Bildung wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Ficoll Separation von PBMCs und Ausbau der Erythroblasten - Tag 0 <ol><li> Verdünnte peripheren Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). In einem 15 ml Rundbodenpolystyrolröhrchen vorsichtig Schicht 7 ml des verdünnten Blutes auf 3 ml Raumtemperatur Ficoll-Hypaque. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 g für 30 min. </li><li> Die PBMCs werden in die Grenzfläche zwischen dem Plasma und dem Ficoll-Hypaque, als trübe weiße Schicht gesehen niedergelassen haben. Mit einer sterilen Transferpipette, sammeln die PBMCs in einem 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie die Lautstärke auf 10 ml mit DPBS. </li><li> Mit einem Hämazytometer, zähle die PBMCs. </li><li> Pipette 2 × 10 6 PBMCs in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Spin-down die restlichen Zellen und Einfrieren bei einer Konzentration von 2 × 10 6 PBMC / ml in 90% fötalem Rinderserum (FBS) / 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Bereiten Expansion Medium: QBSF-60 Serum freiem Medium (vor Licht schützen) + Penicillin / Streptomycin (1%) + Ascorbinsäure (50 ng / ml) + Stammzellfaktor (SCF, 50 ng / ml) + Interleukin 3 (IL 3, 10 ng / ml) + Erythropoietin (EPO, 2 U / ml) + Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + Dexamethason (1 uM; vor Licht schützen; auftauen einem anderen aliquoten Teil jedes Medium ändern). </li><li> Resuspendieren 2 × 10 6 PBMCs in 2 ml frisch zubereitete Expansionsmedium und in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte legen und inkubieren in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2. </li><li> An Tag 3 und Tag 6, ersetzen Medien. <ol><li> Sammeln Sie die Zellen und waschen die gut mit 2 ml QBSF-60, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand. </li><li> Die Zellen in 2 ml neue Expansionsmedium und bringt sie auf den gleichen 12-Well-Platte. </li></ol></li></ol> 2. Reprogrammierung Zellen durch Nucleofection - Tag 9 <ol><li> Pipettieren Sie die Umprogrammierung Plasmide in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (Tabelle 1). </li><li> Mischen Sie die Nukleofektion Lösung mit Supplement (vom Hersteller mitgeliefert) und Pipette in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Pipette 2 ml des Expansionsmediums in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) für die Äquilibrierung vor der Zugabe von Zellen. </li><li> Sammeln Sie diekultivierten Zellen und waschen Sie die gut mit 2 ml QBSF-60, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand. </li><li> Die Zellen werden durch Resuspendieren in 5 ml DPBS und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand. </li><li> Zellpellet in 100 ul Nukleofektion Lösung + Beilage, wobei darauf zu Erzeugen von Blasen zu vermeiden. </li><li> Pipettieren der Zellsuspension in die Röhre, die die Neuprogrammierung Plasmide, Pipette auf und ab sofort, und pipettieren die Probe in den unteren Bereich des Nukleofektion Küvette. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Nukleofektion Maschine und Programm ausführen T-019. </li><li> Übertragen Sie 100 ul der vorgewärmten Expansionsmedium (von der ausgleichenden Platte in Schritt 2.3) in die Nukleofektion Küvette. </li><li> Sofort sammeln Sie das gesamte Probe und Einzahlung in den Brunnen der vorgewärmten Expansionsmedium. Vermeiden Sie das Sammeln der weiß, schwimm toten Zelltrümmer. </li&gt; <li> Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) zu wachsen. </li></ol> 3. Überzug Feeder-Zellen - Tag 10 oder 11 <ol><li> Am Tag 10, Platte Feeder-Zellen. <ol><li> Coat ein 6-Well-Gewebekulturplatte mit Gelatine. <ol><li> Pipette 1 m von 0,1% Gelatine in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) in jede Vertiefung der Platte. </li><li> Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator für mindestens 5 min. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch absaugen Gelatinelösung von der Platte. </li></ol></li><li> Auftauen einer Ampulle von 2 × 10 6 embryonalen Maus-Fibroblasten mit 3000 cGy bestrahlt, in 10 ml vorgewärmtem MEF Medien (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + Penicillin / Streptomycin (1%)). </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand. Die Zellen in 12 ml MEF Medien und Pipette 2 ml inin jeder Vertiefung der mit Gelatine beschichtete 6-Well-Platte. Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2), bis 12. Tag. </li></ol></li></ol> 4. Plattierzellen auf Feeder-Zellen und ändern Medium - Tag 12 <ol><li> Sammeln Sie die nucleofected Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und sammeln Sie alle restlichen Zellen durch Waschen der gut mit 2 ml QBSF-60. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 xg für 5 min. </li><li> Bereiten Reprogrammierung Medium: Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) + FBS (10%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, 1%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + β Mercaptoethanol (0,1 mm) + basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, fügte frisch bei Fütterung, 10 ng / ml) + Ascorbinsäure (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 50 ug / ml). </li><li> Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 12 ml Reprogrammierung Medium. Pipette 2 ml pro Vertiefung der Zellsuspension inder 6-Well-Platte von Feederzellen (wie in Abschnitt 3 hergestellt). Zentrifugieren Sie die Platte bei 50 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) zu wachsen. Ändern Sie die Umprogrammierung Medium jeden zweiten Tag, bis iPSC Kolonien beginnen erscheinen (1-2 Wochen). </li><li> Bereiten hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum Replacement (20%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + NEAA (1%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + Natriumpyruvat (1%) + Natriumbicarbonat (0,12%) + β-Mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (aufgenommen bei frischen Zufuhr, 10 ng / ml) </li><li> Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), suberanilohydroxamic Säure (SAHA, fügte frisch bei Fütterung, 200 Nm). Sobald iPSC Kolonien erscheinen, beginnen Fütterung der Zellen mit hES Medium + HDAC-Inhibitoren, wechselnde Medium jeden Tag. HINWEIS: Sodium Butyrat ist ein kleines Molekül, das in Kunststoffröhrchen adsorbiert ist, therefore speichern sie in einer Borosilikatglas Rohr bei 4 ° C. </li></ol> 5. Isola iPSC Clones <ol><li> Sobald iPSC Kolonien groß genug sind, um isoliert werden (20-25 Zellen), holen sie mit einem P20-Pipette. </li><li> Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), Sacha (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 200 nM) </li><li> Legen Sie die isolierte Kolonien auf iMEFs in einzelnen 35 mm Schalen mit hESC Medium + HDAC-Inhibitoren + Cloning &amp; Recovery Supplement. </li><li> Der Tag nach der Ernte die Kolonien, ändern Sie das Medium, um hESC Medium + HDAC-Inhibitoren. </li><li> Ändern Sie das Medium täglich bis iPSC Kolonien sind bereit für das Passagieren. </li><li> Entfernen HDAC-Inhibitoren aus dem Medium einmal Kolonien Stabilisierung bei Passage 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Für eine erfolgreiche iPSC Generation, wenn Sie dieses Protokoll, gibt es mehrere wichtige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Während der Erythroblasten Ausbaustufe sollte die Medienwechsel Zeitplan strikt eingehalten werden, da Abweichungen können zu einer ineffizienten Stimulation des Zielvorläuferzellpopulation und einer niedrigeren Effizienz iPSC Generation führen. Es ist wichtig, neue Expansionsmedium mit frischem Dexamethason mit jedem Medienwechsel zu machen; und die QBSF-60 Basismedium und Dexam...

