Name: Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Lernen Sie einen quantitativen Immunfluoreszenz-Assay zur Messung relativer Proteinlevel an Zentrosomen in fixierten Zellen. Diese Methode nutzt Normalisierung an einem internen Standard.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (GM77311) und einen Startzuschuss von The Ohio Cancer Research Associates (an H.A.F.) unterstützt. SM wurde teilweise durch ein Up on the Roof-Stipendium des Human Cancer Genetics Program des Ohio State University Comprehensive Cancer Center unterstützt.

1. Zellkultur <ol><li> Verwenden menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) verewigt retinalen Pigmentepithelzellen (hTERT-RPE1, die hier als RPE1). HINWEIS: RPE1 Zellen sind nahezu diploiden, nicht-transformierten menschlichen Zellen, die üblicherweise verwendet werden, um die Montage und centriole ciliogenesis studieren. Diese Zellen einer Normal centriole Vervielfältigung Zyklus mit einem geregelten Zellzyklus abgestimmt. </li><li> Passage eine nahezu konfluente 100 mm Zellkulturschale RPE1 Zellen in einer 1: 5 Verdünnung der ursprünglichen Kultur in ein frisches 100-mm-Schale, die 10 ml DME / F-12 (1: 1) -Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (das komplette Medium als DME / F-12-Medium bezeichnet). Wachsen Zellen bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2. <ol><li> Inkubieren Sie 12 mm Runddeckgläschen in 50 ml 1 N HCl in einem abgedeckten Becherglas, O / N ohne Schütteln bei 60 ° C im Wasserbad oder Inkubator. </li><li> After Verwerfen der Säurelösung, waschen Sie die Deckgläser dreimal in 100 ml destilliertem Wasser durch Inkubation für 15 Minuten unter gelegentlichem Schütteln. Wiederholen des Wasch ähnlich in 70% Ethanol und 95% Ethanol. </li><li> Man trocknet die Deckgläser durch individuelles breitet sie auf einer Laborlöschpapier in einer biologischen Sicherheitswerk, gefolgt von einer Sterilisierung mit UV-Strahlung für 60 min. </li></ol></li><li> Zeigen 2-4 trockenen Deckgläser in einer 35 mm-Zellkulturschale. Verdünne die Lösung von Fibronektin oder Fibronektin wie entworfen Polymer (Stammkonzentration von 1 mg / ml) auf eine Konzentration von 25 ug / ml in der Zellkultur PBS. <ol><li> Zeigen 80-100 ul der verdünnten Lösung auf jedes Deckglas und Inkubation für 60 min zur Beschichtung der Oberseite des Deckglases. Dreimal mit PBS vor der Zugabe Vollmedium Waschen Sie die Deckgläser. </li></ol></li></ol> 2. Wachsende Zellen und Behandlung von Zellen mit Proteasom-Inhibitoren <ol><li> Durchgang 2 x 10 5 asynchron wachsening RPE1 Zellen in jeder 35 mm Schale mit Deckgläsern und wachsen die Zellen in 2 ml Vollmedium. Tauschen Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden mit frischem vorgewärmten Vollmedium. <ol><li> Um die Wirkung der Proteasom-Hemmung auf die zentrosomale Ebene des Testproteins zu analysieren (hier VDAC3 oder γ-Tubulin), wachsen die Zellen in zwei 35-mm-Schalen für 44 Std. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit Vollmedium und fügen entweder MG115 oder DMSO als Kontrolle Lösungsmittel bei einer Endkonzentration von 5 uM oder 0,05% zu. Zur gleichen Zeit wird in BrdU zu den Zellen bei einer Endkonzentration von 40 uM und inkubieren Zellen 4 Stunden. </li><li> Übertragen Sie jede Deckglas in einer 24-Well-Platte. Fügen Sie 500 ul gekühltem Methanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 20 ° C für 10 Minuten, um die Zellen auf den Deckgläsern zu beheben. Dreimal mit 500 ul Waschpuffer Sofort die Deckgläser (1x PBS, enthaltend 0,5 mM MgCl 2 und 0,05% Triton-X 100). </li></ol></li><li> Ernten Sie die RestZellen von der 35 mm-Schale und Zentrifugation der Zellen bei 1000 × g für 5 min. Verwenden Sie das Zellpellet, das Gesamtprotein durch Western Blot (Schritt 6) analysieren. </li></ol> 3. BrdU Puls und Chase Assay auf Proteinebene in verschiedenen Zellzyklusphasen Analysieren <ol><li> Um die Variation des Niveaus eines Proteins (hier VDAC3, SAS6 oder Cep135) an Zentrosomen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu analysieren, wachsen Zellen, die in zwei 35-mm-Schalen mit Deckgläschen für 44 Std. