Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Variationen der Proteinabbauraten systematisch zu bestimmen, indem sie mit der Kinetik des Hefewachstums in Flüssigkulturen gekoppelt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen gezüchtet werden, die ein Reporterprotein exprimieren, das aus einem Abbausignal besteht, das über Nacht in einer stationären Phase in einem geeigneten selektiven Medium an einen Stoffwechselmarker gekoppelt ist. Als nächstes wird die optische Dichte der Zellen gemessen, um die Wachstumskinetik der Zellen zu bestimmen, und dann wird die minimale Verdopplungszeit der Zellen während der logarithmischen Phase aus der Wachstumskinetik unter Verwendung eines dafür vorgesehenen Softwareprogramms berechnet.

Letztendlich kann die berechnete minimale Verdopplungszeit verwendet werden, um Variationen in der Proteinabbaukinetik zu definieren. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Cyclamat- oder Pulse-Chase-Degradations-Assays kommen hinzu: Unsere Technik ist einfach einzurichten. Die Datenerfassung und -analyse ist unkompliziert und das Aufsatzdesign ist äußerst modular.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Topfdegradation zu beantworten, z. B. welche Elemente für die Erkennung von fehlgefalteten Topfen durch das Ubiquitin-Topfsystem erforderlich sind. Ich hatte die Idee zu dieser Methode, als ich ein Screening durchführen wollte, um die Proteine zu identifizieren, die eine Ubiquitin-Entfernung aus ihrer Untergruppe beinhalten. Also habe ich eine einfache Möglichkeit etabliert, mehrere Proben zu vergleichen, um die Zellen für die Analyse vorzubereiten.

Beginnen Sie mit der Transformation der entsprechenden ochsenatrophischen Hefezellen, wie z. B. TRY 4 67, mit einem Plasmid, das eine U-Drei-Deron-Fusion und einen zusätzlichen metabolischen Marker für die Plasmidauswahl und -erhaltung enthält. Für die Plasmidauswahl und -pflege züchten die Zellen auf Agarplatten unter einem geeigneten synthetisch definierten Medium, dem Aminosäure-Selektionsmarker fehlen, überführen überlebende Kolonien in Pflaster, übertragen Zellen aus Pflastern in flüssige Medien und inkubieren über Nacht bei 30 Grad Celsius, bis eine stationäre Phase erreicht ist. Verdünnen Sie dann für 15 Proben oder weniger 50 Mikroliter der Zellen aus der Übernachtkultur mit 150 Mikrolitern synthetischem definiertem Medium pro Well.

Verwenden Sie in einer 96-Well-Platte mit klarem Boden einen Mikroplatten-Reader, um die OD 600-Werte der Proben zu bestimmen. Nach der Berechnung des genauen Volumens, das zur Gewinnung von Hefezellen in einer Menge erforderlich ist, die einem OD 600 von 0,25 entspricht, werden die Zellen eine Minute lang bei 12.000 G und Raumtemperatur heruntergeschleudert, die Zellen in einem Milliliter des entsprechenden selektiven Mediums resuspendiert, um einen OD 600 von 0,25 zu erhalten, und 200 Mikroliter des verdünnten Stammes in eine Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte übertragen, wenn sie größer als 15 sind Es sollen Proben untersucht werden. Übertragen Sie 10 Mikroliter der über Nacht gezüchteten stationären Zellen in eine Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte, die 190 Mikroliter des entsprechenden selektiven Mediums enthält, um die Wachstumskinetik der transformierten Hefezellen unter selektiven Bedingungen zu messen.

Stellen Sie als Nächstes einen Multimode-Mikroplatten-Reader auf eine Inkubationstemperatur von 30 Grad Celsius, OD 600-Messintervalle von 15 Minuten und orbitale und lineare Schüttelzyklen von einer Minute alle sieben Minuten ein. Dann inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius im Microplate Reader für 12 bis 24 Stunden. Wenn die Zellen die stationäre Phase erreicht haben, exportieren Sie die Rohdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei, um die Kinetik des Hefewachstums mit MDT Calc zu bestimmen.

Stellen Sie sicher, dass die Tabellenkalkulationsdatei mit den Wachstumsdaten gespeichert und geschlossen ist. Öffnen Sie dann das Anwendungsprogramm MDT Calc unter Dateipfad. Klicken Sie auf das Rechteck, um die Tabellenkalkulationsdatei unter dem Tabellennamen zu suchen.

