High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige Kulturen von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen und das Endprodukt mittels Durchflusszytometrie angemessen zu charakterisieren. Um dies zu erreichen, werden qualitativ hochwertige Monolayer-Kulturen aus undifferenzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt. Die Kardiomyogenese wird dann induziert, indem der Windweg mit kleinen Molekülen moduliert wird.

Anschließend werden die Kardiomyozyten fixiert, durchdrungen und unter Bedingungen gefärbt, die für jeden Antikörper spezifisch optimiert sind. Abschließend werden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Kulturen zeigen, die sehr positiv für kardiale Marker, TNNI drei und IRX vier, sind und ventrikuläre ähnliche Aktionspotentiale aufweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. in Mitarbeiter- und Flechtkörpern, besteht darin, dass sie relativ einfach zu implementieren und kostengünstig ist. Darüber hinaus erzeugt die Technik Zellkulturen, die pro kardialem Troponin I sehr positiv sind. Ohne die innere zugrunde liegende Variation und Effizienz, die von anderen Protokollen beobachtet wird, ist eine visuelle Demonstration der Methode von entscheidender Bedeutung, da die Zellqualität vor der Differenzierung die Differenzierungseffizienz erheblich beeinflusst. Auch eine unsachgemäße Fixierung und durchlässig vor der Antikörperfärbung führt zu suboptimalen Durchflusszytometrie-Ergebnissen, was zeigt, dass das Verfahren von Shabo Bachar, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert wird.

Der schwierigste Aspekt des folgenden Verfahrens besteht darin, qualitativ hochwertige, undifferenzierte pluripotente Stammzellen vor der Differenzierung zu erhalten. Die Verwendung von Zellen mit suboptimalen Wachstumseigenschaften wirkt sich erheblich auf die Effizienz der Differenzierung aus. Beginnen Sie dieses Verfahren mit etablierten HPCs, die in sechs gut HESC-qualifizierten, matrixbeschichteten Schalen gezüchtet werden.

Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie eine homogene Morphologie aufweisen. Wenn die Zellen eine neuralepitheliale oder fibroblastenähnliche Morphologie aufweisen, wie hier gezeigt, sollten sie nicht verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Zellen robust proliferieren, wenn sie bei 0,75 Millionen pro Well-Passage sitzen, und zwar etwa alle drei Tage bei 75 %Konfluenzpassage der Zellen mit Dissoziation auf Einzelzellebene mindestens fünfmal vor Beginn der Differenzierung zur Passage

Die Zellen aspirieren zunächst das Wachstumsmedium E 8 und waschen die Zellen zweimal mit vier Millilitern PBS, die auf Raumtemperatur vorgewärmt werden. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Zellablösungslösung bei Raumtemperatur in jede Vertiefung und lassen Sie die Vertiefung ungestört, bis sich die Zellgrenzen zu runden beginnen. Dies dauert in der Regel drei bis sieben Minuten und kann makroskopisch beobachtet und mit dem Mikroskop bestätigt werden.

Anschließend wurden die Zellen mit einer mit Watte verstopften Glaspipette mit einem Kolben gelöst und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter DM EMF 12-Medium überführt. Dadurch wird die Zellablösungslösung inaktiviert. Entnehmen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot der Zelllösung und mischen Sie es mit 10 Mikrolitern Trianblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie dann, das 15 Milliliter konische Röhrchen bei 130 GS für fünf Minuten. Bei Raumtemperatur während der Zentrifugation werden die Zellen mit einem automatisierten Hämozytometer gezählt. Erwarten Sie in Zukunft eine Rentabilität von 70 bis 80 %.

Basieren Sie alle Zellzahlen auf der Gesamtzellzahl und nicht auf der Anzahl lebensfähiger Zellen. Nach dem Schleudern aspirieren Sie das Medium und resuspendieren das Zellpellet in D-M-E-M-F 12 auf eine Endkonzentration von 0,75 mal 10 zu den sechs Zellen pro 500 Mikroliter, fügen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension zu jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu, in der jede Vertiefung zwei Milliliter E 8 Medium enthält. Schütteln Sie die Platte mit einem Gesteinsinhibitor vorsichtig von vorne nach hinten und von einer Seite zur anderen, um die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung zu verteilen.

Geben Sie die Zellen bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius in den Inkubator zurück. 24 Stunden nach dem Verpacken. Beginnen Sie mit dem täglichen Austausch des Mediums mit zwei Millilitern E acht pro Vertiefung ohne Gesteinsinhibitor.

Optimieren Sie die Aussaatdichte, um vor Beginn der Differenzierung eine Konfluenz von 100 % zu erreichen. Am Tag Null sind die Zellen zu 100 % konfluent mit kompakter Morphologie und minimalen Zelltrümmern. Beginnen Sie den Differenzierungsprozess, indem Sie das Medium E acht durch zwei Milliliter Differenzierung ersetzen. Mittel.

Nummer eins, fügen Sie jedem 1,2 Mikroliter CHIR hinzu. Nun, an den Tagen eins und zwei ist es üblich, einen signifikanten Zelltod von 40 bis 50 % zu beobachten. Die anhaftenden Zellen behalten jedoch eine kompakte Morphologie bei.

Während dieser Zeit wird das Medium orange und trüb. Wenn rosafarbenes Medium beobachtet wird, das auf einen übermäßigen Zelltod hinweist, bestätigen Sie die Zellviabilität mit Triam-Blau und brechen Sie es ab, wenn der Zelltod 70 % übersteigt. Andernfalls wiederholen Sie am ersten Tag den Vorgang, das Medium durch zwei Milliliter frische Differenzierung zu ersetzen. Mittel. Nummer eins: Geben Sie 1,2 Mikroliter CHIR in jede Vertiefung und ersetzen Sie es an den Tagen zwei bis drei durch frisches Differenzierungsmedium.

