Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die relativen Veränderungen des Spiegels eines Proteins an Zentrosomen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. So wird dies beispielsweise zu einem bestimmten Zeitpunkt im Zellzyklus nach Hemmung des Proteasoms erreicht, indem Zellen, die auf Deckgläsern wachsen, zunächst entweder mit dem Proteasom-Inhibitor MG one 15 oder mit dem Kontrolllösungsmittel DMSO behandelt werden. Dann sofort BRDU zu beiden Zellen hinzufügen und sie vier Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren.

Der zweite Schritt besteht darin, die Deckgläser auf eine 24-Well-Platte zu übertragen, um die Zellen zu fixieren. Anschließend werden die Zellen mit Antikörpern gegen BRDU und die interessierenden Proteine und anschließend mit entsprechenden Sekundärantikörpern gefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, Bilder von BRDU-positiven Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer digitalen Bildgebungssoftware aufzunehmen, um die gleiche Belichtungszeit und Länge der Z-Achse auf die Zellen jeder Probe anzuwenden.

Anschließend werden die Bilder analysiert, um den relativen Pegel von romal VDA C3 zu quantifizieren. Letztendlich wird mit Hilfe der quantitativen Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt, dass der somale Centro-Pool von VDA C3 um das Doppelte erhöht wird, wenn das Proteasom während der S-Phase gehemmt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Durchflusszytometrie, Immunblot oder quantitativem Mikroskop besteht darin, dass diese Technik den relativen Spiegel des Proteins in zwei unterschiedlich behandelten Proben analysiert, die auf zwei verschiedenen Deckgläsern verarbeitet werden. Diese Methode verwendet eine Normalisierung auf einen internen Standard, um die Notwendigkeit zu kontrollieren, die beiden experimentellen Zellpopulationen zu verarbeiten.

Unabhängig davon kann diese Methode jedoch Einblicke in die Regulation bestimmter Proteine an Zentrosomen geben. Es kann auch auf andere Situationen angewendet werden, z. B. auf andere subzelluläre Strukturen oder die Untersuchung bestimmter Proteinpools, die an mehreren Stellen innerhalb der Zelle zu finden sind. Vorführen des Verfahrens wird schu majumder, ein Postdoc aus meinem Labor. Um das Experiment zu beginnen, durchlaufen Sie zweimal 10 bis fünf asynchron züchtende RPE-Zellen in zuvor vorbereitete 35-Millimeter-Schalen mit Decklippen und züchten Sie die Zellen in zwei Millilitern vollständigem Medium.

Ersetzen Sie das Nährmedium alle 24 Stunden durch frisches Vorwärmmedium Nach 44 Stunden. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein vollständiges Medium, das 0,05 % DMSO oder MG eins 15 bei einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren enthält, und fügen Sie den Zellen gleichzeitig BRDU in einer Endkonzentration von 40 Mikromolaren hinzu. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang. Übertragen Sie als Nächstes jeden Deckglas auf eine 24-Well-Platte.

Geben Sie 500 Mikroliter vorbearbeitetes Methanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius, um die Zellen zu fixieren. Waschen Sie die Einbezugsschlüsse nach 10 Minuten sofort dreimal mit 500 Mikrolitern Waschpuffer. Inkubieren Sie die fixierten Zellen auf einer Abdeckung und geben Sie 30 Minuten lang 200 Mikroliter Blockierungspuffer hinein, während die Zellen inkubiert werden.

Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor, indem Sie ein feuchtes Papiertuch in die untere Hälfte einer leeren 1000-Mikroliter-Pipettenspitzenbox legen. Legen Sie einen Streifen Parfum auf die Oberfläche des Racks und geben Sie ein 20-Mikroliter-Tröpfchen des Kaninchen-Anti-V-DDA-Drei- und des Maus-Anti-Gamma-Tubulin-Antikörpers, verdünnt in Blocking-Puffer, auf das Paraform. Nach dem Blockieren wird auf jedes Tröpfchen der Antikörperlösung ein Deckglas umgedreht.

Stellen Sie sicher, dass die Zellen eingetaucht sind, und schließen Sie den Deckel der Tippbox. Inkubieren Sie die Zellen mit Primärantikörpern über Nacht bei vier Grad Celsius in der befeuchteten Kammer. Drehen Sie die Deckgläser wieder um und legen Sie sie wieder in die 24 zurück.

