Name: Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Proteinabbau-Raten systematisch analysieren, indem Sie Hefewachstum in Flüssigkultur nutzen. Diese Methode quantifiziert Proteolyse durch optische Dichtemessungen und minimale Verdopplungszeit-Berechnungen.

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Wir danken Dr. Yuval Reiss und Dr. William Breuer für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Omri Alfassy für die Unterstützung bei der Entwicklung des Ura3-GFP-Screen-Assays. Wir danken auch Dr. M. Hochstrasser und Dr. R. Kulka für die Plasmide und Stämme. Diese Arbeit wurde von der Israelischen Akademie der Wissenschaften (Stipendium 786/08) und von der United States-Israel Binational Scientific Foundation (Stipendium 2011253) finanziert.

1. Zellkultur <ol><li> Transformation der geeigneten auxotrophen Hefe-Zellen, wie Try467 (Tabelle 2), die mit einem Plasmid, enthaltend (a) ein URA3 -degron Fusion und (b) einer zusätzlichen Stoffwechselmarker für Plasmidselektion und Wartung. HINWEIS: Ein Beispiel für ein geeignetes Plasmid ist YDpK-MET25p-deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dies ist eine Hefe integrative Plasmid ein Fusionsprotein bestehend aus deg1 enthält - eine Degron aus der Hefe-Transkriptions abgeleitet. Faktor Mat2 17, FLAG-Epitop - zur Detektion durch Immunoblotting Vma12 - einem stabilen ER-Protein und Ura3 15,18 (Abbildung 3A). (Siehe Tabelle 3 für die Plasmide in dieser Studie und zusätzliche Beispiele für geeignete Plasmide verwendet.) </li><li> Für Plasmid Auswahl und Wartung, halten Zellen in Agar-Platten unter einem geeigneten Kunst Defined (SD) Medium ohne Aminosäure Selektionsmarker <sbis&gt; 19 (beispielsweise deg1 -UV ausgewählt und unter SD-LYS selektiven Medium gehalten). </li><li> Wachsen Zellen O / N bei 30 ° C in einem geeigneten selektiven Medium für SD Plasmids, bis eine stationäre Phase erreicht ist. Wachsen die Zellen in Teströhrchen oder in einer Platte mit 96 Vertiefungen, abhängig von der Anzahl von Proben (Abschnitt 2) untersucht werden. </li></ol> 2. Zellpräparation für Analysis <ol><li> Wenn eine kleine Anzahl von Proben (N≤15) werden untersucht werden, verdünnt, die Zellen und Ersetzen des Mediums wie folgt: <ol><li> Verdünnte 50 ul Zellen aus einem O / N-Kultur mit 150 &amp; mgr; l SD-Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (clear bottom). Beachten, die erste Probe bezeichnet als Leer enthält nur Medium. </li><li> Bestimmen Sie die OD 600 Werte der Proben in der 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader. </li><li> Berechnung des tatsächlichen OD 600 in jeder Vertiefung durch Multiplizieren der OD 600 Lesen durch den Verdünnungsfaktor (x4), von whICH den Wert der Blindwert subtrahiert. Normalisierung der resultierenden Werte durch Dividieren durch 0,55, um eine berechnete Pfadlänge von 1 cm nach dem Beer-Lambert Gesetz erhalten. Hinweis, dieser Wert konstant ist, wenn die Messung der OD 600 von 200 ul der Zellen in einem Standard-96-Well-Platte. </li><li> Berechnet das genaue Volumen zum Erhalten Hefezellen bei äquivalenten Menge bis zu einer OD 600 von 0,25 und sie auf ein Eppendorf-Röhrchen benötigt. </li><li> Spin-down der Zellen bei hoher Geschwindigkeit (12.000 xg) für 1 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen resuspendieren in 1 ml des entsprechenden Selektionsmedium (siehe Abschnitt 3.1), um OD erhalten 600 von 0,25. </li><li> Transfer 200 ul der verdünnten Stämme zu einer neuen Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li></ol></li><li> Wenn eine große Anzahl von Proben (N&gt; 15) getestet werden soll, verdünnt, die Zellen und das Medium ohne vorherige OD 600 Messung ersetzt, wie folgt: <ol><li> Transfer 10 ul stationären Zellengrown O / N in einer 96-Well-Platte in eine neue 96-Well-Platte mit 190 ul (Verdünnung 1:20) der geeigneten selektiven Medien (siehe Abschnitt 3.1). </li></ol></li></ol> 3. Wachstum Kinetics in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL) <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Medien für Wachstum Messungen mit dem Ura3-Degron Reporter: <ol><li> Für positive Kontrollen von Hefe Wachstum unter Nicht restriktiven Bedingungen, die Verwendung Plasmid selektive SD-Medien (siehe Abschnitt 1.2). Wenn keine Plasmid-Selektion erforderlich ist, beispielsweise bei Verwendung eines integrativen Plasmid wie deg1 -UV, SD-Medium, das alle erforderlichen Aminosäuren (SD vollständig) können verwendet werden. </li><li> Für experimentelle Proben Mess Wachstum unter restriktiven Bedingungen, verwenden Sie SD-URA Medium. </li></ol></li><li> Stellen Sie einen Multimode-Mikroplatten-Reader zu:. Einer Inkubationstemperatur von 30 ° C, OD 600 Messintervallen von 15 min und einer Orbital und lineare Schütteln Zyklen von 1 min alle sieben min &lt;br /&gt; Hinweis: Diese Dual-Mode-Schütteln wurde optimiert, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erhalten; jedoch können auch andere Modi Schütteln oder sogar kein Schütteln so gut funktionieren. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 30 ° C in einem Mikroplattenleser O / N oder bis die Zellen die stationäre Phase (12-24 h) erreicht. </li><li> Exportieren Sie die Rohdaten in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li><li> Bestimmen Sie das Wachstum der Hefe Kinetik mit MDTcalc, eine maßgeschneiderte Software, die die minimale Zeit berechnet (in h) für Zellen, ihre Populationsgröße verdoppeln (Minimal Verdopplungszeit (MDT); für Details siehe Abschnitt 4). </li></ol> 4. Berechnung des Minimal-Verdopplungszeit (MDT): Grundsätze der MDTcalc Algorithm HINWEIS: Grundsätze der MDTcalc Algorithmus unter Verwendung einer repräsentativen Auswahl von Try467 Hefezellen (Tabelle 2) in SD-Medium gezüchtet abgeschlossen, sind in Tabelle 1 und Figur 1 dargestellt, die eine Datentabellenkalkulation und Wachstumsgrund, respectiv. <ol><li> Subtrahieren OD 600 Blindwerte in die entsprechende Wanne erhalten wird, von jeder der in der Probenwerte erhalten. Teilen die resultierenden Differenzen von 0,55 (für 96-Well-Platten), um die Lichtpfadlänge zu korrigieren. Zeichnen Sie die endgültigen Werte (Tabelle 1, Trans.) Gegen die Zeit, um die tatsächliche Hefe Wachstumskurve (OD 600 / h) (1A) zu produzieren. </li><li> Log 2 (OD 600) für jeden der transformierten Werten zu berechnen, um die logarithmische Wachstumsphase in eine lineare Kurve (1B) zu konvertieren. </li><li> Berechnen der Steigung einer 10 Zeitpunkte Intervall (N = 10), beginnend bei der Zeit 0 und Bewegen von einem Zeitpunkt, zu einer Zeit, bis N &lt;10 (Tabelle 1, Slope; 1C). </li><li> Berechnung der inversen Wert jeder Steigung, die Zeit für die Zellpopulation erforderlich ist, um doppelt zu erhalten (Tabelle 1, 1 / Steigung; 1C). Berechnen Sie die minimale1 / Slope-Wert, um die MDT (; 1C Tabelle 1, schwarzes Rechteck) zu bestimmen. Entpacken Sie die berechnete MDT für Zellen in der Probe (Tabelle 1, 1 / Slope, schwarzes Rechteck) aus dem gewählten Zeitintervall (Tabelle 1, durch rotes Rechteck skizziert, 1B, 1D). HINWEIS: Die Geschwindigkeit des Zellwachstums auf SD-URA Medium ist umgekehrt proportional zu der MDT. </li></ol> 5. Mit MDTcalc <ol><li> Kopieren Sie die Programmdateien ergänzt in einem bestimmten Ordner auf dem Computer. </li><li> Stellen Sie sicher, das Tabellenkalkulationsdatei, die die Wachstumsdaten gespeichert und geschlossen. Öffnen Sie die MDTcalc Anwendungsprogramm, um den Startbildschirm erscheint sehen. <ol><li> Legen Sie die erforderlichen Informationen, wie in Abbildung 2 gezeigt: <ol><li> Unter &quot;Dateipfad&quot;, klicken Sie auf das Rechteck über das Recht auf die Kalkulationstabelle Datei zu suchen. </li><li> Unter &quot;Blattname&quot;, schreiben die Tabelle Namen, wo ter Rohdaten befindet. </li><li> Unter &#39;Startposition&#39;, legen Sie die Tabellenkalkulation Koordinate Zeitpunkt 0 der ersten Probe. </li><li> Unter &#39;Time Spalte &quot;, legen Sie die Buchstaben die Festlegung des Orts der Zeitpunkt Spalte (Zeit sollte in Sekunden zur Verfügung gestellt werden). </li><li> Unter &#39;Blank Spalte &quot;, legen Sie die Buchstaben definieren die Position der leeren Spalte (in der Regel, aber nicht notwendigerweise in A1 der 96-Well-Platte). </li><li> Unter &#39;OD-Wert &quot;, wählen Sie den minimalen transformiert OD 600-Wert für die Einleitung der MDT Berechnung (in der Regel 0,15-0,25) erforderlich. Wird dieser Wert verhindert Berechnungen der MDT für Kulturen in Lag-Phase wegen zu hoher Verdünnung, so dass MDT ist nur für Proben, die den definierten OD 600-Wert oder höher zu erreichen, berechnet. </li></ol></li><li> Sobald der letzte Wert eingegeben wurde, drücken Sie die &quot;berechnen&quot; -Button am unteren Rand des Bildschirms. Stellen Sie sicher, dass der Fortschrittsbalken auf der rechten Seite allmählich in gReen. Die Kalkulationstabellendatei während des Rechenprozesses nicht öffnen. </li><li> Exportieren der zwei Sätze von Daten, die automatisch auf dem Bildschirm bei der Beendigung der Berechnung MDT in ein Arbeitsblatt angezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Daten enthält: Start (a) die MDT-Wert für jeden gut, dass die minimale OD-Wert-Test (wie in Abschnitt 5.2.1.6 festgelegt) und (b) den Anfangszeitpunkt des Intervalls aus dem die MDT berechnet gibt ( Zeit). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir einen Test auf Basis von Zellwachstum zur Bestimmung der relativen Proteinabbauraten, genannt &#39;Wachstumskinetik in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen &quot;(GIL). Die Gils Assay hat mehrere Vorteile: Es ist einfach einzurichten, Datenerfassung und Analyse ist einfach und es ist extrem modular ist. Folglich GILS können gleichzeitig mehrere Proben in einer benutzerfreundlichen Multi-Well-Plattenformat, die angepasst werden können, um für Anwendungen mit hohem Durchsatz Automatisierung verw...

