Name: Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Analyse neurovaskulärer Veränderungen in entorhino-hippocampalen Organotypkulturen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung neuronaler und vaskulärer Veränderungen nach ischämischer Hirnverletzung.

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Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin, und dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_141007) unterstützt. Markus Saxer leistete technische Unterstützung.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 22. September 2010 des Rates durchgeführt (2010/63 / EU) und wurden überprüft und durch die Schweizer Behörden zugelassen. 1. Einrichten Organotypische Entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen <ol><li> Bereiten entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen (EHOSCs) von postnatalen Tag 4 (P4) Maus Welpen mit der statischen Methode Inkubation 4,11. Hier verwenden C57Bl6 und CB6F1 Mäusen. <ol><li> Nehmen Sie etwa 30 min pro Maus Welpen zur Herstellung von Schnittkulturen, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Welpen Maus. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumenten. </li><li> Um eine mögliche Störung von der Position der Scheibe entlang der Zeitachse-septo zu vermeiden, nur Hippocampus des medialen Hälfte. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Schritte bei RT. </li></ol></li><li> Abgeschnitten ter Kopf eines P4 Maus Welpe mit chirurgischer Schere. Keine Betäubung für diesen Schritt erforderlich. <ol><li> Entfernen Sie den Schädel rund um das Gehirn und Identifizierung der Riss zwischen dem kaudalen Ende der Großhirnhemisphären und des Mittelhirns. Den Teil des Gehirns, rostral sorgfältig zu entfernen, um das Mittelhirn aus dem Schädel und legen Sie sie in eiskaltem Präparationsmedium, bestehend aus MEM mit einer stabilisierten Form von L-Glutamin. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit der Präparation unter einem Stereomikroskop mit dem Gehirn in der eiskalten Herstellungsmedium eingetaucht. Entfernen Sie verbleibende Hirnhäute aus den kortikalen Hemisphären. Identifizierung der Hippocampus auf der medialen Schwanzfläche der Halbkugel und trennen sie zusammen mit dem benachbarten entorhinalen Kortex vom Rest des Gehirns. <ol><li> Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer Gewebe Chopper und geschnitten 400 um dicke Scheiben unter aseptischen Bedingungen quer zur septo-zeitliche Achse des Hippocampus. </li></ol></li><li> Legen Sie die Scheiben auf cell Kultureinsätzen (ca. 6 Scheiben pro Platte) und inkubieren sie in 6-Well-Platten mit 1 ml pro Vertiefung Inkubationsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle-Medium, 25 ml Pferdeserum, 1 ml Glutamax I, 1 ml einer sterile 10% Glucose-Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C aufweist. Ändern Sie den nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag bis zu 1 Woche das Medium. </li></ol> 2. In-vitro-Hypoxie und Sauerstoff-Glukose-Entzug mit Reperfusion <ol><li> Siehe Tabelle 1 für eine genaue Zeitplan des Verfahrens. Kultur EHOSCs für 5 Tage (DIV5) vor der Einwirkung von Hypoxie oder OGD. Zu diesem Zeitpunkt schaltet das Medium vom Inkubationsmedium, enthaltend 25% Pferdeserum-freiem Medium mit der folgenden Zusammensetzung Serum: Neurobasalmedium mit 2% B27 Supplement, 1% Glutamax und zusätzlich 0,1% Glucose. </li><li> Bereiten Sie die OGD Medium wie in Referenz 7 .Der endgültigen Konzentrationen der Komponenten detailliert beschrieben wird, die folgenden: 0.3mM CaCl 2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 und 10 mM Saccharose bei pH 6,8. 