iPS-Zellen werden aus somatischen Geweben über ektopische Expression von einem minimalen Satz von Pluripotenz-Gene abgeleitet. Diese Technik wurde ursprünglich von retroviralen Transduktion von humanen Fibroblasten mit OCT4, SOX2, KLF4 und cMYC, die besonders in den pluripotenten Zustand 1 ausgedrückt werden demonstriert. Diese transient exprimiert &quot;Reprogrammierungsfaktoren&quot; alter epigenetische Landschaft und Genexpressionsprofil der Zielzelle analog zu menschlichen embryonalen Stammzellen 2. Einmal erstellt, können iPS-Zellen potenziell in jede Gewebeart zur weiteren Untersuchung differenziert werden. So halten sie versprechen für den Einsatz in der regenerativen Medizin, Krankheitsmodelle und Gentherapieanwendungen. , Stören das Genom mit der Integration von Viren hat jedoch das Potenzial, um die endogene Genexpression beeinflussen zelluläre Phänotyp zu ändern und letztendlich vorspannen wissenschaftlichen Ergebnissen. Darüber hinaus können Zufalls virale Integrationen zu schädlichen Zell e führenUSWIRKUNGEN, einschließlich der Möglichkeit der malignen Transformation 3 oder Wieder Expression der Transgene onkogenen 4. Zukünftige klinische Anwendungen benötigen nicht-integrierenden iPSC Generation. Episomen, die zusätzliche chromosomale zirkuläre DNA-Moleküle sind, bieten eine Strategie, um kostengünstige, Integration freien IPSCs 5 zu erzeugen. Die Kombination von in Tabelle 1 gezeigt episomalen Vektoren auszudrücken das Reprogrammierungsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4, MycL und LIN28A. Die pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-Plasmid enthält auch eine p53 shRNA für temporäre Unterdrückung der TP53 an zelluläre Reprogrammierung 6 verbessern. Die replikationsdefizienten pCXWB-EBNA1-Vektor fördert Amplifikation Reprogrammierungsfaktoren und erhöhte Effizienz Neuprogrammierung durch eine vorübergehende Erhöhung der Expression EBNA1 7. Die pCXLE_EGFP Plasmid kann zum Nukleofektion Gemisch zum Zwecke der dete hinzugefügt werdenrmining die Transfektionseffizienz oder zur Zellsortierung. Mit Ausnahme von p-CXWB EBNA1, die episomalen Plasmiden in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten den Epstein-Barr-Virus Ursprung der viralen Replikation und EBNA1-Gen, das die Replikation und Teilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle 8 zu vermitteln. Die Episomen spontan verlor aufeinander iPSC Expansion 7. Subklonierung und Charakterisierung von iPS-Zellen mit episomalen Vektor Verlust, die aus dem Verlust von eGFP Expression geschlossen werden kann, kann vollständig Integration kostenlos IPSCs für zukünftige klinische Anwendungen führen. Inhärente dem Verfahren iPSC Generation Unterdrückung von linienspezifischen Genen und Reaktivierung von Pluripotenz-assoziierten Genen. Regulation der Genexpression erfolgt auf mehreren Ebenen innerhalb des Ringes, einschließlich Modifikationen an DNA und Chromatin Transkriptionsfaktoren erlauben, regulatorische DNA-Elemente, und die RNA-Polymerase den Zugang zu ZielGene. Umbau des epigenetischen Landschaft über weltweite Chromatinmodifikationen ist eine Schlüsselkomponente erneut Ausdruck der Pluripotenz genetische Programm. Eine spezifische Chromatin Modifikation, bei der Regulation der Genexpression wichtig ist, ist die Acetylierung von Histonen in bestimmten Lysinreste, die den Zugriff ermöglicht, um Gene durch die verringerte Spannung der Histon-DNA Spule Ziel. HDAC-Inhibitoren sind kleine Moleküle, die gezeigt haben, um iPSC Umprogrammierung und hESC Selbsterneuerung 9,10 erweitern, die wahrscheinlich auf die Unterstützung der acetylierten Zustand 11. Die nachfolgend beschriebene Protokoll aus einer früheren Veröffentlichung mit Integration Lentiviren 12 angepasst, bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur optimierten iPSC Generation aus dem peripheren Blut mit Episomen und HDAC-Inhibitoren. Die HDAC-Inhibitor-Konzentrationen werden dabei die Hälfte derjenigen von Ware et al. 9 und routinemäßig in eine 2-fache Zunahme in vollständig umprogrammiert iPSC Kolonien über Standard führtenepisomaler Umprogrammierung Protokolle ohne HDAC-Inhibitoren. Dieses Niveau der Umprogrammierung ist auf Augenhöhe mit der Effizienz beobachten wir mit lentiviralen Methoden. Mit diesem Protokoll haben wir effizient erzeugt iPSC von Einzelpersonen so alt wie 87 Jahre alt.