Das Ubiquitin-Proteasom-Abbausystem ist ein Hauptregulierungs Maschine, die bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein in Eukaryoten beteiligt ist. Der UPS-Konjugate zunächst mehrere Ubiquitin-Moleküle an ein Zielprotein nach der die Poly-Ubiquitin-markierten Protein durch das 26S Proteasom abgebaut. In den meisten Fällen ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Ubiquitin-vermittelten Abbau Substrat Ubiquitinierung von E2 konjugierenden Enzyme und Liga E3-Enzymen (E3 Ligasen) 1. Folglich intrazelluläre Stabilität spezifischer Proteine ​​spiegelt ihre Anfälligkeit für Ubiquitin-Konjugation und die Aktivität ihres zugehörigen Ubiquitinierung Enzyme. E3-Ligasen sind die Hauptsubstraterkennung Komponenten des UPS. Als solche sind diese Enzyme erkennen degrons innerhalb ihrer Substrate, die entweder nicht vorhanden oder nicht in ihrer stabilen Gegen 2 ausgesetzt sind. Zum Beispiel sind viele Regulatoren des Zellzyklus must synthetisiert und in einer zeitlich bestimmten Weise, um die Zellzyklusprogression in Ordnung zu halten abgebaut werden. Der Abbau dieser Proteine ​​wird häufig durch Phosphorylierung gesteuert durch zelluläre Signale regulierte Kinasen 3,4 vermittelt. Auf der anderen Seite, sind aberrant-gefaltete Proteine ​​durch kryptische degrons anerkannt. Dies sind Bereiche, die normalerweise in der nativen Struktur verborgen sind und werden beim Aufbau Störung ausgesetzt. Solche degrons gehören hydrophoben Domänen 5-7 und intrinsisch ungeordneten Segmente 8. Da der Samen Entdeckung des Ubiquitin-Proteinabbau und Charakterisierung der Grundlagen in Retikulozyten-Lysaten 9 war Hefegenetik an der Entdeckung von vielen der Komponenten des Ubiquitin-Systems 10. Der Erfolg von Hefe als Modellorganismus für die systematische Analyse von Proteinabbau durch die USV ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass die USV ist hochly konserviert in allen Eukaryoten 4, verbunden mit ihrer Zugänglichkeit als Versuchssystem. Tatsächlich werden auf Hefe basierenden Systemen üblicherweise verwendet, um die Wirkmechanismen der Ubiquitinierung Maschinen entziffern. Studieren Proteinabbau durch biochemische Mittel erfordert in der Regel Herstellung von Zellextrakten. Während tierische Zellproteinen kann unter relativ milden Bedingungen, die Proteinwechselwirkungen und Funktion zu erhalten extrahiert werden, das Vorhandensein eines robusten Zellwand der Hefe 11 benötigt deutlich härteren Bedingungen, die Störung der Proteingewinnung beeinflussen können. Tatsächlich unterschiedliche Verfahren für Hefe Zellaufschluss variieren erheblich in ihrer Fähigkeit, intakte Proteine ​​in Mengen, die ihre relative Zellüberfluss korrekt darstellen zu erholen. Weitere Ungenauigkeit ist inhärent in den verschiedenen zur Bestimmung Abbauraten von spezifischen Proteinen angewandten Methoden: Metabolische Markierung basierten &#39;Pulse-Chase-Experimente, gefolgt von immunoprecipitation, um spezifische Proteine ​​12 zu isolieren, ist häufig nicht streng quantitativ. Somit wird, wenn Proteinabbau wird durch dieses Verfahren im Vergleich, extra Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse geboten. Um diesen Nachteil zu umgehen, kann eine alternative Cycloheximid (CHX) chase Assay verwendet werden 12. In diesem Assay wird die Übersetzung Inhibitor-Zellkulturen und zeitlichen Veränderungen der Protein stationären Ebenen hinzugefügt