Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist der Nachweis von Einzelvesikel, Zytose und Endozytose. Dies wird erreicht, indem zunächst eine saubere und vollständige Verdauung des Nebennierengewebes der Maus erreicht wird. Der zweite Schritt besteht darin, Zellen von den Nebennieren zu dissoziieren und zu plattieren.

Als nächstes werden Chrominzellen identifiziert und mit einem Patch geklemmt, um zellgebundene Kapazitätsaufzeichnungen zu erhalten. Letztendlich können einzelne Vesikel, Zytose und Endozytose beobachtet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. zellgebundenen Aufzeichnungen von einzelnen Ionenkanälen, besteht darin, dass wir in der Lage sind, Exozytose und Endozytose einzelner Vesikel nachzuweisen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da es schwierig ist, ein Giga-Siegel zu erhalten. Außerdem kann es schwierig sein, Zellen unter den gemischten Zelltypen zu identifizieren, die sich in der Platte befinden. Um sich auf die Operation vorzubereiten, beginnen Sie mit dem Autoklavieren eines Paares großer und kleiner Dissektionen, einer Schere und zwei Paar Pinzetten.

Stellen Sie dann die Präparierschale auf einen Eiskübel. Beginnen Sie auch, die Enzymlösung mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff zu blasen. Die Lösung ist hellrosa, bevor sie Blasen wirft. Nächster.

Nachdem Sie eine neugeborene bis drei Tage alte Maus eingeschläfert und geköpft haben, verwenden Sie die kleinere Schere, um den Rücken des Welpen entlang der Wirbelsäule von der Halswirbelsäule bis zur Herzregion abzuschneiden. Achten Sie darauf, oberflächlich unter der Haut zu schneiden, um ein Durchstechen der Körperhöhle zu vermeiden. Als nächstes schälen Sie die Haut von der Wirbelsäule ab, so dass die Muskulatur freiliegt und der Blick auf die Wirbelsäule frei ist.

Machen Sie nun einen Schnitt am zervikalen Rückenmark und machen Sie dann zwei parallele Schnitte entlang der Seiten der Wirbelsäule mit einer Pinzette, die den Hauptkörper des Tieres hält. Greife mit der anderen Pinzette nach der Wirbelsäule und ziehe die Wirbelsäule zurück, bis die Nieren freiliegen. Nachdem Sie die Nebennieren auf den Nieren lokalisiert haben, verwenden Sie eine Pinzette, um sie zu entfernen.

Legen Sie dann die Nebennieren vorsichtig in ein konisches Röhrchen, das mit Lock-Lösung gefüllt ist. Verwenden Sie eine zweite Pinzette, um die Nebennieren zu lösen. Wenn sie an der ersten Pinzette kleben, legen Sie das konische Rohr auf Eis.

Die Drüsen können bis zu zwei Stunden in verschlossener Lösung aufbewahrt werden. Überprüfen Sie an dieser Stelle die Enzymlösung, um sicherzustellen, dass sich die äquilibrierte Lösung von einer hellrosa Farbe in eine rosa-orange Farbe verwandelt hat. Als nächstes fügen Sie der frisch gesprudelten Enzymlösung Pape in einer Endkonzentration von 20 bis 25 Einheiten pro Milliliter hinzu.

Geben Sie dann die Propanenzymlösung in ein neues konisches Röhrchen und übertragen Sie die Nebennieren mit einer Pinzette in das Propanenzymröhrchen. Inkubieren Sie die Drüsen 40 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann 75 % der Inaktivierungslösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Übertragen Sie die Drüsen nach 10 Minuten vorsichtig in ein neu markiertes Röhrchen und waschen Sie die Drüsen dreimal mit Nährmedien. Legen Sie die Drüsen nach dem Waschen in 200 Mikroliter des Nährmediums und titrieren Sie die Drüsen dann vorsichtig durch die Pipettenspitze einer 200-Mikroliter-Pipette auf und ab. Halten Sie beim Titrieren die Drüsen mit der Abwärtskraft der 200-Mikroliter-Pipettenspitze am Boden des Röhrchens und binden Sie das Gewebe sanft und langsam ein. Achten Sie darauf, langsame, kontinuierliche Hübe zu verwenden, niemals schnell oder abrupt nach der Titration zu pipettieren, und fügen Sie weitere 250 Mikroliter Nährmedien hinzu, um das Gesamtvolumen des Nährmediums auf 450 Mikroliter zu erhöhen.

