Name: Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie retrovirale Infektion von embryonalen Stammzellen die hämatopoetische Differenzierung beeinflusst. Diese Methode nutzt Hanging-Drop-Kultur und Durchflusszytometrie zur Analyse.

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Diese Arbeit wurde durch ein Pilotprojekt und Feasibility Grants des Indiana University School of Medicine Center (IUSM) for Excellence in Molecular Hematology (NIDDK, 5P30DK090948) unterstützt. Zusätzliche Mittel wurden durch einen Biomedical Enhancement Grant des IUSM bereitgestellt. Wir danken Dr. Karen Cowden Dahl für die Kommentierung des Manuskripts.

1. Embryoidkörper (EB) Bildung <ol><li> Gelatine-Anpassung WSR, die auf Mausembryo-Fibroblasten (MEF) gehalten wurden. Passage WSR 3 mal am 6. Gewebekulturplatte mit 0,1% Gelatine beschichtet, um MEFs entfernen. <ol><li> Wachsen Zellen im ESC Wartung Medien mit LIF, um die Zellen undifferenziert (Tabelle 1) zu halten. Stellen Sie sicher, Zellen 80% Konfluenz nie überschreiten. Verwenden Sie niedrige Durchgang (10 oder weniger Stellen nach dem Entfernen von MEF-Zellen) für die Differenzierung. </li></ol></li><li> Am Tag vor WSR sind für EB Differenzierung kultiviert, Durchgang die Zellen, so dass sie etwa 50-70% konfluent am nächsten Tag. Weiter Kultivieren von Zellen in Erhaltungsmedium ESC zu Zelle Pluripotenz behalten. </li><li> Am Tag der Differenzierung, absaugen ESC Erhaltungsmedium und Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. <ol><li> Geben Sie 200 ul von 0,25% trypsin / EDTA zu jeder Vertiefung und bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Inaktivierung des Trypsin / EDTA mit 800 ul der Differenzierung Medien. Pipette auf und ab in einem 2 ml-Pipette mit einer serologischen p200 Spitze gegen Aufbruch der Zellen in einer Einzelzellsuspension. Sicherzustellen, dass die p200 Spitze passt genau auf das Ende so Medien geht nicht zwischen der Pipettenspitze und Schnittstelle. </li><li> Pipette auf und ab ca. 5-10 mal. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren erstellen. </li></ol></li><li> Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Um das Volumen auf 10 ml mit PBS. Zentrifuge bei 315 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand entfernen. Zweimal waschen mit 5 ml PBS Reste enthält, LIF entfernen. Zentrifuge nach Schritt 1.4 für jede Waschung. <ol><li> Resuspendieren endgültige Zellpellet in 2 ml Differenzierungsmedium (Tabelle 2). </li></ol></li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzähler und Platte 6.000-10.000 Zellen / ml in einer 10 cm Petrischale(Nicht-Gewebekultur-behandelten). <ol><li> Bestimmen Sie die genaue Zellen / ml empirisch für jede Zeile ESC. Sterile Petrischalen in der Regel für die bakterielle Arbeit oder geringe Haftung Platten verwendet. HINWEIS: Die besten Ergebnisse Differenzierung, sollte das EBS Kugeln, die in Suspension bleiben, ohne Befestigung an der Platte zu bilden. Testen Sie mehrere Marken von Platten, um diejenigen mit der geringsten Einhaltung zu finden. </li><li> Die Differen WSR inkubieren bei 37 ° C Brutschrank mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lager </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> igma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES abgeschirmt) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Streptomycin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 ul </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> Leukemia Inhibitory Factor (LIF) </td><td> 10 7 Einheiten / ml </td><td> 1.000 Einheiten / ml </td><td> 50 ul </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>NHALT &quot;&gt; Tabelle 1: ESC Wartung Medien. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lager </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (User Abgeschirmte für optimale Differenzierung) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Leben TechnoloGies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Streptomycin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 ul </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Differenzierung Medien. 2. Vorbereitung EB Zellen für Virus-Infektion <ol><li> Bei der gewünschten Ausbaustufe (zwischen Tag 2 und Tag 3), übertragen Sie die EVG aus der Petrischale 10 cm bis 15 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und fügen Sie den zu waschen, um die konische Röhre. </li><li> Pellet die EVG bei 315 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 5 ml PBS waschen Sie die EB-Zellen. </li><li> 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung (mit proteolytischen Enzymen und kollagenolytischen) und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C warmen Wasserbad (oder Inkubator) für 30 min mit occasional Agitation (von schnippen oder Licht Vortex). </li><li> 1 ml Differenzierungsmedium. Pipette auf und ab mit einer 2-ml-Pipette mit einem p200 Pipettenspitze. Das Röhrchen wird in 37 ° C warmen Wasserbad wieder für 30-60 min. </li><li> Spin-Down der Zellen bei 315 xg für 5 min und waschen Sie die Zellen mit PBS. </li></ol> 3. Virus-Infektion <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 1,5 ml Differenzierungsmedium. Übertragen der Zellsuspension auf eine 6-Well-Gewebekultur nicht behandelten Platte. </li><li> Bereiten Sie das Retrovirus durch Standardverfahren vor der Zeit. Hinzufügen von 5 bis 100 ul Virusüberstand, um Zellen abhängig von viralen Titer. Sie Polybren nicht hinzufügen, um eine Infektion zu erhöhen, da dies hemmt die spätere Reformation der EVG. </li><li> Spinoculate der Zellen mit Virus durch Zentrifugieren bei 2.120 × g für 90 min bei Raumtemperatur. </li></ol> 4. Differenzierung Viral Infizierte EB Zellen in hängenden Tropfen <ol><li> 2 ml Differenzierungsmedium in jede Vertiefung infected EB Zellsuspension. </li><li> Pipette 3,5 ml EB infizierten Zellsuspension in ein steriles Reagenz Reservoir für multipipettors. Verwenden Sie die multipipettor 15-20 Reihen von acht 20 ul Tropfen auf dem umgekehrten Deckel des 15 cm Petrischale pipettieren. </li><li> 10 ml steriler PBS oder Wasser auf die untere Hälfte der Petrischale. Dann kehren die Deckel mit den Tropfen und Ort auf die Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen auf den Kopf von Deckel mit PBS oder Wasser unten hängen zu halten, der Kammer befeuchtet. </li><li> Die Schalen werden in den 37 ° C Brutschrank mit 5,0% CO 2. </li><li> Nach 2 Tagen sammeln EBs Tropfen durch Invertieren Deckel und Waschen mit 4,5 ml Differenzierungsmedium im hängenden gebildet. <ol><li> Übertragungsmedien und EBS zu einem neuen 10 cm nicht-Gewebekulturpetrischale. Mit 3 ml Differenzierungsmedium und Transfer zum 10 cm Teller waschen Sie den Deckel wieder. </li></ol></li><li> Ernten der Zellen für die Analyse durch Durchflusszytometrie nach insgesamt 8Tagen Kultur ausgehend von der anfänglichen Übertragung von Zellen auf Differenzierungsmedium (-LIF). </li></ol> 5. Vorbereitung Zellen für Durchflusszytometer-Analyse <ol><li> Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer 10-ml-Pipette. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und Transfer zum gleichen konischen Rohr. </li><li> Pellet-Zellen bei 315 x g. Pellets mit 10 ml PBS waschen. </li><li> 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min mit gelegentlichem Rühren. Für den Nachweis von bestimmten Zelloberflächenantigenen, kann Trypsin stattdessen verwendet werden. </li><li> 1 ml Differenzierung Medien und pipettieren nach oben und unten mit einem 2-ml-Pipette. Verwenden Sie ein p200 Spitze zum Ende der Pipette zu helfen, brechen-up verdaut EB in Einzelzellsuspension. <ol><li> Das Röhrchen wird in ein 37 ° C Wasserbad für 60 min wieder, damit die integrale Membranproteine ​​auf der Zelloberfläche zu recyceln. </li></ol></li><li> Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen with 0,1% Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA) in PBS (PBS / BSA) hergestellt und Inkubation der Zellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern. </li></ol> 6. Durchflusszytometrie-Analyse für hämatopoetische Vorläufer <ol><li> Platz 10 6 EB-abgeleiteten Zellen in einem 5 ml 12 x 75 mm Rundrohr unten. Zur Einstellung Durchflusszytometer Korrektureinstellungen verwenden Entschädigung Perlen nach Herstelleranweisungen. </li><li> Pellet-Zellen bei 315 x g. Überstand abgießen und Pellet in Rest PBS / BSA-Lösung in der Röhre. </li><li> Zum Erfassen ESC HPC, Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörper: anti-Maus-CD41-PE (R-Phycoerythrin) und Anti-Maus-CD117 (CKIT) -APC / CY7 (Allophycocyanin Cyanin 7). <ol><li> Verdünnte Antikörper 1: 100 in PBS / BSA. 100 ul des verdünnten Antikörpers zu jeder Probe. Bestimmen Sie die richtige Verdünnung des Antikörpers für jeden Lieferanten, Klon und viel oder Antikörper. Bestimmen Sie optimale Verdünnung für die Markierung von Zellen einzeln. </li&gt; </ol></li><li> Proben auf Eis inkubieren im Dunkeln für 30 min. </li><li> 2 ml PBS / BSA-und Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min. </li><li> Überstand wird abgesaugt und das Pellet erneut in 300 ul PBS oder einem isotonischen Puffer. </li><li> Filter resuspendierten Zellen durch eine Zelle Sieb Kappe (0,35 uM), um große Zellaggregate zu entfernen. </li><li> Analysieren Zellen mit einem Durchflusszytometer. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Wie oben diskutiert, können Klone, die ESC induzierbar ein Gen von Interesse exprimieren mit Doxycyclin Systeme erzeugt werden, jedoch ist die Erzeugung dieser Leitungen zeitaufwendig und arbeitsintensiv. In diesem Protokoll beschrieben ist eine Methode, um ein Gen von Interesse in Einzelzellsuspension von ESC vorbereitet abgeleitet EVG auszudrücken. Diese infizierten Zellen werden dann durch hängenden Tropfen auf nachfolgende Differenzierung zu untersuchen, in EBs reformiert. In dem Beispiel (Figur 3) ...