werden anschließend überwacht. Dennoch ist die Verwendung von CHX Proteine ​​mit relativ kurzen Halbwertszeiten (&lt;90 min), als langfristige Hemmung der Proteinsynthese ist zytotoxisch beschränkt. Bemerkenswert ist, beide der oben genannten Tests erfordern die Verwendung von Protein-spezifischen Antikörpern, die nicht immer verfügbar sind. Um diese technischen Einschränkungen zu überwinden, haben die Forscher mehrere Ansätze, die nicht Zellextraktion und direkte Protein Handhabung erfordern entwickelt. Ein Ansatz basiert auf der Einrichtung von auxotrophen yea basiertst Stämme, durch die Deletion von Genen wesentlichen metabolischen Enzyme codieren, erhalten werden. Solche Gene umfassen HIS3, LEU2, LYS2 und TRP1, kodierend für Enzyme, die für die Aminosäure-Biosynthese erforderlich ist, als auch URA3, die OMP-Decarboxylase codiert (Ura3), ein essentielles Enzym der Pyrimidin-Biosynthese Ribonukleotid. Ura3 wurde vielfach in der Proteinabbaustudien eingesetzt. In diesen Assays rettet konstitutive Expression Ura3 Wachstum von Zellen in ura3 Uracil-Mangelmedium 13. Folglich Destabilisierung Ura3 durch die Fusion einer Degron kann das Zellwachstum auf Minimalmedium ohne Uracil verringern. Diese Methode wurde in verschiedenen Proteinabbaustudien eingesetzt, einschließlich der Festlegung von Abbaufaktoren 5, E3 Ligasen 14 und Hilfs Ubiquitinierung Faktoren 15 und die Entdeckung von neuen USV degrons 16. Alle diese Verfahren verwendet das Zellwachstum auf Agarplatten als Testanzeige. Jedoch ter Wachstumskriterium (positive / negative Wachstum), während robuste und effiziente, ist meist qualitative und nicht quantitative Informationen, die wichtig für die Bewertung Potenz eines Degron oder den relativen Beitrag der verschiedenen Hilfsabbaufaktoren ist. Wir haben daher entwickelt und verwendet Hefevektoren und Screeningverfahren zur systematischen und quantitativen Analyse der Proteinabbau durch das URA3 -degron Fusionssystem. Das Protokoll basiert auf einer einfach zu handhabenden Test, der Wachstumskinetik misst in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL) und auf der Erzeugung von Standardwachstumskurven. Lag die exponentielle (log) und der stationären Phase - Hefe Wachstumskinetik werden durch drei Hauptphasen gekennzeichnet. Berechnung der Hefe-Replikations Kinetik während der log-Phase unter selektiven Bedingungen, die durch die Höhe der Expression des URA3-Degron bestimmt wird, liefert eine objektive quantitative Messung of Proteinabbau. Dieses Verfahren kann zum Messen und Vergleichen Abbauraten von mehreren UPS Substrate gleichzeitig in mehrere Stämme und unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Difco Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>Für das Hefewachstum auf SD-Minimalmedien. Zu liefernde Aminosäuren sind: Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Aminosäuren</td><td>Höchste Reinheit verfügbar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Jede andere kompatible Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Cyclohexamid&nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Arbeitskonzentration 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO Serie</td><td>Tecan</td><td></td><td>Für Hefeinkubation und OD600 Messungen. Jedes andere kompatible tempgesteuerte Lesegerät kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>Experimentelle Software</td></tr></tbody></table>