Nummer eins: An den Tagen drei bis vier erholen sich die Zellen und die Dichte nimmt am vierten Tag zu. Ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch eine frische Differenzierung. Medium Nummer eins und ein Mikroliter IWR eins.

An den Tagen fünf bis sechs tritt ein minimaler Zelltod auf und am fünften Tag können dichte Flecken auftreten, die das Medium durch frische Differenzierung ersetzen. Medium Nummer eins, und fügen Sie an Tag sechs bis sieben einen Mikroliter IWR eins in jede Vertiefung hinzu, ersetzen Sie das Medium durch frische Differenzierung. Mittlere Nummer eins.

Am siebten bis achten Tag wird eine konfluente Monoschicht mit kompakter Morphologie erreicht, die mit dichten Flecken durchsetzt ist. Am achten Tag beginnen sich die Zellen spontan zusammenzuziehen und die ersten Kontraktionen sind oft in den dichten Flecken sichtbar. Ersetzen Sie am achten Tag das Medium durch frische Differenzierung. Mittel.

Nummer zwei, ersetzen Sie weiterhin durch das Differenzierungsmedium Nummer zwei, jeden zweiten Tag für die Dauer der Kultur. Am 10. Tag wird eine robustere Kontraktion beobachtet, die sich in den folgenden Tagen in der gesamten Kultur ausbreitet. Dieses Video zeigt die Zellen am Tag 30 und hier sind die Zellen am Tag 55 zu sehen.

Um Zellen für die Durchflusszytometrie zu sammeln, führen Sie die Zelldissoziationsentnahme und -zählung wie zuvor durchgeführt durch. Beachten Sie, dass die Zellen zu diesem Zeitpunkt nicht steril gehalten werden müssen. Während Sie das Zellpellet vorsichtig vortexen, geben Sie tropfenweise 100 Mikroliter Fixierlösung zum Zellpellet

Dann inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie drei Milliliter Zellwaschlösung hinzu, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation nach dem Schleudern, saugen Sie die Lösung während des Vortexens an. Geben Sie 100 Mikroliter durchlässige Lösung wie zuvor tropfenweise zum Zellpellet

Inkubieren Sie das Röhrchen dann 30 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie drei Milliliter Zellwaschlösung hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und aspirieren Sie die Lösung.

Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wäschen nach der Permeation. Die Antikörperfärbung wird wie im Begleitdokument beschrieben mit einer P 1000-Pipette bei 400 Mikrolitern Zellerhaltungslösung auf die Zellen aufgetragen und durch Auf- und Abpipettieren disaggregiert. Befeuchten Sie anschließend eine Kappe des Zellsiebs auf einem Röhrchen mit rundem Boden mit 50 Mikrolitern Zellerhaltungslösung.

Stellen Sie die Röhre auf Eis. Die Kappe des Zellsiebs verhindert, dass Zellaggregate das Durchflusszytometer verstopfen. Übertragen Sie anschließend die Zelllösung in die Kappe des Zellsiebs und lassen Sie die Zellsuspension durch die Schwerkraft abfließen.

Klopfen Sie mit der Unterseite des Röhrchens vorsichtig auf die Tischplatte, so dass die Zellen in einem Röhrchen gesammelt werden. Lege den Schlauch so schnell wie möglich wieder auf Eis. Spülen Sie das Sieb mit 250 Mikrolitern Zellerhaltungslösung, um eine maximale Rückgewinnung der Zellen zu gewährleisten.

Halten Sie die Zellen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden, um die Qualität der erzeugten Kardiomyozyten zu bestimmen. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden die Zellen 10 Tage lang differenziert und mit Antikörpern gegen TNNI drei a, pan Kardiomyozytenmarker, TNNT zwei a quergestreifte Muskelmarker und IRX vier A ventrikuläre Kardiomyozytenmarker gefärbt. Es ist zu beachten, dass die Fixierung und die permeablen Bedingungen für jeden Antikörper optimiert wurden, um den maximalen Prozentsatz positiver Zellen zu erreichen.

Histogramme zeigen, dass 99 % der Gated Cells positiv für TNNI 3 und 96 % für IRX vier waren. Darüber hinaus waren die Zellen sehr positiv für andere Marker der kardialen Differenzierung, darunter TNNT zwei, MLC zwei V und MLC zwei. Es sei darauf hingewiesen, dass die Aussage über die Reinheit der Kardiomyozyten und die Zellidentität auf TNNI drei und IRX vier basiert.

Die Färbung von MC zwei V und MC zwei A ist während der Entwicklung nicht kammerbeschränkt, und TNNT zwei kommt auch in der Skelettmuskulatur vor. Das hier gezeigte Aktionspotenzial wurde von einem einzelnen spontan kontrahierenden Kardiomyozyten am Tag 46 der Differenzierung mittels Ganzzell-Patch-Clamping aufgezeichnet. Das Aktionspotentialprofil deutet darauf hin, dass ventrikuläre ähnliche Kardiomyozyten erhalten wurden.

Ein kleiner Prozentsatz von knotenartigen Profilen wurde ebenfalls beobachtet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man qualitativ hochwertige Kulturen von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen erzeugt und wie man sie durch Durchflusszytometrie charakterisiert. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es häufig schwierig ist, die Stammzellen vor Beginn der Differenzierung als hochwertige Monoschichten zu erhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Fixiermittel gefährlich und persönlich sein kann. Bei dieser Prozedur sollte immer Schutzausrüstung wie ein Laborkittel oder Handschuhe getragen werden.