1 ml der OGD Medium zu jeder Vertiefung von zwei 6-Well-Gewebekulturplatten. <ol><li> Versorgen die OGD-Medium mit N 2 für 1 Stunde in einem Hypoxie Kammer und dann versiegeln und zu halten O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Verwenden anaeroben Streifen als hypoxischen Indikatoren. Betrachten des Mediums, um sauerstofffrei sein, wenn die Farbe der Streifen geändert von rosa bis weiß. </li><li> Für die Induktion von Hypoxie, verwenden Serum-freiem Medium mit Glukose statt OGD Medium. Vor der Verwendung zur Perfusion des Mediums mit N 2 in einer Hypoxie Kammer wie oben für OGD Medium beschrieben. </li></ol></li><li> Bevor die Scheiben auf OGD ausgesetzt ist, versorgen die OGD Medium wieder mit N 2 für 30 min. Add 2 ul einer 1 mg / ml Propidiumiodid (PI)-Lösung pro Vertiefung (bei einer Endkonzentration von 2 ug / ml) mit den Scheiben für 30 min und wählennur gesunde Scheiben für Experimente wie die geringen Zahlen der PI-positiven Zellen angegeben. </li><li> Verwenden Sie den Zeitplan für die OGD-Exposition und Reperfusion in Abbildung 1 angegeben. Berauben Scheiben entweder Sauerstoff nur (Hypoxie) oder Sauerstoff und Glukose (OGD) für 15 min. <ol><li> Für die Induktion der Hypoxie oder OGD, übertragen Scheiben in OGD Medium und halten Sie für 15 Minuten in der Kammer Hypoxie. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeiten, die an den Seiten des Einsatzes bleiben weg abgesaugt wenn die Kulturen von normalen Medium OGD Medium und zurück geschaltet. </li><li> Nach Hypoxie oder OGD, ersetzen Sie die OGD Medium mit sauerstoff Serum-freiem Medium und Kulturen dürfen für 3, 24 oder 48 Stunden in Serum-freiem Medium in der regulären Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu erholen. PI hinzuzufügen wieder vor der Fixierung für die Bestimmung von Zelltod. </li></ol></li></ol> 3. pharmakologische Behandlungen von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen <ol><li> CulturE EHOSCs für 5 Tage (DIV5) in Inkubationsmedium vor der Belichtung mit pharmakologischen Behandlungen. Starten pharmakologische Behandlungen entweder während oder unmittelbar nach der OGD OGD, wenn Scheiben, um Serum freien Medium übertragen. </li><li> Behandlungen zum Schutz vor OGD. <ol><li> Mit 100 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) und 1 uM Tetrodotoxin (TTX) zu dem Kulturmedium während der Induktions OGD (für 15 min) oder unmittelbar nach OGD Induktion für 30 min. Dann, Inkubation in normoxischen Serum freien Medium für 48 Stunden vor der Fixierung. </li></ol></li><li> Behandlungen für die Induktion von exzitotoxische Tod. <ol><li> Nach 5 Tagen in Inkubationsmedium Schalter Kulturen freien Medium, das 100 um (RS) -α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) 30 min Serum. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium mit AMPA durch Aspiration (Vorsicht, um restliche Medium, auf Einsätze zu entfernen), dann übertragen Sie die Scheiben auf frische Platten mit normalen Serum-freiem Medium undhalten sie für 48 Stunden, bis Fixierung. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Immunfärbung von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen <ol><li> Propidiumiodid (PI)-Färbung. <ol><li> Hinzufügen PI für 30 min in das Kulturmedium von lebenden Scheiben in einer Konzentration von 2 ug / ml. Live-View-Kulturen, die mit einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-Optik ausgestattet und wählen Scheiben für weitere Behandlungen. Für eine PI-Färbung in Kombination mit Immunhistochemie, fügen PI-Lösung 30 min vor der Fixierung der Kulturen. </li></ol></li><li> Fixierung der Scheiben. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 6-Well-Platte und 3 ml frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung. Dann legen Sie die 6-Well-Platte in einem Kühlschrank und fixieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die PFA-Lösung am nächsten Tag und waschen die Scheiben 3-4 mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). </li></ol></li><li> Entfernen der Scheiben aus dem Zellkultur insert und Blockierverfahren für die Immunhistochemie von frei schwebenden Abschnitte. <ol><li> Vorsichtig lösen und entfernen Sie die Scheiben von den Kulturplatten mit Hilfe eines Kunst Pinsel der Größe 0 oder kleiner. Übertragen jedes einzelne Stück in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit Blockierungspuffer (PBS mit 3% normalem Ziegenserum (NGS) und 2% Triton-X100) gefüllt. Halten der Scheiben in Blockierungspuffer für 2 h bei RT unter ständigem Rühren mit einem Orbitalschüttler. </li></ol></li><li> Immunfärbung der Schnittkulturen <ol><li> Für die Markierung der Blutgefäße verwenden polyklonalen Anti-Laminin in einer Verdünnung von 1: 200 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100. </li><li> Zur Markierung Neuronen verwenden anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2) in einer Verdünnung von 1: 500 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100. </li><li> Die Scheiben mit primären Antikörpern für 48 Stunden Inkubieren bei 4 ° C unter konstantem Rühren. Nach der Inkubationszeit, waschen Sie sie in PBS mit 0,5% Triton-X100 für 3-4 mal. </li&gt; <li> Verdünnte sekundäre Antikörper 1: 500 in PBS, 1% NGS und 0,5% Triton-X100. Bebrüten die Scheiben für 2 h bei RT im Dunkeln mit den Alexa Fluorophor konjugiert Sekundärantikörper. Verwenden Sie die entsprechende Ziege-Anti-Kaninchen-oder Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa 350 oder 488 konjugiert. </li><li> Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen die Scheiben dreimal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS); montieren sie auf Glasobjektträger und Deckglas die Folien mit Mowiol. </li></ol></li><li> Mikroskopie der gefärbten Scheiben </li><li> Informieren Sie sich über die gefärbten Scheiben entweder auf einem Standardmikroskop mit Epifluoreszenz Ausrüstung oder mit einem konfokalen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder mit einer geeigneten Kamera. Für einige Bilder, invertieren die Fluoreszenzkontrast, um dunkel gefärbte Gefäße auf einem hellen Hintergrund zu erhalten (5 und 6). </li></ol> 5. Bestimmung der regionalen Gefäßdichte in den Kulturen <ol><li> Quantifizierung der vessel Dichte basierend auf Schiff Gänge wie im Referenz 8 beschrieben. </li><li> Verwenden Scheiben für Laminin für diese Messungen gefärbt. Lagern aufgezeichneten Bilder der 10-facher Vergrößerung mit einem 6 x 6 Raster, wobei jedes Gitter gleich 100 x 100 um pro Quadratmeter, Gesamtfeld von 0,25 mm 2 ist. </li><li> Overlay drei solcher Netze in der CA1-Region, CA3, DG, und EG (Abbildung 2). Zählen Sie die Schiffe überqueren die Linien des Gitters. </li><li> Für den Erhalt einer guten Ergebnisse mit statistischer Relevanz, machen Messungen in mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die jeweils Daten von drei Welpen Maus mit 3 Scheiben pro Maus Welpen. </li><li> Bestimmen Sie den Mittelwert des Schiffes Übergänge von den Gittern für jede Region und führen eine statistische Analyse durch ANOVA mit Bonferroni-Korrektur als Post-hoc-Test (p &lt;0,05 definiert als signifikant) mit entsprechenden Statistik-Software. </li></ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
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<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
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<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) durchgeführt und wurden von Schweizer Behörden überprüft und zugelassen. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit den hier vorgestellten Methoden kann Hippocampus organotypischen Schnittkulturen als vielseitiges Werkzeug zur plastischen Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu untersuchen. Während organotypischen Kulturen haben in der Vergangenheit für die Untersuchung der neuronalen Reaktionen nach Ischämie 6, 7 der neuen Aspekt der gleichzeitigen Untersuchung von Gefäßveränderungen verwendet wurde erheblich erweitert die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein dur...