reporter-basierten wachstumstest für die systematische analyse von proteinabbau

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für Proteinhomöostase in allen Eukaryonten. Die Standardmethode zur Bestimmung der intrazellulären Proteinabbaus beruht auf biochemischen Assays für folgende die Kinetik der Proteinniedergang. Solche Verfahren sind oft umständlich und zeitaufwendig und daher nicht zugänglich sind Versuche zur Beurteilung mehrere Substrate und Abbaubedingungen ab. Als Alternative wurden Zellwachstum basierenden Assays entwickelt worden, die sich in ihrer herkömmlichen Format Endpunktassays, die nicht quantitativ relativen Veränderungen in der Proteinspiegel zu bestimmen können. Hier beschreiben wir eine Methode, die originalgetreu bestimmt Veränderungen in der Proteinabbauraten durch Kopplung an Hefezelle-Wachstumskinetik. Das Verfahren basiert auf einem System, in dem festgelegten Auswahl Uracil-Auxotrophie des URA3 -deleted Hefezellen durch eine exogen exprimierten Reporterproteins gerettet basierend, Einer Fusion zwischen dem wesentlichen URA3-Gen und einem Abbau Determinante (Degron) besteht. Das Reporterprotein ist so ausgelegt, dass ihre Syntheserate konstant ist, während seine Abbaurate wird durch die Degron bestimmt. Zellwachstum in Uracil-defizientem Medium proportional zu der relativen Pegel Ura3 sind Wachstumskinetik völlig abhängig von der Reporter-Protein-Abbau. Diese Methode misst genau Veränderungen der intrazellulären Proteinabbau Kinetik. (A) Die Beurteilung der relative Beitrag der bekannten Ubiquitinkonjugierenden Faktoren Proteolyse (b) E2 konjugierende Enzym Struktur-Funktions-Analysen (c) Identifizierung und Charakterisierung von neuen degrons: Es wurde angewandt. Anwendung des degron- URA3 -basierten System überwindet die Abbaufeld Protein, wie es auch zur Überwachung von Veränderungen der Proteinspiegel mit Funktionen der anderen zellulären Wege angepasst zu werden.