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit komplettem Medium, das 40 &amp; mgr; M BrdU und inkubieren Sie die Zellen 4 h im Zellkulturbrutschrank. </li><li> Von einem Gericht, übertragen Sie die Deckgläser auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die Zellen mit gekühltem Methanol fixieren, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. </li><li> Nach 4 h BrdU puls, entfernen Sie den BrdU-enthaltenden Medium, Waschen der Zellen einmal mit PBS und einmal mit komplettem Medium, fügen frisches Medium und dann wachsen die Zellen in Abwesenheit von BrdU für verschiedene Zeiten (in der Regel weitere 4 hfür RPE1 Zellen) vor Fixierung der Zellen wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. HINWEIS: Für RPE1 Zellen die Mehrzahl der BrdU-positiven Zellen im späten S oder G2-Phase nach einer 4 Stunden Chase. Dies muss unabhängig für jeden Zelltyp bestimmen. </li></ol> 4. Immunfärbung <ol><li> Inkubieren der fixierten Zellen auf Deckgläsern in 200 ul Blockierungspuffer (2% BSA und 0,1% Triton X-100 in 1 × PBS) für 30 min. <ol><li> Inkubieren der Zellen mit einer Mischung aus primären Antikörper (üblicherweise einen in Kaninchen aufgezogen und in der Maus eine andere angehoben) in Blockierungspuffer O / N bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer verdünnt. </li><li> Um einen feuchten Kammer zu machen, setzen Sie einen nassen Papiertuch in der unteren Hälfte eines leeren 1.000 ul Pipettenspitze ein. Verlegen eines Streifens aus Parafilm auf dem Gestell Oberfläche und vor Ort eine Tröpfchen (15-20 ul) der Antikörperlösung auf die Parafilm für jedes Deckglas inkubiert werden. Kehren Sie ein Deckglas auf einem Tropfen Antikörperlösung (so dass die Zellen eingetaucht) und in der Näheder Deckel des Spitzenfeld. </li><li> Invert Deck wieder und bringt sie zurück in die Schale mit 24 Vertiefungen. Waschen Deckgläser und dann inkubieren in 150 &amp; mgr; l sekundärem Antikörper Gemisch (hier grün fluoreszierenden Farbstoff konjugierten anti-Kaninchen und roten Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Anti-Maus in Blockierungspuffer verdünnt) für 1 h bei RT. Dreimal Waschen Sie die Deckgläser. HINWEIS: Die fluorophorkonjugierten Sekundäre Antikörper sind lichtempfindlich. Schützen Sie die Proben vor Licht während der Schritte 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Planen für Anti-BrdU-Färbung durch Fixierung der gefärbten RPE1 Zellen wiederum mit 500 ul gekühltem Methanol bei -20 ° C für 10 min, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. Dreimal Waschen Sie die Deckgläser. ANMERKUNG: Diese Fixierung sichert die primäre und sekundäre Antikörpermarkierung des Proteins (e) von Interesse während der Säurehydrolyse Prozess im folgenden Schritt. <ol><li> Inkubieren der Zellen in 200 ul 2 N HCl für 30 min bei RT. Neutralisieren mit 300 ul 1 M Tris-Cl, pH 8 eind waschen Sie die Zellen dreimal mit Waschpuffer. </li><li> Blockieren die Zellen wiederum mit 200 ul Blockierungspuffer für 30 Minuten bei RT. </li><li> Inkubieren der Zellen mit Ratten-anti-BrdU-Antikörper für 45 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer (in Blockierungspuffer verdünnt). Bringen Sie die Deckgläser zurück in die Schale mit 24 Vertiefungen, waschen Sie sie dann mit blau-fluoreszierenden Farbstoff konjugierten Anti-Ratten-Sekundärantikörper (in 150 ul Blockierungspuffer in Schale mit 24 Vertiefungen für 1 h bei RT verdünnt inkubiert. </li></ol></li><li> Dreimal Waschen Sie die Deckgläser. Spot eine Tröpfchen (ungefähr 3-6 &amp; mgr; l) einer Lösung, die Montage verblassungshemmenden Reagenz auf einem Glasobjektträger. Kehren Sie ein Deckglas mit der Zellseite nach unten, auf die Montagelösung. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Eindrücken der Deckglas gegen den Schieber mit einem weichen Reinigungstuch. Bewerben transparentem Nagellack am Rand des Deckglases, um es auf dem Objektträger zu versiegeln. </li></ol> 5. Immunfluoreszenzbild ACQUisition und Analyse <ol><li> Verwenden Sie einen Plan Apo 100X Ölimmersionsobjektiv (mit einem 1,4 numerische Apertur), um die Bilder von BrdU-positiven Zellen RPE1 bei Raumtemperatur erhalten. <ol><li> Setzen Sie einen Dia am Mikroskop (siehe Anlagen) mit einer Kamera in der Lage, digitale Bildbearbeitung angebracht. Für jeden Fluorophor, die geeignete Belichtungszeit (in der Regel zwischen 300-1000 ms) durch die manuelle Prüfung aller Proben eines Experiments. Vor dem Erfassen von Bildern einer Zelle, manuell die geeignete obere und untere Brennebene entlang der Z-Achse (in der Regel 0,2 um Schrittgröße). Erwerben Bilder unterschiedlicher Proben, die auf separaten Deck mit gleicher Belichtungszeit für verschiedene Fluorophore entlang der Z-Achse unter Verwendung eines digitalen Mikroskopie Softwarepaket sind. </li></ol></li><li> Führen Entfaltung (in diesen Fällen mit Nicht-Nachbar-Algorithmus) aller entlang der Z-Achse aufgenommenen Bildstapeln. <ol><li> Ermitteln Sie die Gesamtintensität Projektion jedes Bildstapel entlangdie Z-Achse. </li></ol></li><li> In Zellen, in denen Zentrosomen nahe (Abstand zwischen zwei Zentrosomen weniger als 2 um), zeichnen Sie