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Store at 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Lagern bei 4 >C.</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Lagern bei -20 & Grad; C bis zur Nötigung. Auftauen, aliquotieren, bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>QBSF-60 serumfreies Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Bei 4 & Grad C lagern.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Lagern bei 4 & Grad.</td></tr><tr><td>Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Bei 4 & Grad C lagern.</td></tr><tr><td>2%ige Gelatinelösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Bei 4 Grad lagern; C, verflüssigen in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Lagern bei 4 & Grad.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Store bei 4 >C.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Lagern bei 4 & Grad.</td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Aliquot, einfrieren bei -20 °C.</td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Bei 4 > C, weg von Licht.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Lagern bei 4 & Grad.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Aliquot, einfrieren bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Bei 4 & °C lagern.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat, 7,5 %</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>10 mg/ml Brühe in DPBS herstellen, aliquotieren, bei -20 °C einfrieren. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Natriumbutyrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Herstellung 2000x Rohmaterial (400 mM) in DPBS, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>hES-Zellklonierung & Regenerationsergänzungsmittel</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Bei -20 > lagern; C bis zur Nötigung. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>ESC-qualifiziertes BD-Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Tauwetter über Nacht auf Eis bei 4 Grad; C, aliquotiert in vorgekühlte Röhrchen mit vorgekühlten Pipettenspitzen. Bei -20 Grad lagern; C bis zur Nötigung. Tauwetter bei 4 Grad; C, sofort verwenden.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Aliquot, einfrieren bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure, pulverisiert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>5 mg/ml Vorrat in DPBS, Sterilfilter, bei 4 μC lagern.</td></tr><tr><td>rekombinanter humaner Stammzellfaktor (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Fabrikat 100 &mu; g/m-Lagerbestand in SFEM, aliquot, eingefroren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Interleukin 3 (IL-3)</td><td>R & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Fabrikat 100 &mu; g/ml Bestand in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Erythropoietin (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Herstellung von 1000 U/ml Rohmaterial in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>rekombinanter humaner insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1)</td><td>R & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Fabrikat 100 &mu; g/ml Bestand in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>1000x (100 mM) in DPBS herstellen.</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Fabrikat 50x Lagerbestand (50 &mu; M) in DPBS, Sterilfilter, bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>SAHA (Vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Herstellung von 2.000x Rohmaterial (400 mM) in DPBS, aliquot, Gefrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>12-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Tisue-Kulturplatten</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische Einwegpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serologische Einwegpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml serologische Einwegpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Pipettenspitzen, Barrierespitzen</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Glas Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgen</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgen</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente ips zellgeneration aus blut mit episomen und hdac-inhibitoren