Maus embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent, bleiben undifferenziert und erneuern sich selbst, wenn das Zytokin Leukemia Inhibitory Factor (LIF)1 vorhanden ist. Nach Entzug der LIF differenzieren sie sich spontan in 3-dimensionale (3D) Strukturen, die als Embryoidkörper (EBs) bezeichnet werden2. Die 3D-Architektur ermöglicht die Entwicklung der drei Keimblätter Ektoderm, Endoderm und Mesoderm, aus denen später reife Gewebetypenentstehen 3. ESCs sind ein hervorragendes Modell zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der zellulären Differenzierung, insbesondere zur Untersuchung der Entwicklung früher hämatopoetischer Vorläuferzellen (HPCs)4. 
Die Genexpression in ESCs kann durch verschiedene Techniken manipuliert werden, die es ermöglichen, eine Rolle für einzelne Moleküle in der Entwicklung zu bestimmen. Eine der gebräuchlichsten Techniken ist die homologe Rekombination zur Erzeugung von ESC-Linien, denen ein interessierendes Gen fehlt5,6. Es gibt auch eine Reihe von Techniken, die verwendet wurden, um Gene zu überexprimieren. Die erste Technik, die zur Modifikation der Genexpression in ES-Zellen verwendet wurde, bestand darin, sie mit rekombinanten Retroviren zu infizieren7,8. Das interessierende Gen wird jedoch oft zum Schweigen gebracht, da sich die ESCs in Vorläuferzellen und reife Zelltypen differenzieren. Die Verwendung von Lentiviren hat sich als erfolgreich erwiesen, um das Silencing von viral exprimierten Genen zu begrenzen9. Andere virale Vektoren, die für die Überexpression verwendet werden, sind das Adenovirus und das Adeno-assoziierte Virus10. Darüber hinaus werden Standard-Transfektionstechniken zur stabilen Einführung von Expressionsplasmiden häufig für die ESC-Transgenexpressionverwendet 11. Eine Schwierigkeit bei diesen Systemen besteht darin, dass die Expression eines bestimmten Gens oft je nach zeitlicher Expression unterschiedliche Auswirkungen hat. Zum Beispiel beeinflusst das Smad1-Protein die Entwicklung hämatopoetischer Zellen in verschiedenen Stadien der EB-Entwicklung unterschiedlich12,13. 
Dieses Problem kann durch die Erzeugung von ESCs umgangen werden, die induzierbar ein interessierendes Gen exprimieren. Das gebräuchlichste System zur induzierbaren Expression von Transgenen in ESCs verwendet das Tetracyclin-Resistenz-Operon aus E. Coli (Escherichia coli). Es wurden mehrere verschiedene Tetracyclin-Systeme entwickelt. Eine der beliebtesten Strategien wurde von Kyba und Kollegenentwickelt 14. Sie erzeugten eine ESC-Linie (Ainv15), in die das reverse Tetracyclin-Transaktivator-Gen in den konstitutiv aktiven ROSA26-Locus eingefügt ist. Ein Tetracyclin-Response-Element (TRE), eine nachgeschaltete LoxP-Stelle (Locus von X-over P1 aus dem Bakteriophagen P1) und eine promotorlose Neomycin-Kassette wurden in den HPRT-Locus (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase) auf dem X-Chromosom eingeführt. Mit Hilfe eines CRE-Rekombinationsansatzes kann ein interessantes Gen zusammen mit einem eukaryotischen Promotor zur Steuerung der Expression des Neomycin-Resistenzgens in die LoxP-Stelle eingefügt werden. Korrekt ausgerichtete Regler werden durch G418-Selektion isoliert. Diese Zielklone müssen dann auf die Doxycyclin- (oder Tetracyclin)-induzierbare Expression des Transgens getestet werden. Dieser Ansatz hat erfolgreich ESC-Linien generiert, die induzierbar HoxB4, Stat5, SCL und Smad714-17 exprimieren. Die Generierung dieser induzierbaren Zelllinien ist jedoch zeitaufwändig. Hier wird eine Methode beschrieben, um ESC-abgeleitete Embryoidkörper (EBs) in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen, die Zellsuspensionen an verschiedenen Entwicklungstagen retroviral zu infizieren und dann die EBs durch hängenden Tropfen neu zu reformieren. Die Downstream-Differenzierung wird später durch Durchflusszytometrie bewertet. In diesem Artikel wird ein Beispiel dafür gezeigt, wie sich die miRNA-Expression in EB-abgeleiteten Zellen auf die hämatopoetische Differenzierung auswirkt. Diese Methode ist nützlich, um die Rolle von Genen nach der Gewinnung von spezifischem Keimblattgewebe zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ES gescreent)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS (definiert)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Leben Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Gewebekulturplatten 6- </td><td>well Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Unbehandelte Platten 6-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petrischale 10</td><td>cm Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petrischale 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml mit Cell Strainer Cap</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Weiße sterile Resevoirs</td><td>U.S.A. Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD41 PE-konjugiert</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD117 APC/CY7-konjugiert</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 Regler</td><td>ATCC</td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