einen kleinen Platz (in der Regel 20 bis 30 Pixel pro Seite) um die beiden Zentrosomen und markieren Sie den ausgewählten Bereich. <ol><li> Zeichnen Sie einen größeren Platz (in der Regel 24 bis 35 Pixel pro Seite) um den ersten Platz und markieren Sie den ausgewählten Bereich des großen Platz. </li><li> Erhalten die Fläche (A) und der Gesamtfluoreszenzintensität (F) jedes Fluorophor in jedem Feld (S bezeichnet kleine Box und L großen Kasten). </li><li> Analysieren Sie den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität jeder Fluorophor mit dem von Howell et al 29 beschriebenen Formel:. F = F S - [(F L - F S) x Ein S / (A L - A S)]. </li><li> Erhalten des normierten Fluoreszenzintensität des Proteins von Interesse (hier VDAC3 oder SAS6) durch Berechnen des Verhältnisses des hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensität der fluorophore derjenigen des Fluorophors für den gewählten internen Standards (hier γ-Tubulin SAS6 oder Cep135) verwendet. </li></ol></li><li> Im Fall der Analyse von Zellen, in denen Zentrosomen gut voneinander getrennt (Abstand zwischen zwei Zentrosomen größer als 2 &amp; mgr; m), Analyse jedes Zentrosomen separat indem zwei getrennte Sätze von Kästen. Zeichnen Sie einen kleinen Platz (in der Regel 15 bis 25 Pixel pro Seite) um jede Zentrosom und markieren Sie den ausgewählten Bereich. Zeichnen Sie einen größeren Platz (20-30 Pixel pro Seite) um den ersten Platz und markieren Sie den ausgewählten Bereich. <ol><li> Erhalten die Fläche (A) und der Gesamtfluoreszenzintensität (F) jedes Fluorophor in jedem Feld, und berechnen die hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Fluorophor getrennt für jede Zentrosomen, wie in Schritt 5.3.3 beschrieben. </li><li> Kombinieren Sie die hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensitäten jedes Proteins aus den beiden Zentrosomen, die Gesamt zentrosomale Niveau dieses Proteins in der Zelle zu erhalten. </li><li> Bezugsquellen für dasnormalisierte Intensität für das Protein von Interesse durch Berechnen des Verhältnisses der Gesamt zentrosomalen Intensität zu der Gesamt zentrosomalen Intensität des internen Standards. </li></ol></li><li> Analysieren Sie mindestens 15 bis 25 Zellen für jede Versuchsbedingung und den Graphen in einer Tabellenkalkulation. </li></ol> 6. Analyse des Gesamtproteins durch Western Blot <ol><li> Die Zellen in Radioimmunopräzipitation Assays (RIPA) Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und Inkubation für 10 min auf Eis um die Zellen zu lysieren. <ol><li> Zentrifugieren der Mischung bei 10.000 × g für 10 min trennen das Lysat aus der Pelletfraktion und messen die Gesamtproteinkonzentration von jedem Lysat mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Assay-Kit. </li></ol></li><li> Mischungs 40 ug Lysat mit 4x SDS-PAGE-Beladungspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 100 mM Dithiothreitol, 0,1% BromPhenol blau). <ol><li> Kochen Sie die Proben für 10 Minuten und führen Sie die Proben auf einem 12,5% igen denaturierenden SDS-PAGE mit einer konstanten Spannung von 200 V. </li></ol></li><li> Transfer der Proteine ​​auf SDS-PAGE getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung von Western-Blot-Technik (bei einer konstanten Spannung von 90 V für 1 Stunde in kaltem). <ol><li> Blockieren der Membran mit 3% fettfreier Milch in 1x PBS, und dann Inkubieren der Membran mit Lösungen von verdünnten primären Antikörper (in diesem Fall Kaninchenanti VDAC3, Kaninchen-Anti-γ-Tubulin und Maus-anti-α-Tubulin) 1 h bei RT. </li><li> Nach dem Waschen der Membran dreimal (jeweils 5 min Inkubation unter Schütteln) unter Verwendung von PBS-T-Puffer (1 × PBS und 0,2% Tween-20), Inkubation der Membran in eine Mischung von im nahen Infrarotbereich (IR) Fluoreszenzfarbstoff konjugierten anti-Kaninchen und IR Fluoreszenzfarbstoff konjugierten anti-Maus-Sekundärantikörper für 1 Stunde (in PBS-T verdünnt). </li><li> Dreimal Waschen Sie die Membran und scannen Sie dann die Membran, um die Bänder zu analysieren mit einem Infrarot-fluorescence Bildsystem für Immunoblot-Detektion. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Quantitative Mikroskopie in der Zellbiologie wird häufig mit Live-Cell-Imaging-Assays wie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Recovery After Photobleaching verbunden (FRAP) usw. Allerdings gibt es wachsende Beispiele für Zellbiologen entwickeln verschiedene quantitative Mikroskopie Assays für feste Zellen in den letzten Jahren 27,34-36. Wichtig ist, dass Fortschritte im Verständnis der Biologie Zentrosom häufig erfordert Verständnis der Zentrosom spezifische Funktion von Prote...