Untersuchung der Rolle der Enzyme der Doa10 Weg zum Abbau eines Reportersubstrat Um die Gültigkeit der GIL Verfahren wurde mit einem herkömmlichen Assay Abbau verglichen zu testen. Dieses Experiment beurteilt die relativen Beitrag der Komponenten der ER-Membran lokalisiert Doa10 E3-Ligase-Komplex 20,21 zum Abbau des Proteins Qualitätskontrolle Reportersubstrat Deg1- VU (3A). Die Deg1- VU Plasmid wurde in Wildtyp-Zellen o...

Hier beschreiben wir einen robusten biologischen Assay zur Quantifizierung der relativen Rate der Proteolyse durch das Ubiquitin-Proteasom-System. Die Assay-Auslesung ist die Hefewachstumsrate in Flüssigkulturen, die von den zellulären Konzentrationen eines Reporterproteins abhängt, das ein Abbausignal enthält, das mit einem essentiellen Stoffwechselmarker fusioniert ist.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Variationen der Proteinabbauraten systematisch zu bestimmen, indem sie mit der Kinetik des Hefewachstums in Flüssigkulturen gekoppelt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen gezüchtet werden, die ein Reporterprotein exprimieren, das aus einem Abbausignal besteht, das über Nacht in einer stationären Phase in einem geeigneten selektiven Medium an einen Stoffwechselmarker gekoppelt ist. Als nächstes wird die optische Dichte der Zellen gemessen, um die Wachstumskinetik der Zellen zu bestimmen, und dann wird die minimale Verdopplungszeit der Zellen während der logarithmischen Phase aus der Wachstumskinetik unter Verwendung eines dafür vorgesehenen Softwareprogramms berechnet.Letztendlich kann die berechnete minimale Verdopplungszeit verwendet werden, um Variationen in der Proteinabbaukinetik zu definieren. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Cyclamat- oder Pulse-Chase-Degradations-Assays kommen hinzu: Unsere Technik ist einfach einzurichten. Die Datenerfassung und -analyse ist unkompliziert und das Aufsatzdesign ist äußerst modular.Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Topfdegradation zu beantworten, z. B. welche Elemente für die Erkennung von fehlgefalteten Topfen durch das Ubiquitin-Topfsystem erforderlich sind. Ich hatte die Idee zu dieser Methode, als ich ein Screening durchführen wollte, um die Proteine zu identifizieren, die eine Ubiquitin-Entfernung aus ihrer Untergruppe beinhalten. Also habe ich eine einfache Möglichkeit etabliert, mehrere Proben zu vergleichen, um die Zellen für die Analyse vorzubereiten.Beginnen Sie mit der Transformation der entsprechenden ochsenatrophischen Hefezellen, wie z. B. TRY 4 67, mit einem Plasmid, das eine U-Drei-Deron-Fusion und einen zusätzlichen metabolischen Marker für die Plasmidauswahl und -erhaltung enthält. Für die Plasmidauswahl und -pflege züchten die Zellen auf Agarplatten unter einem geeigneten synthetisch definierten Medium, dem Aminosäure-Selektionsmarker fehlen, überführen überlebende Kolonien in Pflaster, übertragen Zellen aus Pflastern in flüssige Medien und inkubieren über Nacht bei 30 Grad Celsius, bis eine stationäre Phase erreicht ist. Verdünnen Sie dann für 15 Proben oder weniger 50 Mikroliter der Zellen aus der Übernachtkultur mit 150 Mikrolitern synthetischem definiertem Medium pro Well.Verwenden Sie in einer 96-Well-Platte mit klarem Boden einen Mikroplatten-Reader, um die OD 600-Werte der Proben zu bestimmen. Nach der Berechnung des genauen Volumens, das zur Gewinnung von Hefezellen in einer Menge erforderlich ist, die einem OD 600 von 0,25 entspricht, werden die Zellen eine Minute lang bei 12.000 G und Raumtemperatur heruntergeschleudert, die Zellen in einem Milliliter des entsprechenden selektiven Mediums resuspendiert, um einen OD 600 von 0,25 zu erhalten, und 200 Mikroliter des verdünnten Stammes in eine Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte übertragen, wenn sie größer als 15 sind Es sollen Proben untersucht werden. Übertragen Sie 10 Mikroliter der über Nacht gezüchteten stationären Zellen in eine Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte, die 190 Mikroliter des entsprechenden selektiven Mediums enthält, um die Wachstumskinetik der transformierten Hefezellen unter selektiven Bedingungen zu messen.Stellen Sie als Nächstes einen Multimode-Mikroplatten-Reader auf eine Inkubationstemperatur von 30 Grad Celsius, OD 600-Messintervalle von 15 Minuten und orbitale und lineare Schüttelzyklen von einer Minute alle sieben Minuten ein. Dann inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius im Microplate Reader für 12 bis 24 Stunden. Wenn die Zellen die stationäre Phase erreicht haben, exportieren Sie die Rohdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei, um