Deckgläser gut im Geschirr spülen und dann in einer 150-Mikroliter-Lösung von Sekundärantikörpern inkubieren, die in Blockierungspuffer verdünnt sind, eine Stunde lang bei Raumtemperatur Nach der Inkubation die Deckgläser dreimal mit Waschpuffer waschen. Fixieren Sie die gefärbten RPE one Zellen mit 500 Mikrolitern Methanol, das bei minus 20 Grad Celsius gekühlt wird. Nachdem sich die Zellen 10 Minuten lang fixiert haben, waschen Sie sie dreimal in Waschpuffer.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern von zwei normalen HCL für 30 Minuten. Bei Raumtemperatur neutralisieren Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern eines molaren Tris CL pH acht und waschen Sie die Zellen dreimal. Mit Waschpuffer werden die Zellen mit 200 Mikrolitern Blockpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert

Nach der Blockierung inkubieren Sie die Zellen mit Ratten-Anti-BRDU-Antikörpern und Blockierungspuffer für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius in der befeuchteten Kammer. Bringen Sie die Deckblätter zurück an die 24. Die Zellen gut aufspülen und waschen.

Inkubieren Sie sie anschließend mit einem Sekundärantikörper, der in 150 Mikrolitern Blockierungspuffer verdünnt ist. In einer 24-Well-Schüssel eine Stunde bei Raumtemperatur erhitzen. Waschen Sie dann die Deckgläser dreimal mit einem XPBS-Spot, einem sechs Mikroliter großen Tröpfchen einer Eindecklösung, die das Antifa-Reagenz enthält, auf einem Glasmikroskop.

Schieben Sie einen Deckglas mit der Zellenseite nach unten auf die Montagelösung. Drücken Sie den Deckglas mit einem weichen Reinigungstuch vorsichtig gegen den Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und versiegeln Sie den Deckglas auf dem Mikroskop. Gleiten Sie, indem Sie Nagellack entlang der Kante des Deckglases auftragen.

Verwenden Sie ein 100-faches APO-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4, um die Bilder von BRDU-positiven RPE-1-Zellen bei Raumtemperatur aufzunehmen. Bestimmen Sie die geeignete obere und untere Fokusebene entlang der Z-Achse mit einer Schrittweite von 0,2 Mikrometern und nehmen Sie Bilder entlang der Z-Achse auf. Führen Sie als Nächstes eine Entfaltung aller Bildstapel durch, die entlang der Z-Achse erfasst wurden.

Erhalten Sie die Gesamtintensitätsprojektion jedes Bildes. Stapeln Sie entlang der Z-Achse für Zellen, deren Zentrosomen weniger als zwei Mikrometer voneinander entfernt sind. Zeichnen Sie ein kleines Quadrat von 20 bis 30 Pixeln pro Seite um beide Zentrosomen und markieren Sie den ausgewählten Bereich.

Zeichnen Sie ein größeres Quadrat von 24 bis 35 Pixeln pro Seite um das erste Quadrat und markieren Sie den ausgewählten Bereich des großen Quadrats. Ermitteln Sie dann die Fläche und die Gesamtfluoreszenzintensität jedes Fluorvier. Berechnen Sie in jedem Feld die hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensität jedes Fluoros. Vier.

Zum Schluss erhalten Sie die normierte Fluoreszenzintensität von VDA C3, indem Sie das Verhältnis der hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensität seines Fluoros berechnen. Vier zu dem der Fluoro-Vier, die für die ausgewählten internen Standardbilder verwendet wurden, wurden von zufälligen Feldern asynchron wachsender RPE-1-Zellen aufgenommen, die mit BRDU inkubiert wurden und entweder dem Proteasom-Inhibitor MG one 15 oder dem Kontrolllösungsmittel DMSO und Display-DNA und BRDU enthielten. Der Hintergrund korrigierte die Fluoreszenzintensität entsprechend Centro Somal.

VD drei war in MG 15 behandelten Zellen etwa 2,5-mal höher als in Kontrollzellen, wie dieses Box-and-Whisker-Diagramm zeigt. Als die Daten für die Gesamtfluoreszenz von VD drei gegen die von Gamma-Tubulin normalisiert wurden, nahm die Faltung zu und sank leicht auf etwa das Zweifache. Die VD C3-Färbung an nicht-romalen Zyten oder die zelluläre Gesamtebene von VD drei wurde durch die Proteasom-Hemmung nicht beeinflusst.

Somit wird der romale Pool von VDA C3 durch Proteasom-vermittelten Abbau reguliert. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die Antikörper gegen das Testprotein und den internen Standard in verschiedenen Wirtsspezies erhöht werden müssen und dass die Bilder beider Proben mit identischen Bildgebungsparametern wie der Anzahl der Kaiserschnitte und den Expositionszeiten aufgenommen werden sollten, um den Effekt der digitalen Bildgebung zu minimieren.