Zentrosomen bestehen aus einem Paar von Centriolen pericentriolar Material (PCM) umgeben ist. Als die großen Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) in Säugerzellen dienen Zentrosomen als die beiden Pole der mitotischen Spindel in sich teilenden Zellen, und damit zur Erhaltung der genomischen Integrität ein. In ruhenden Zellen (zB während G0-Phase), einer der beiden Centriolen der Zentrosomen, nämlich die Mutter centriole, wird in eine Basaltemperatur transformiert, um die primären Zilien, einen sensorischen Organelle aus der Zelloberfläche herausragen 2 zusammenzubauen. Sobald die Zellen erneut in den Zellzyklus werden die primären Zilien zerlegt und jedes centriole lenkt den Zusammenbau eines procentriole an seinem proximalen Ende, die sich allmählich verlängert, um eine reife centriole 3 bilden. Zu Beginn der S-Phase wird ein Wagenrad artigen Struktur, die das 9-fache Symmetrie um Centriols stellt auf der Oberfläche eines jeden vorhandenen centriole gebildet und wird die Basis jedes procentriole geworden. SAS6 tHut ist unverzichtbar für centriole Baugruppe wird eingestellt, um die Nabe der Wagenrad 4-6 zu bilden. Andere centriolar Proteine ​​werden dann auf das Wagenrad in einem stark reguliert, von proximal nach distal Weise 7 montiert. Nach genau Abschluss centriole Vervielfältigung, Zellen zusammen zusätzliche pericentriolar Materialien zu zwei Funktions Zentrosomen bis Ende G2-Phase 8 bauen. Neben den Kern centriolar Komponenten 9-11, mehrere andere Proteine ​​einschließlich Kinasen, Phosphatasen, Chaperone, Gerüstteile, membranassoziierte Proteine ​​und Abbaumaschinen mit Centriolen, Basalkörpern und PCM zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus 12-16 verbunden. Es wird oft festgestellt, dass die zentrosomale Ebenen vieler Proteine ​​sind zeitlich um zentrosomale Targeting-Mechanismen und / oder auf den proteasomalen Abbau Zentrosomen geregelt. Wichtig ist, dass die Schwankungen der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine ​​wie Plk4, Mps1, SAS6 und CP110 eint unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint entscheidend centriole Anordnung 5,17-22 regulieren zu können, und im Falle von Mps1 Verhinderung dieser zentrosomalen Abbau führt zur Bildung von überschüssigem Centriolen 19. Andererseits sind die zentrosomalen Fraktionen von mehreren Proteinen weniger labil gegenüber cytosolischen Pools. Zum Beispiel Herunterregulierung der Centrin 2 (Cetn2) siRNA-vermittelte führte nur zu einem moderaten Rückgang der Protein-Ebene an den Zentriolen trotz großer Verminderung seiner ganzen Zelle Ebenen 23. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Änderungen in der Ebene der zentrosomalen Proteine ​​am Centrosom anstelle der Messung der Gesamtzellproteinspiegel bei der Bewertung ihrer Zentrosomen spezifische Funktionen zu messen. In dieser Studie haben wir einen Test unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenz (IIF), das relative Niveau eines Proteins an Zentrosomen zu quantifizieren. Dieser Test ist besonders entwickelt, um Zellen, die aus verschiedenen Proben zu analysierenund können daher nicht gleichzeitig abgebildet werden. Diese Proben können die Zellen, die mit verschiedenen Reagenzien (dh Medikament gegen Kontrolle), die zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, behandelt wurden (dh Pulsgegen chase) oder in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich und um diesen Wert gegen den gleichen für ein anderes Protein, deren Pegel nicht unter den gewählten experimentellen Bedingungen variieren normalisieren. Mehrere Studien in Biologie Zentrosom vor kurzem benutzt verschiedene quantitative Mikroskopie-Techniken, in beiden Live-oder fixierten Zellen, um das Zentrosom-spezifische Funktion der Kandidatenproteine ​​24-27 bestimmen. Ähnlich den Tests misst die vorliegende Technik auch den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität des Testproteins. Jedoch würde die Einbeziehung der Normalisierung mit internem Standard in diesem Test wahrscheinlich größer anbietenGenauigkeit und Sicherheit bei der Analyse von zwei verschiedenen Proben, die auf zwei verschiedenen Deckgläser sind. Ferner, zusätzlich zu der Prüfung des Protein-Ebene zu Zentrosomen, mit geringfügigen Anpassungen dieses Verfahren kann auf einen unterschiedlichen Satz von Testbedingungen oder in anderen zellulären Stellen aufgebracht werden. Dabei kombinieren wir unsere quantitativen Mikroskopie Assay mit einem BrdU Pulse-Chase-Strategie, um Zellen aus verschiedenen Zellzyklusphasen zu vergleichen. Anstelle der Verwendung von Standard-Zellzyklusarrest und Trenntechniken, um verschiedene Zellzykluszeitpunkten zu untersuchen, asynchron wachsenden Zellen werden mit BrdU inkubiert, um Zellen in die S-Phase zu kennzeichnen, und die markierten Zellen werden für unterschiedliche Zeiten (typischerweise 4-6 Stunden) verfolgt. Die meisten der markierten Zellen in S-Phase unmittelbar nach dem Impuls sein. Die Länge der Lauflicht wird so gewählt, daß nach dem Chase werden markierte Zellen in späten S, G2 oder Mitose voranzuschreiten, was durch morphologische Merkmale wie-Position Zentrosomen bezüglich nuc prüft werden könnenleu, Abstand zwischen Zentrosomen, Kondensation Chromosomen usw. Somit kann die Länge des den Punkt von der mittleren Dauer der S, G2 und M Phase einen bestimmten Zelltyp. Da dieser Ansatz vermeidet Zellzyklus-Inhibitoren, wie Hydroxyharnstoff, Aphidicolin, Nocodazol usw., erlaubt es eine physiologisch relevante Zellzyklusanalyse. Somit zeigen wir hier, dass die quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay allein oder in Kombination mit BrdU Pulse-Chase-Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um die relativen Änderungen der zentrosomalen Pegel eines Kandidatenprotein während einer ungestörten Zellzyklus genau zu messen. Wir maßen die zentrosomale Niveau VDAC3, ein Protein, das wir an Zentrosomen zusätzlich kürzlich identifizierten Mitochondrien 16,28, mit diesen Tests. Ergebnisse hier erzielt überprüfen unseren früheren Beobachtungen, dass der Pool von zentrosomale VDAC3 durch Abbau reguliert und variiert ebenfalls in einer Zellzyklus dependent Weise 16, ferner die Validierung der Anwendbarkeit dieses Verfahrens.