Das Zentralnervensystem ist besonders empfindlich gegenüber einem Verlust oder Reduktion von Sauerstoff und Glucose durch die Gefäßversorgung. Selbst eine eher kurze Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns kann einen dauerhaften Verlust der Funktion der jeweiligen Hirngebiete, die zu den typischen Hub-Syndrome zu induzieren. Zusätzlich zu dem Verlust von Nervenzellen in den primären betroffenen Gebieten gibt es typischerweise zusätzliche verzögerten neuronalen Verlust durch Sekundärschäden. Leider bis jetzt keine neuroprotektive Behandlung zur Verringerung von Sekundär neuronalen Tod verfügbar war 1. Forschungsanstrengungen zur Untersuchung der Mechanismen der Sekundärschäden auf der Verwendung von Tiermodellen der zerebralen Ischämie wie mittleren Hirnarterie Okklusion und verschiedenen thrombotischen Verschluss Techniken beruhen (eine aktuelle Übersicht siehe 2). Parallel auch aufgrund von Einschränkungen und ethische Bedenken bei der Verwendung von Tiermodellen, organotypischen Kultur der verschiedenen ZNS-Gewebe verwendet wurden, die die stu ermöglichendy der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Art der Verletzungen 3-5. Für die Untersuchung der neuronalen Reaktion unter Bedingungen, die ischämische Gehirnverletzung zu imitieren, ist das Modellsystem von Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) entwickelt. In diesem Modell werden die Schnittkulturen vorübergehend auf einem Medium, das Glucose mangelt und wurde mit Stickstoffgas in der Abwesenheit von Sauerstoff ausgesetzt, äquilibriert worden. Bei einer solchen Behandlung ist es möglich, neuronaler Verletzung und der Verlust der eher ähnlich dem nach ischämischer Verletzung in vivo 6, 7 beobachtet induzieren. Im Hippocampus, induziert eine derartige Behandlung neuronaler Verluste insbesondere in der CA1, aber nicht in der CA3-Bereich oder dem Gyrus dentatus des Hippocampus. Im Gegensatz dazu ist die Untersuchung des vaskulären Reaktionen in Schnittkulturen bisher nicht weit verbreitet durchgeführt. Ein offensichtlicher Grund ist der Mangel an Durchblutung und Gefäßdurchblutung in der Schnittkultur-Modell. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass es möglich ist, b zu erhaltenlood Gefäße im ZNS Schnittkulturen für mehrere Tage 8, 9. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, um das Schicksal von Neuronen nach OGD nicht nur überwachen, sondern erstrecken sich die Studie mit dem Schicksal und den Umbau des Gefäßsystems, die ein wichtiger Teil der Schädigung Antwort ist. Bis jetzt solche Studien haben die Verwendung von Tierversuchen erforderlich (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al., 2001). In der hier vorgestellten Protokoll, werden wir detailliert, wie solche Studien können in entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen getan werden herausgefordert, entweder mit Hypoxie oder durch exzitotoxische Läsionen gefolgt von der Analyse der beiden neuronalen Überleben und Blutgefäßreaktionen. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Studie zu diesem Thema 10 und kann nützlich für jedes Labor interessiert neurovaskulären Wechselwirkungen im ZNS sein.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilisierte Form von L-Glutamin</td></tr><tr><td>Millicell Zellkultur-Inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basalmedium Eagle&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobe Streifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R& D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>F& Technik D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>F& T D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>polyklonales Anti-Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anti-Maus 350</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anti-Maus 488</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anti-Kaninchen 350</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anti-Kaninchen 488</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistik Software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Gewebehacker</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxiekammer</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

die analyse der neurovaskuläre remodeling in entorhino-hippocampus organotypischen kulturen

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischämischen Hirnverletzung ist eine der häufigsten und schwersten Bedingungen Kompromisse ordnungsgemäße Funktion des Gehirns und führt zu anhaltenden funktionellen Defiziten in den betroffenen Patienten oft. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen, gibt es noch keine wirksame Behandlungsmethode verfügbar, die neuronale Verletzung reduziert und schützt Neuronen in den ischämischen Bereichen von verzögerten Sekundär Tod. Forschung in diesem Bereich umfasst typischerweise die Verwendung von aufwendigen und problematischen Tiermodellen. Entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen mit Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD) in Frage gestellt werden in vitro Modelle, die zerebrale Ischämie imitieren etabliert. Der neuartige Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass Veränderungen der Gehirnblutgefäße neben neuronalen Veränderungen und die Reaktion sowohl des neuronalen Raum und dem vaskulären Kompartiment untersucht verglichen und korreliert werden. Die in diesem Protokoll vorgestellten Verfahren die möglichen Anwendungen der wesentlichen verbreitern oderganotypic Schnittkultur-Ansatz. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Dies steht in krassem Gegensatz zu den komplizierten und problematischen Tierversuche Induktion Schlaganfall und Ischämie in vivo. Durch die Erweiterung der Analyse auf die Untersuchung der Reaktion des Gefäßsystems könnten neue Möglichkeiten auf, wie die Erhaltung und Wiederherstellung Hirnfunktionen bereitzustellen. Die Schnittkultur hier vorgestellte Ansatz könnte zu einem attraktiven und wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der ischämischen Hirnschädigung entwickeln und könnte nützlich für die Prüfung potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf die Neuroprotektion angestrebt werden.