Als nächstes sieben 12 Millimeter PDL vorbeschichtete Deckgläser in einer 60 x 50 Millimeter großen Kulturschalenplatte. Dann werden 60 Mikroliter der Zelle, die die Lösung enthält, auf jeden der sieben Deckgläser aufgebracht. Nach dem Anrichten stellen Sie die Schale für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in den Inkubator.

Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig fünf Milliliter vorwärmtes Nährmedium in die Kulturschale und inkubieren Sie dann 24 Stunden lang, bevor Sie zellgebundene Aufzeichnungen durchführen. Nach dem Inkubationsplatz gleitet die 12 Millimeter dicke Deckschicht mit den Nebennierenzellen in die extrazelluläre Lösung. Da die gesamten Nebennieren verwendet wurden, besteht der nächste Schritt darin, zwischen den Chrominzellen und den kortikalen Zellen zu unterscheiden.

In Kultur sind die Chrominzellen typischerweise sehr hell mit einer bräunlich-beigen Färbung und einer nahezu perfekten kreisförmigen Form. Im Gegensatz dazu sind die kortikalen Zellen kleiner und dunkler als die CHRO-Zellen. Nachdem Sie die Patch-Pipetten wie im Textprotokoll beschrieben gezogen haben, tauchen Sie die Pipettenspitze in geschmolzenes Wachs, um die Kapazität des Glases zu verringern.

Polieren Sie dann die Spitze mit Feuerpolitur, um dieses Wachs aus dem Inneren der Pipettenspitze wegzublasen. Bauen Sie als Nächstes die Pipette mit der Patch-Pipettenlösung so auf, dass ihr Widerstand etwa zwei Megaohm beträgt. Befestigen Sie die Patch-Pipette an ihrem Manipulator und bringen Sie sie bis auf einige Mikrometer an die Zelle heran.

Fahren Sie mit dem Vorschieben der Pipette fort und achten Sie auf leichte Zellverformungen. Sobald die Verformung erkannt wurde, saugen Sie sanft, bis eine Giga-Om-Abdichtung erreicht ist. Ergibt eine an die Zelle angehängte Konfiguration.

Sobald eine Giga-Om-Versiegelung sichtbar wird, machen Sie zellgebundene Aufnahmen unter Verwendung eines EPC Seven plus Patch-Clamp-Verstärkers und eines zweiphasigen analogen Lock-in-Verstärkers, wie im Textprotokoll beschrieben, stellen Sie die Phase des Lock-in-Verstärkers so ein, dass transiente Kapazitätsänderungen durch sanftes Sogen erzeugt werden. Pulse erscheinen nur in der Patch-Kapazität oder im Trace ohne Projektion in das Patch, die Leitfähigkeit oder den Rücklauf, der Patching-Prozess dient als mechanische Stimulation. Da der Aktionsstrom typischerweise von den meisten Zellen aufgezeichnet werden kann, identifizieren Sie typische Kapazitätsänderungen durch den markierten Abwärtsschritt.

Der letzte Schritt besteht darin, die Daten für zukünftige Analysen zu speichern. Hier sehen Sie eine typische zellgebundene Kapazitätsaufzeichnung mit mehreren Abwärtsschritten. Jeder Abwärtsschritt ist mit einer einzigen iCal-Endozytose verbunden.

Einmal gemastert, kann die Zellkultur innerhalb von zwei bis drei Stunden fertiggestellt werden, und die Aufzeichnungen können innerhalb der folgenden vier Tage nach ihrer Entwicklung durchgeführt werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der synaptischen Übertragung, um das Recycling von synaptischen Vesikeln in neuroendokrinen Chrominzellen zu erforschen.