<table><tbody><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Bestand von 1 mg/ml in Wasser</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Bestand von 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Bestand von 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-Tubulin (Maus monoklonal, Klon GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in IIF-Blockierungspuffer&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (polyklonales Kaninchen) &nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF-Blocking-Puffer, 1:1.000 in WB-Blocking-Puffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (monoklonale Maus)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (Kaninchen polyklonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (Ratte monoklonal)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 Zoll IIF-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Ziege Anti-Ratte IgG (H+L)Life-Technologien</td><td></td> <td>A21093</td><td>1:200 Zoll IIF-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologien</td><td>A21202</td><td>1:1.000 Zoll IIF-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologien</td><td>A21203</td><td>1:1.000 in IIF Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>1:1.000 in IIF Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td>1:1.000 in IIF Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-Tubulin (Kaninchen polyklonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1.000 in WB Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Anti-&#945;-Tubulin (Maus monoklonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20.000 in WB-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10.000 in WB Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Maus IgG (H& L) Antikörper IRDye800CW Konjugierte</td><td>Rockland-Antikörper</td><td>610-731-002</td><td>1:10.000 in WB-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade-Reagenz</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Eindeckmedien</td></tr><tr><td>Runde Deckgläser 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR-Kamera</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo Öl-Immersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td></td><td>1,4 mit numerischer Apertur</td></tr><tr><td>Diabook-Softwarepaket</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninsäure (BCA) Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Schmaler UV-Würfel</td><td>Olympus</td><td>U-M622</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Schmal Blau</td><td>Würfel Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Schmal Grün Würfel</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