Sauerstoff Glukose Deprivation und Hypoxie induzieren neuronalen Tod und Gefäßreduktion insbesondere im Hippocampus CA1-Region. OGD oder Sauerstoffentzug allein für 15 Minuten führte zu einer starken Induktion von Zelltod durch Propidiumiodid-Färbung spezifisch in der CA1-Region des Hippocampus (Figur 3) gesehen, ähnlich wie zuvor beschrieben 7. Mit den Markierungen von Blutgefässen zu visualisieren, wurde festgestellt, dass der Blutgefäßdichte und Organisation erschien ähnlich ...

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gleichzeitig Veränderungen von Neuronen und Blutgefäßen in einem Gewebekulturmodell der ischämischen Hirnverletzung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst in Rhino-Hippocampus-Schnittkulturen eingetragen werden. Der zweite Schritt besteht darin, ischämische Hirnverletzungen nachzuahmen, indem die Kulturen hypoxischen Bedingungen ausgesetzt werden.Der letzte Schritt besteht darin, das neuronale Überleben und die vaskulären Veränderungen zu analysieren und zu korrelieren. Letztendlich wird ein in vitro Ansatz auf Basis organischer hippokampaler Schnittkulturen verwendet, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und dem Gefäßsystem unter ischämischen Bedingungen zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nach einer hypoxischen Herausforderung das neuronale Überleben und Veränderungen der Blutgefäße gleichzeitig in einem Schnittkultur-Modellsystem untersucht werden können.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroischämie zu beantworten, wie z.B. die Aufdeckung der komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Gefäßen und der ischämischen Bedingungen. Um mit der Vorbereitung zu beginnen, geben Sie organotypische Schnittkulturen von Nashorn-Hippocampus aus Mauspops nach der Geburt ein. Identifizieren Sie nach der Entfernung des Schädels die Fissur zwischen dem cordalen Ende der Gehirnhälften und dem Mittelhirn.Entfernen Sie vorsichtig die Teile des Gehirns rostral zum Mittelhirn und legen Sie es in ein eiskaltes Vorbereitungsmedium, das aus zugesetztem MEM besteht. Setzen Sie die Dissektion unter einem Stereomikroskop fort, wobei Sie das Gehirn in das eiskalte Präparationsmedium eintauchen lassen. Entfernen Sie die verbleibenden Hirnhäute aus den kortikalen Hemisphären.Identifizieren Sie als Nächstes den Hippocampus an der medialen cordalen Oberfläche der Hemisphäre und trennen Sie ihn zusammen mit dem angrenzenden Kortex des Eingangs der relativen Luftfeuchtigkeit vom Rest des Gehirns. Übertragen Sie das Gewebe auf einen Gewebehacker und schneiden Sie 400 Mikrometer dicke Scheiben quer zur septalen Schläfenachse des Hippocampus. Legen Sie die Scheiben auf Zellkultureinsätze und inkubieren Sie sie in sechs Well-Platten mit einem Milliliter Inkubationsmedium in einer befeuchteten Atmosphäre.Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag bis zu einer Woche Bereiten Sie als Nächstes das OGD-Medium vor. Geben Sie je einen Milliliter OGD-Medium in jede Vertiefung von zwei Sechszylindern. Well-Gewebekulturplatten perfundieren das OGG-Medium eine Stunde lang in einer Hypoxiekammer mit Stickstoff und bevor Sie es verschließen und über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius lagern, verwenden Sie anaerobe Streifen als hypoxische Indikatoren.Betrachten Sie das Medium als sauerstofffrei, wenn die Farbe der Streifen von rosa nach weiß wechselt. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie gesunde Zellen durch Propidiumiodid- oder PI-Färbung aus. Geben Sie Pi für 30 Minuten in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter in das Kulturmedium.Betrachten Sie die lebenden Kulturen mit einem inversen Mikroskop, das nur mit Fluoreszenzoptik ausgestattet ist. Schichten mit wenigen markierten Zellen, wie hier gezeigt, sollten für weitere Studienschnitte mit vielen markierten Zellen ausgewählt werden, wie hier gezeigt. Sollte nicht zur Induktion von OGD verwendet werden.