die Kinetik des Hefewachstums mit MDT Calc zu bestimmen.Stellen Sie sicher, dass die Tabellenkalkulationsdatei mit den Wachstumsdaten gespeichert und geschlossen ist. Öffnen Sie dann das Anwendungsprogramm MDT Calc unter Dateipfad. Klicken Sie auf das Rechteck, um die Tabellenkalkulationsdatei unter dem Tabellennamen zu suchen.Geben Sie unter Startposition den Namen der Tabelle ein, in der sich die Rohdaten befinden. Geben Sie die Koordinate der Zeit in der Tabelle und die Null des ersten Beispiels in die Zeitspalte ein. Geben Sie den Buchstaben ein, der die Position der Zeitpunktspalte in Sekunden definiert. Geben Sie unter leere Spalte den Buchstaben ein, der die Position der leeren Spalte definiert.Zum Beispiel die A one Well der 96-Well-Platte. Nächster. Wählen Sie unter KB-Wert den minimalen transformierten OD 600-Wert aus, der für die Initiierung der MDT-Berechnung erforderlich ist. In der Regel 0,15 bis 0,25, um sicherzustellen, dass die MDT nur für die Proben berechnet wird, die den definierten D 600-Wert oder höher erreichen.Nachdem Sie den letzten Wert eingegeben haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Berechnen" und bestätigen Sie, dass der Fortschrittsbalken auf der rechten Seite allmählich grün wird. Exportieren Sie abschließend die beiden Datensätze, die nach Abschluss der MDT-Berechnung automatisch auf dem Bildschirm angezeigt werden, in eine neue Tabelle. Vergewissern Sie sich, dass die Daten den MDT-Wert für jedes Well enthalten, das den Test des minimalen OD-Werts besteht, sowie die Startzeit des Intervalls, aus dem der MDT in diesem repräsentativen Experiment berechnet wurde.Die relativen Unterschiede in der Kinetik des Proteinabbaus zwischen dem Wildtyp und verschiedenen mutierten Stämmen wurden zunächst verglichen: Wildtyp U, BBC sechs, Delta, UBC sieben, Delta oder DOA 10 Delta-Zellen, die D 1 exprimieren, VMAU drei wurden auf synthetisch definiertem vollständigem Medium gezüchtet. Um dann die Kiemen zu vermessen, wurden die Zellen gewaschen und in synthetischen, definierten Medien inkubiert. Abzüglich Uracil wurden ähnliche Wachstumskurven und berechnete MDT für alle Stämme beobachtet, die in einem synthetisch definierten vollständigen Medium gezüchtet wurden, wobei die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass die Deletion eines der untersuchten Gene das Zellwachstum beeinflusst.Im Gegensatz dazu führte die Inkubation in synthetischen definierten Medien minus Uracil zu einem schlechten Wachstum von Wildtyp-Zellen, während bei den mutierten Stämmen nur ein geringer Wachstumsdefekt beobachtet wurde. UBC sieben ist für den Abbau von DEG eins VMAU drei zwingend erforderlich, was eine genaue Abschätzung auch der partiellen Effekte verschiedener E zwei Mutanten ermöglicht. Dementsprechend wird eine schnelle Wachstumskinetik in Zellen beobachtet, die UBC seven mit den Mutanten des aktiven Zentrums, C 89 s und N 81, exprimieren, A.In außerdem wurde festgestellt, dass zwei Mutanten, von denen vorhergesagt wurde, dass sie den Abbau von DEG one VMA ETH drei indirekt behindern, V 20 5G und H 90 4K das Zellwachstum im Vergleich zum Wildtyp UBC seven verbessern. wenn auch in geringerem Maße als die Mutanten des aktiven Zentrums.Somit kann die Kiemenmethode zur genauen Messung des relativen Beitrags verschiedener Degradationsfaktoren zur Stabilität eines Reportersubstrats verwendet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Protokoll empfindlich auf kleine Unterschiede in den Proteinabbauraten reagiert. Dies ist ein Vorteil, bedeutet aber auch, dass bei der Entwicklung und Überprüfung des zu verwendenden Deron nach diesem Verfahren Vorsicht walten muss.Andere Methoden, wie z.B. die Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Aggregationsneigung von Reporterproteinen. Aus diesem Grund bietet es sich an, auch einen GFP-Tag in den Reporter einzubauen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Veränderungen der Proteinabbaurate systematisch bestimmen können, indem Sie einen MICROPLATE-Reader und unser spezielles Softwareprogramm verwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen zu überwachen beschrieben. A Degron-destabilisierten GFP-(GFP-DGN) und eine stabile GFP-dgnFS Fusionsprotein erzeugt und transduziert in die Zelle mit einem lentiviralen Expressionsvektor. Diese Technik ermöglicht eine stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS exprimierenden Zelllinie, in dem Ubiquitin-Proteasom-Aktivität leicht beurteilt werden kann, mit Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie generieren.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