quantitative immunfluoreszenz-assay, um die variation der protein-ebene an zentrosomen messen

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Zentrosomen sind kleine, aber wichtige Organellen, wie die Pole der mitotischen Spindel, um genomische Integrität aufrecht zu erhalten oder zu montieren primären Zilien der Sinnesfunktionen in Zellen zu erleichtern dienen. Der Pegel eines Proteins kann unterschiedlich an Zentrosomen als an anderen Orten .cellular reguliert werden, und die Variation in der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine ​​an unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint für die richtige Regulierung der centriole Anordnung sein. Wir entwickelten eine quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay, der relativen Änderungen der Pegel eines Proteins an Zentrosomen in fixierten Zellen aus verschiedenen Proben, wie in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder nach der Behandlung mit verschiedenen Reagenzien misst. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich, und zu normalisieren, dass die Messung an der gleichen für ein anderes Protein, das nicht unter den gewählten Versuchs c nicht ändertondition. Unter Verwendung dieses Assays in Kombination mit BrdU Impuls und chase Strategie zur ungestörten Zellzyklen zu untersuchen, haben wir quantitativ durch Proteasom-vermittelten Abbau speziell an Zentrosomen validiert unserer jüngsten Beobachtung, daß die zentrosomalen Pool von VDAC3 an Zentrosomen während des Zellzyklus reguliert wird, wahrscheinlich.

Unsere jüngsten Studien identifiziert neuartige zentrosomale Lokalisation und Funktion von VDAC3, einer der mitochondrialen Porine 16,28. Die Immunfärbung von mehreren Säugerzellen, einschließlich RPE1 Zellen unter Verwendung eines VDAC3-spezifischen Antikörper zeigte prominente zentrosomale Färbung und vergleichsweise schwachen mitochondrialen Färbung. Wir haben auch gezeigt, dass zentrosomale VDAC3 wird vorzugsweise mit der Mutter centriole und der zentrosomale Pool sowohl der endogenen und ektopische Expre...