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die effiziente Erstellung Integration freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus dem peripheren Blut mit episomalen Plasmiden und Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitoren. Die Vorteile dieses Ansatzes sind: (1) die Verwendung einer minimalen Menge von peripherem Blut als Ausgangsmaterial; (2) nonintegrating Umprogrammierung Vektoren; (3) eine kostengünstige Methode zur Erzeugung von Vektor freien iPSCs; (4) einen einzigen Transfektion; und (5) die Verwendung von kleinen Molekülen an epigenetische Neuprogrammierung zu erleichtern. Kurz gesagt, werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von Routine Phlebotomie Proben isoliert und dann in einem definierten Wachstumsfaktoren kultiviert, um eine hoch proliferativen Erythrozytenvorläuferzellpopulation, die bemerkenswert zugänglich Umprogrammierung ergeben. Nonintegrating, nontransmissible episomalen Plasmiden OCT4, SOX2, KLF4, MycL, LIN28A und eine p53 short hairpin (sh) RNA sind Einfühüber eine einzige Nukleofektion in den abgeleiteten Erythroblasten ced. Kotransfektion Episom das Enhanced Green Fluorescent Protein exprimiert (eGFP) ermöglicht die einfache Identifizierung von transfizierten Zellen. Eine separate replikationsdefizienten Plasmid, Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) ebenfalls zu dem Reaktionsgemisch für eine erhöhte Expression von Proteinen episomal zugegeben. Die transfizierten Zellen werden dann auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten (iMEFs) zum fort Umprogrammierung plattiert. Sobald iPSC artige Kolonien erscheinen etwa zwölf Tage nach Nukleofektion, sind HDAC-Inhibitoren zu dem Medium gegeben, um epigenetische Umbau erleichtert. Wir haben gefunden, dass der Einschluss von HDAC-Inhibitoren routine erhöht die Entwicklung vollständig reprogrammiert iPSC Kolonien das 2-fache. Sobald iPSC Kolonien zeigen typischen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Morphologie, sie sanft zu einzelnen IMEF beschichteten Gewebekulturplatten für das weitere Wachstum und die Expansion übertragen werden.

Drei Tage nach Nukleofektion und vor dem Ausplattieren der Zellen auf nucleofected iMEFs sollte die Effizienz der erfolgreichen Nukleofektion durch Fluoreszenzmikroskopie für eGFP geschätzt werden. Figur 1 zeigt einen typischen Nukleofektion Experiment mit etwa 5-10% der Gesamtzellpopulation exprimiert eGFP. Reprogrammed iPSC Kolonien beginnen, etwa zwei Wochen nach Nukleofektion erscheinen. Die Kolonien sind in der Regel kreisförmig mit gut definierten Grenzen und können du...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, integrationsfreie induzierte pluripotente Stammzellen aus einer kleinen Menge peripheren Blutes zu erzeugen. Dies wird durch die Kultivierung isolierter mononukleärer Zellen des peripheren Blutes in definierten Wachstumsfaktoren erreicht, um eine Erythrozyten-Vorläuferpopulation zu erhalten, die sehr gut auf Reprogrammierung reagiert. In einem zweiten Schritt werden nicht-integrierende episomale Plasmide, die Reprogrammierungsgene tragen, durch Nukleoaffektion in die Erythroblasten eingeführt, um den Reprogrammierungsprozess zu initiieren.Als nächstes werden die vom Zellkern betroffenen Zellen auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Fibroblasten der Maus plattiert, um eine fortgesetzte Reprogrammierung zu ermöglichen, die letztendlich erfolgreich ist. Reprogrammierte induzierte pluripotente Stammzellkolonien können anhand ihrer morphologischen Eigenschaften, der alkalischen Phosphatase-Aktivität, der positiven Immunchemie für Pluripotenzmarker und der Expression endogener Pluripotenzgene identifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Reprogrammierung besteht darin, da

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus, ist wohl die günstigste Quelle für große Mengen von Blut aller Wirbellosen. Das Blut ist einfach in der Komposition, mit nur einem Zelltyp in der allgemeinen Zirkulation, die körnige Amöbocyten, und nur drei vorkommenden Proteine ​​im Plasma, Hämocyanin, das C-reaktive Proteine ​​und α2-Makroglobulin. Das Blut wird vom Herzen gesammelt und die Blutzellen und Plasma durch Zentrifugation abgetrennt.

Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Erfahren Sie die effiziente Erzeugung von iPS-Zellen aus peripherem Blut mittels episomaler Plasmide und HDAC-Inhibitoren. Diese integrationsfreie Methode minimiert das Risiko insertionaler Mutagenese.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

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