Geben Sie unter Startposition den Namen der Tabelle ein, in der sich die Rohdaten befinden. Geben Sie die Koordinate der Zeit in der Tabelle und die Null des ersten Beispiels in die Zeitspalte ein. Geben Sie den Buchstaben ein, der die Position der Zeitpunktspalte in Sekunden definiert. Geben Sie unter leere Spalte den Buchstaben ein, der die Position der leeren Spalte definiert.

Zum Beispiel die A one Well der 96-Well-Platte. Nächster. Wählen Sie unter KB-Wert den minimalen transformierten OD 600-Wert aus, der für die Initiierung der MDT-Berechnung erforderlich ist. In der Regel 0,15 bis 0,25, um sicherzustellen, dass die MDT nur für die Proben berechnet wird, die den definierten D 600-Wert oder höher erreichen.

Nachdem Sie den letzten Wert eingegeben haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Berechnen" und bestätigen Sie, dass der Fortschrittsbalken auf der rechten Seite allmählich grün wird. Exportieren Sie abschließend die beiden Datensätze, die nach Abschluss der MDT-Berechnung automatisch auf dem Bildschirm angezeigt werden, in eine neue Tabelle. Vergewissern Sie sich, dass die Daten den MDT-Wert für jedes Well enthalten, das den Test des minimalen OD-Werts besteht, sowie die Startzeit des Intervalls, aus dem der MDT in diesem repräsentativen Experiment berechnet wurde.

Die relativen Unterschiede in der Kinetik des Proteinabbaus zwischen dem Wildtyp und verschiedenen mutierten Stämmen wurden zunächst verglichen: Wildtyp U, BBC sechs, Delta, UBC sieben, Delta oder DOA 10 Delta-Zellen, die D 1 exprimieren, VMAU drei wurden auf synthetisch definiertem vollständigem Medium gezüchtet. Um dann die Kiemen zu vermessen, wurden die Zellen gewaschen und in synthetischen, definierten Medien inkubiert. Abzüglich Uracil wurden ähnliche Wachstumskurven und berechnete MDT für alle Stämme beobachtet, die in einem synthetisch definierten vollständigen Medium gezüchtet wurden, wobei die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass die Deletion eines der untersuchten Gene das Zellwachstum beeinflusst.

Im Gegensatz dazu führte die Inkubation in synthetischen definierten Medien minus Uracil zu einem schlechten Wachstum von Wildtyp-Zellen, während bei den mutierten Stämmen nur ein geringer Wachstumsdefekt beobachtet wurde. UBC sieben ist für den Abbau von DEG eins VMAU drei zwingend erforderlich, was eine genaue Abschätzung auch der partiellen Effekte verschiedener E zwei Mutanten ermöglicht. Dementsprechend wird eine schnelle Wachstumskinetik in Zellen beobachtet, die UBC seven mit den Mutanten des aktiven Zentrums, C 89 s und N 81, exprimieren, A.In außerdem wurde festgestellt, dass zwei Mutanten, von denen vorhergesagt wurde, dass sie den Abbau von DEG one VMA ETH drei indirekt behindern, V 20 5G und H 90 4K das Zellwachstum im Vergleich zum Wildtyp UBC seven verbessern. wenn auch in geringerem Maße als die Mutanten des aktiven Zentrums.

Somit kann die Kiemenmethode zur genauen Messung des relativen Beitrags verschiedener Degradationsfaktoren zur Stabilität eines Reportersubstrats verwendet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Protokoll empfindlich auf kleine Unterschiede in den Proteinabbauraten reagiert. Dies ist ein Vorteil, bedeutet aber auch, dass bei der Entwicklung und Überprüfung des zu verwendenden Deron nach diesem Verfahren Vorsicht walten muss.

Andere Methoden, wie z.B. die Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Aggregationsneigung von Reporterproteinen. Aus diesem Grund bietet es sich an, auch einen GFP-Tag in den Reporter einzubauen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Veränderungen der Proteinabbaurate systematisch bestimmen können, indem Sie einen MICROPLATE-Reader und unser spezielles Softwareprogramm verwenden.