Hier wird ein neuartiger quantitativer Fluoreszenzassay entwickelt, um Änderungen des Spiegels eines Proteins spezifisch an Zentrosomen zu messen, indem die Fluoreszenzintensität dieses Proteins auf die eines geeigneten internen Standards normalisiert wird.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die relativen Veränderungen des Spiegels eines Proteins an Zentrosomen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. So wird dies beispielsweise zu einem bestimmten Zeitpunkt im Zellzyklus nach Hemmung des Proteasoms erreicht, indem Zellen, die auf Deckgläsern wachsen, zunächst entweder mit dem Proteasom-Inhibitor MG one 15 oder mit dem Kontrolllösungsmittel DMSO behandelt werden. Dann sofort BRDU zu beiden Zellen hinzufügen und sie vier Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren.Der zweite Schritt besteht darin, die Deckgläser auf eine 24-Well-Platte zu übertragen, um die Zellen zu fixieren. Anschließend werden die Zellen mit Antikörpern gegen BRDU und die interessierenden Proteine und anschließend mit entsprechenden Sekundärantikörpern gefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, Bilder von BRDU-positiven Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer digitalen Bildgebungssoftware aufzunehmen, um die gleiche Belichtungszeit und Länge der Z-Achse auf die Zellen jeder Probe anzuwenden.Anschließend werden die Bilder analysiert, um den relativen Pegel von romal VDA C3 zu quantifizieren. Letztendlich wird mit Hilfe der quantitativen Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt, dass der somale Centro-Pool von VDA C3 um das Doppelte erhöht wird, wenn das Proteasom während der S-Phase gehemmt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Durchflusszytometrie, Immunblot oder quantitativem Mikroskop besteht darin, dass diese Technik den relativen Spiegel des Proteins in zwei unterschiedlich behandelten Proben analysiert, die auf zwei verschiedenen Deckgläsern verarbeitet werden. Diese Methode verwendet eine Normalisierung auf einen internen Standard, um die Notwendigkeit zu kontrollieren, die beiden experimentellen Zellpopulationen zu verarbeiten.Unabhängig davon kann diese Methode jedoch Einblicke in die Regulation bestimmter Proteine an Zentrosomen geben. Es kann auch auf andere Situationen angewendet werden, z. B. auf andere subzelluläre Strukturen oder die Untersuchung bestimmter Proteinpools, die an mehreren Stellen innerhalb der Zelle zu finden sind. Vorführen des Verfahrens wird schu majumder, ein Postdoc aus meinem Labor. Um das Experiment zu beginnen, durchlaufen Sie zweimal 10 bis fünf asynchron züchtende RPE-Zellen in zuvor vorbereitete 35-Millimeter-Schalen mit Decklippen und züchten Sie die Zellen in zwei Millilitern vollständigem Medium.Ersetzen Sie das Nährmedium alle 24 Stunden durch frisches Vorwärmmedium Nach 44 Stunden. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein vollständiges Medium, das 0,05 % DMSO oder MG eins 15 bei einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren enthält, und fügen Sie den Zellen gleichzeitig BRDU in einer Endkonzentration von 40 Mikromolaren hinzu. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang. Übertragen Sie als Nächstes jeden Deckglas auf eine 24-Well-Platte.Geben Sie 500 Mikroliter vorbearbeitetes Methanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius, um die Zellen zu fixieren. Waschen Sie die Einbezugsschlüsse nach 10 Minuten sofort dreimal mit 500 Mikrolitern Waschpuffer. Inkubieren Sie die fixierten Zellen auf einer Abdeckung und geben Sie 30 Minuten lang 200 Mikroliter Blockierungspuffer hinein, während die Zellen inkubiert werden.Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor, indem Sie ein feuchtes Papiertuch in die untere Hälfte einer leeren 1000-Mikroliter-Pipettenspitzenbox legen. Legen Sie einen Streifen Parfum auf die Oberfläche des Racks und geben Sie ein 20-Mikroliter-Tröpfchen des Kaninchen-Anti-V-DDA-Drei- und des Maus-Anti-Gamma-Tubulin-Antikörpers, verdünnt in Blocking-Puffer, auf das Paraform. Nach dem Blockieren wird auf jedes Tröpfchen der Antikörperlösung ein Deckglas umgedreht.Stellen Sie sicher, dass die Zellen eingetaucht sind, und schließen Sie den Deckel der Tippbox. Inkubieren Sie die Zellen mit Primärantikörpern über Nacht bei vier Grad Celsius in der befeuchteten Kammer. Drehen Sie die Deckgläser wieder um und legen Sie sie wieder in die 24 zurück.Die Deckgläser gut im Geschirr spülen und dann in einer 150-Mikroliter-Lösung von Sekundärantikörpern inkubieren, die in Blockierungspuffer verdünnt sind, eine Stunde lang bei Raumtemperatur Nach der Inkubation die Deckgläser dreimal mit Waschpuffer waschen. Fixieren Sie die gefärbten RPE one Zellen mit 500 Mikrolitern Methanol, das bei minus 20 Grad Celsius gekühlt wird. Nachdem sich die Zellen 10 Minuten lang fixiert haben, waschen Sie sie dreimal in Waschpuffer.Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern von zwei normalen HCL für 30 Minuten. Bei Raumtemperatur neutralisieren Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern eines molaren Tris CL pH acht und waschen Sie die Zellen dreimal. Mit Waschpuffer werden die Zellen mit 200 Mikrolitern Blockpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert.Nach der Blockierung inkubieren Sie die Zellen mit Ratten-Anti-BRDU-Antikörpern und Blockierungspuffer für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius in der befeuchteten Kammer. Bringen Sie die Deckblätter zurück an die 24. Die Zellen gut aufspülen und waschen.Inkubieren Sie sie anschließend mit einem Sekundärantikörper, der in 150 Mikrolitern Blockierungspuffer verdünnt ist. In einer 24-Well-Schüssel eine Stunde bei Raumtemperatur erhitzen. Waschen Sie dann die Deckgläser dreimal mit einem XPBS-Spot, einem sechs Mikroliter großen Tröpfchen einer Eindecklösung, die das Antifa-Reagenz enthält, auf einem Glasmikroskop.Schieben Sie einen Deckglas mit der Zellenseite nach unten auf die Montagelösung. Drücken Sie den Deckglas mit einem weichen Reinigungstuch vorsichtig gegen den Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und versiegeln Sie den Deckglas auf dem Mikroskop. Gleiten Sie, indem Sie Nagellack entlang der Kante des Deckglases auftragen.Verwenden Sie ein 100-faches APO-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4, um die Bilder von BRDU-positiven RPE-1-Zellen bei Raumtemperatur aufzunehmen. Bestimmen Sie die geeignete obere und untere Fokusebene entlang der Z-Achse mit einer Schrittweite von 0,2 Mikrometern und nehmen Sie Bilder entlang der Z-Achse auf. Führen Sie als Nächstes eine Entfaltung aller Bildstapel durch, die entlang der Z-Achse erfasst wurden.Erhalten Sie die Gesamtintensitätsprojektion jedes Bildes. Stapeln Sie entlang der Z-Achse für Zellen, deren Zentrosomen weniger als zwei Mikrometer voneinander entfernt sind. Zeichnen Sie ein kleines Quadrat von 20 bis 30 Pixeln pro Seite um beide Zentrosomen und markieren Sie den ausgewählten Bereich.Zeichnen Sie ein größeres Quadrat von 24 bis 35 Pixeln pro Seite um das erste Quadrat und markieren Sie den ausgewählten Bereich des großen Quadrats. Ermitteln Sie dann die Fläche und die Gesamtfluoreszenzintensität jedes Fluorvier. Berechnen Sie in jedem Feld die hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensität jedes Fluoros. Vier.Zum Schluss erhalten Sie die normierte Fluoreszenzintensität von VDA C3, indem Sie das Verhältnis der hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensität seines Fluoros berechnen. Vier zu dem der Fluoro-Vier, die für die ausgewählten internen Standardbilder verwendet wurden, wurden von zufälligen Feldern asynchron wachsender RPE-1-Zellen aufgenommen, die mit BRDU inkubiert wurden und entweder dem Proteasom-Inhibitor MG one 15 oder dem Kontrolllösungsmittel DMSO und Display-DNA und BRDU enthielten. Der Hintergrund korrigierte die Fluoreszenzintensität entsprechend Centro Somal.VD drei war in MG 15 behandelten Zellen etwa 2,5-mal höher als in Kontrollzellen, wie dieses Box-and-Whisker-Diagramm zeigt. Als die Daten für die Gesamtfluoreszenz von VD drei gegen die von Gamma-Tubulin normalisiert wurden, nahm die Faltung zu und sank leicht auf etwa das Zweifache. Die VD C3-Färbung an nicht-romalen Zyten oder die zelluläre Gesamtebene von VD drei wurde durch die Proteasom-Hemmung nicht beeinflusst.Somit wird der romale Pool von VDA C3 durch Proteasom-vermittelten Abbau reguliert. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die Antikörper gegen das Testprotein und den internen Standard in verschiedenen Wirtsspezies erhöht werden müssen und dass die Bilder beider Proben mit identischen Bildgebungsparametern wie der Anzahl der Kaiserschnitte und den Expositionszeiten aufgenommen werden sollten, um den Effekt der digitalen Bildgebung zu minimieren.