retrovirale infektion von murinen embryonalen stammzellen abgeleitete embryoidkörper zellen für die analyse von hämatopoetischen differenzierung

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind ein hervorragendes Modell zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der zellulären Differenzierung. Sie sind besonders nützlich, um die Entwicklung von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) zu untersuchen. Die Genexpression in ESCs kann durch verschiedene Techniken manipuliert werden, die es ermöglichen, die Rolle einzelner Moleküle in der Entwicklung zu bestimmen. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass die Expression bestimmter Gene oft unterschiedliche phänotypische Effekte hat, die von ihrer zeitlichen Expression abhängen. Dieses Problem kann durch die Erzeugung von ESCs umgangen werden, die ein Gen von Interesse induzierbar exprimieren, indem Technologien wie das Doxycyclin-induzierbare Transgensystem verwendet werden. Die Erzeugung dieser induzierbaren Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um ESC-abgeleitete Embryoidkörper (EBs) in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen, die Zellsuspensionen retroviral zu infizieren und dann die EBs durch hängenden Tropfen neu zu reformieren. Die Downstream-Differenzierung wird dann mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Mit Hilfe dieses Protokolls konnte gezeigt werden, dass die exogene Expression eines microRNA-Gens zu Beginn der ESC-Differenzierung die HPC-Generierung blockiert. Wenn das microRNA-Gen jedoch in EB-abgeleiteten Zellen exprimiert wird, nachdem naszierendes Mesoderm produziert wurde, verbessert es die hämatopoetische Differenzierung. Diese Methode ist nützlich, um die Rolle von Genen nach der Gewinnung von spezifischem Keimblattgewebe zu untersuchen.

In diesen Studien verkleistert RW4 (abgeleitet von 129X1 / SVJ Mausstamm) WSR verwendet wurden. EBs wurden nach 3 Tagen der Differenzierung isoliert. Für beste Ergebnisse sollte das EBS kugelförmig und nicht haft (Abbildung 1A, B). Nach spinoculation mit Virus co-exprimieren, die Fluoreszenzmarker GFP zusammen mit einem Gen von Interesse wurden EBs des Hängetropfenverfahren reformiert. EBs wurden erfolgreich aus Zellsuspensionen von 2,0, 2,5 und 3,0 Tage EVG vorbereitet reformiert. Allerdings könnte EVG...

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu untersuchen, wie sich die Expression eines Gens zu verschiedenen Zeitpunkten während der Differenzierung embryonaler Stammzellen auf die hämatopoetische Differenzierung auswirkt. Nach der Transduktion des Embryokörpers werden die Einzelzellsuspensionen durch Zentrifugation der Embryokörper durch hängenden Tropfen reformiert und kultiviert, um eine weitere Differenzierung in hämatopoetische Zellen zu ermöglichen. Anschließend werden Einzelzellsuspensionen der reformierten Embryokörper hergestellt, mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern inkubiert und auf einem Durchflusszytometer zur hämatopoetischen Differenzierung analysiert.Letztendlich zeigt diese Methode, ob die Expression eines Gens während der Differenzierung embryonaler Stammzellen die hämatopoetische Entwicklung beeinflusst. Es ist besonders nützlich, um die Rolle von Genen zu demonstrieren, die möglicherweise erst nach der Bildung von frühem embryonalem Gewebe aktiv sind. Von den üblichen Techniken zur Expression eines Gens, das zu verschiedenen Zeitpunkten während der Differenzierung embryonaler Stammzellen abenteuerlich ist, erfordern die Erzeugung embryonaler Stammzel

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Konstruktion eines humanisierten Knochenmark-/Leber-/Thymus-Mausmodells mit stammzellbasierter künstlicher Immunität gegen HIV-Infektionen.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum humanisierten Mäuse (Hu-NSG) schaffen über intrahepatischen Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Strahlung bedingt neonatale NSG Mäuse. Die Hu-NSG-Maus ist anfällig für HIV-Infektion und kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und dient als ein geeignetes pathophysiologischen Modell für HIV-Replikation und Latenz-Untersuchungen.

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

Erfahren Sie, wie retrovirale Infektion von embryonalen Stammzellen die hämatopoetische Differenzierung beeinflusst. Diese Methode nutzt Hanging-Drop-Kultur und Durchflusszytometrie zur Analyse.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung (Video) | JoVE Journal

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

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