In diesem Video demonstrieren wir einen zellbasierten Proteinaggregationsassay mit Proteasom-Inhibitoren, die die Proteasomaktivität blockieren und verhindern, dass fehlgefaltete, mutierte Proteine, die mit einer fluoreszierenden Markierung fusioniert sind, einen Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau durchlaufen, was zu ihrer Akkumulation im Zellzytoplasma führt. Anschließend werden die Proteinaggregate mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und quantifiziert.

Protein Aggregate Formation Assay: Eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation in kultivierten Zellen nach Induktion durch Proteasom-Inhibitoren

Dieses Video beschreibt einen Abbauassay für fehlgefaltete Proteine mittels Cycloheximid-Behandlung zusammen mit Detergenzfraktionierung. Diese Methode hilft dabei, die Dynamik fehlgefalteter Proteine zu untersuchen und die tiefgreifenden Mechanismen des Proteinumsatzes aufzudecken.

Assay für den Abbau von fehlgefalteten Proteinen: Eine Technik zur Überwachung des Abbaus fehlgefalteter Proteine mittels Cycloheximid-Behandlung und Detergenzfraktionierung

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Der genetische Reporter-Assay ist ein gut etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug, um die Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und ihren genregulatorischen Aktivitäten zu entschlüsseln. Die Kopplung von regulatorischen Elementkandidaten an Reportergene, die identifizierende Sequenz-Tags tragen, ermöglicht eine massive Parallelisierung dieser Assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieser Bericht beschreibt Protokolle zur Messung der Abbauraten von fehlgefalteten Proteinen entweder durch Western Blot oder fluoreszenzbasierte Assays. Die Methoden können für die Analyse anderer fehlgefalteter Proteine und für das Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Bestimmen von Protein in einzelne lebende adhärente Zellen, Halbwertszeiten mit Puls Kennzeichnung und Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung von Fusionsproteinen SNAP-Tag.

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Dieses Protokoll beschreibt den quantitativen lumineszierenden Nachweis der Proteinabbaukinetik in lebenden Zellen, die unter Verwendung von CRISPR/Cas9 entwickelt wurden, um Antikörper freies endogenes Protein-Detektions-Tag zu exprimieren, das mit einem Zielprotein fusioniert ist. Detaillierte Anweisungen zum Berechnen und Abrufen der quantitativen Abbauparameter, Rate, Dmax, DC 50 und Dmax50 sind enthalten.

Hochdurchsatz-Zellprofilierung gezielter Proteinabbauverbindungen mit HiBiT-CRISPR-Zelllinien

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Erfahren Sie, wie Sie Proteinabbau-Raten systematisch analysieren, indem Sie Hefewachstum in Flüssigkultur nutzen. Diese Methode quantifiziert Proteolyse durch optische Dichtemessungen und minimale Verdopplungszeit-Berechnungen.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

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