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung des transportierten infizierten Zellproteins 0, ICP0 bei einer Herpes-simplex-Virus-1-Infektion. Nach der De-novo-Synthese transloziert ICP0 in den Zellkern und wandert später während des Fortschreitens der Infektion in das Zytoplasma. Die Immunfluoreszenzmikroskopie enthüllt und analysiert die subzelluläre Lokalisation des Proteins und bietet Einblicke in seinen Transport über Infektionsphasen hinweg.

Eine Immunfluoreszenztechnik zur Lokalisierung viraler Proteine in infizierten Zellen

Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt.

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Wir haben eine Strategie, um zu reinigen und Bild eine große Anzahl von Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen für Höchstauflösung Mikroskopie und Single-Teilchen im Durchschnitt entwickelt.

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.

Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Diese Methode beschreibt ein Immunfluoreszenzprotokoll und eine Quantifizierungspipeline zur Bewertung der Proteinverteilung mit unterschiedlichen Kernorganisationsmustern in humanen T-Lymphozyten. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, beginnend bei der Probenvorbereitung über die Durchführung halbautomatischer Analysen in Fidschi bis hin zur Datenverarbeitung durch ein Google Colab-Notebook.

Eine vielseitige Pipeline für die Analyse dynamischer Veränderungen in Kernkörpern in einer Vielzahl von Zelltypen

Lernen Sie einen quantitativen Immunfluoreszenz-Assay zur Messung relativer Proteinlevel an Zentrosomen in fixierten Zellen. Diese Methode nutzt Normalisierung an einem internen Standard.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

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