Übertragen Sie die Scheiben in das OGD-Medium und halten Sie sie 15 Minuten lang in der Hypoxiekammer, stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeiten, die an den Seiten des Einsatzes verbleiben, auf den Schalterkulturen abgesaugt werden. Ersetzen Sie das OGD-Medium von normalem Medium zu OGD-Medium und zurück nach OGD, ersetzen Sie das OGD-Medium durch ein sauerstoffreiches serumfreies Medium und lassen Sie die Kulturen 3, 24 oder 48 Stunden lang erholen. In serumfreiem Medium wird Pi vor der Fixierung erneut zugegeben, um den Zelltod zu bestimmen.Wenn die Studie pharmakologische Behandlungen erfordert, beginnen Sie diese entweder während der OGD oder unmittelbar danach, wenn die Scheiben in serumfreies Serum überführt werden. Medium für die PI-Färbung. In Kombination mit Immunhistochemie ist die PI-Lösung 30 Minuten vor der Fixierung der Kulturen zuzugeben.Nachdem Sie die Zellen über Nacht fixiert haben, entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Scheiben drei- bis viermal. Beginnen Sie mit PBS das Blockierungsverfahren, indem Sie die Scheiben vorsichtig von den Kultureinsätzen lösen und in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte geben, die mit Blockierungspuffer gefüllt ist. Bewahren Sie die Scheiben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren durch einen Orbitalschüttler im Blockpuffer auf.Nach Zugabe der Primärantikörper der Wahl 48 Stunden bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren nach der Inkubationszeit inkubieren. Waschen Sie sie in PBS mit 0,5% Triton X 103 bis viermal. Befolgen Sie anschließend die Standardverfahren für den gesamten Sekundärantikörper, bevor Sie die Fleckenabschnitte auf Objektträger mit Deckgläsern montieren.Betrachten Sie die gefärbten Schichten entweder an einem Standardmikroskop mit Epi-Fluoreszenzgeräten oder mit einem konfokalen Mikroskop. Bei einigen Bildern können Sie den Fluoreszenzkontrast umkehren, um dunkel gefärbte Gefäße auf einem hellen Hintergrund zu erhalten, indem Sie Scheiben verwenden, die mit Laminin gefärbt wurden. Überlagerte aufgezeichnete Bilder mit 10-facher Vergrößerung mit einem Gitter von sechs x sechs überlagern drei solcher Gitter im Bereich ca one, CA three DG und DC.Und zählen Sie die Schiffe, die die Linien des Gitters kreuzen, um Ergebnisse mit guter statistischer Relevanz zu erhalten. Nehmen Sie Messungen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten vor, die jeweils Daten von drei Mauszügen mit drei Scheiben pro Mauswelpen enthalten. Der Vergleich von Kontrollkulturen mit behandelten zeigt, dass Hypoxie den neuronalen Tod und den Verlust von Blutgefäßen in etwa einer Region des Hippocampus induziert.In diesen Beispielen ist die PI-Färbung rot dargestellt und drei Stunden nach der Hypoxie-Behandlung mit der Laminin-Färbung in Grün verschmolzen, es ist keine PI-Färbung sichtbar und es sind keine vaskulären Veränderungen erkennbar. Nach 24 Stunden tritt eine PI-Färbung auf und auch der Blutgefäßverlust ist offensichtlich. Sowohl die PI-Färbung als auch der Verlust von Blutgefäßen werden nach 48 Stunden deutlicher.OGD allein induziert sowohl den Verlust von Neuronen als auch den Verlust von Blutgefäßen. Bei etwa einer Anwendung von TTX oder CN QX verhinderte QX sowohl den neuronalen Verlust, wie er bei der PI-Färbung beobachtet wurde, als auch den Blutgefäßverlust, der durch die Laminin-Färbebehandlung mit 100 Mikromolaren A MPA für 30 Minuten aufgedeckt wurde, was zu einem weit verbreiteten neuronalen Verlust in den meisten Bereichen des Hippocampus führte, aber der Verlust von Blutgefäßen blieb auf den Bereich CA eins beschränkt. Die Quantifizierung der Blutgefäße bestätigt den selektiven Verlust im Bereich der CA eins.Im Anschluss an dieses Verfahren können medikamentöse Behandlungen oder genetische Modifikationen durchgeführt werden, um wirksame neuroprotektive Wirkstoffe zu identifizieren und die Mechanismen des Gefäßumbaus besser zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intervenierende Hippocampus-ähnliche Kulturen aufbaut und OGD induziert, gefolgt von einer Analyse sowohl des neuronalen Überlebens als auch der vaskulären Veränderungen.

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