Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die effiziente Generierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) von Patienten mit Muskeldystrophie, beginnend mit Urinzellkulturen und einer integrationsfreien Reprogrammierungsmethode. Dies wird erreicht, indem zunächst Urinproben von Patienten mit Muskeldystrophie entnommen werden. In einem zweiten Schritt werden die Urinzellen isoliert und in aus dem Urin gewonnene Zellkulturen expandiert.

Als nächstes werden die aus dem Urin gewonnenen Zellen mit dem Sendai-Virus transduziert, das Yamanaka-Faktoren enthält, und nach 12 Tagen entstehen typische pluripotente Kolonien. Letztendlich kann durch Passage 13 der transgene freie Zustand der pluripotenten Stammzellen durch R-T-P-C-R-Analyse bestätigt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Reprogrammierung isolierter Hautfibroblasten mit lentiviralen Vektoren besteht darin, dass mit dieser Technik die somatischen Zellen nicht-invasiv von Patienten gewonnen und zur effizienten Erzeugung der IPCs unter Verwendung einer Zero-Footprint-Methode der viralen Reprogrammierung verwendet werden können.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Muskeldystrophie zu beantworten, z. B. wie diese Bedingungen in vitro modelliert werden können, ohne dass Sicherheitsbedenken für die Anwendung beim Menschen bestehen. Mohammad Zishan Al, ein Postdoktorand, Courtney Guesting, eine Technikerin, und Melanie Ryder, Doktorandin, alle drei aus meinem Labor, werden die Verfahren demonstrieren. Um eine Urinprobe zu entnehmen, raten Sie dem Patienten zunächst, 30 Minuten vor der Entnahme Flüssigkeit zu trinken, um sicherzustellen, dass etwa 30 bis 40 Milliliter Urin gesammelt werden können. Wenn der Patient bereit ist, geben Sie ihm ein Urinsammelset mit den folgenden Artikeln, schriftlichen Anweisungen zum Erhalt steriler oder sauberer, griffigerer und feuchter antibakterieller Toiletten und einem sterilen 100-Milliliter-Probenentnahmebecher

Wenn die Probe entnommen wurde, stellen Sie den Auffangbecher sofort auf Eis und bringen Sie die Probe in einem Kühler ins Labor. Verwenden Sie dann sterile Pipetten, um die Urinprobe in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen, und drehen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400-fachem G. Als nächstes wird in einer BSL eine biologische Sicherheitswerkbank bis auf den letzten Milliliter des Überstands abgesaugt, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird.

Anschließend waschen Sie die Zellen in sieben Millilitern Waschpuffer und schleudern die Zellen wieder herunter. Diesmal werden bis auf die letzten etwa 0,2 bis 0,5 Milliliter des Überstands abgesaugt. Verwenden Sie nun das Pellet in zwei bis drei Millilitern Urinvorläuferzelle oder UPC-Medium wieder und überführen Sie die Suspension nach 72 Stunden in vier bis sechs Vertiefungen einer unbeschichteten 24-Well-Platte, ergänzen Sie die Kultur mit 0,5 Millilitern frischem UPC-Medium pro Well.

Überwachen Sie die Kultur zwischen vier und sechs Tagen nach der Inkubation. Es sollten beginnen, kleine zwei- bis vierzellige Kolonien von abgerundeten oder länglichen Zellen zu erscheinen, die Nierenepithelzellen vom Typ 1 bzw. vom Typ zwei darstellen. Wechseln Sie das Medium weiterhin alle zwei bis drei Tage.

Da die Kolonien nach etwa neun bis 15 Tagen Kultur eine schnelle Expansionsphase durchlaufen, sollten die Zellen zu diesem Zeitpunkt zu 80 bis 90 % konfluent sein, teilen Sie die Zellen für die weitere Expansion auf zwei bis vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte auf. Wenn diese Kultur als Zellpassage eins markiert wird, können die Urinzellen dann durch durchflusszytometrische Analyse, immunhistochemische Färbung oder durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion auf linienspezifische Marker charakterisiert werden, um eine hocheffiziente Reprogrammierung auf Tage vor dem Transduktionskeim, 60.000 Zellen pro Well, zu gewährleisten. Von einer Passage eins bis fünf Kultur in zwei Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen am Tag Null.

Bereiten Sie den Sendai-Reprogrammierungsvektor vor, indem Sie jeden der vier OSKM-Faktoren an einem geeigneten MLI für die Reprogrammierung zu einem Milliliter vorwarmem UPC-Medium hinzufügen, das Suspense-Medium aspirieren und die Virussuspension für die nächsten sechs Tage langsam in eine Vertiefung der Urinzellen geben. Ersetzen Sie den Überstand täglich durch frisches UPC-Medium, am fünften Tag wird mit Mitomycin-Samen behandeltes MES auf gelatinebeschichtete 100-Millimeter-Quadratkulturschalen am sechsten Tag aufgebracht. Dissoziieren Sie die Urinzellen mit Trypsin, resuspendieren Sie sie in UPC-Medium und plättieren Sie sie mit fünfmal 10 der vierten bis zweimal 10 der fünften Zellen pro Meth-Feeder-Platte.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das UPC-Medium durch das humane Embryonalstadium oder HES-Medium und überwachen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um die transformierten Zellen etwa 12 bis 18 Tage lang zu beobachten. Nach der Transduktion sollten die Zellen klonale Aggregate mit einer charakteristischen Kopfsteinpflastermorphologie und einem höheren Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma bilden. Um die reprogrammierten IPSC-Klone zu identifizieren, führen Sie eine Lebendzellfärbung für einen TRA 180 1-Antikörper durch.

Verwenden Sie dann eine 26-Gauge-Half-Inch-Nadel, um die positiven klonalen Aggregate TRA 180 1 in vier bis sechs kleine gleich große Stücke pro Klon zu schraffieren. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pipettenspitze, um 10 bis 20 schraffierte Stücke von mehreren Klonen zu entnehmen und in jede Vertiefung zu übertragen. Eine mit HESC beschichtete Matrigelplatte mit 24 Vertiefungen. Mittel, 24 bis 48 Stunden, nachdem die neu programmierten Klone auf die Matrigeloberfläche plattiert wurden.

Ersetzen Sie das Medium durch das IPSC-Medium. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um differenzierte Zellen oder kontaminierende Meth-Feeder-Zellen manuell abzukratzen, um die Reinigung der vollständig neu programmierten und pluripotenten dystrophischen IPSC-Klone zu unterstützen. Nachdem die Klone eine Größe von etwa 100 Mikrometern erreicht haben, dissoziieren Sie die Zellen drei Minuten lang mit EDTA und plattieren dann kleine Zellaggregate des reprogrammierten dystrophischen IPSC, suspendiert in IPSC-Medium, das mit einem RO-Kinase-Inhibitor ergänzt ist, auf eine frische Matrigel-beschichtete 12-Folienplatte.

Bestätigen Sie schließlich die Pluripotenz jedes Klons sowohl durch Genexpressionsanalyse als auch durch immunhistochemische Färbung. Für pluripotente Marker sind die meisten Zellen, die aus menschlichem Urin isoliert wurden, positiv für Vorläufer- und Stammzellmarker wie CD 44, CD 73 und CD 1 46. Die Zellen weisen auch mesenchymale Marker wie Alpha, glatte Muskulatur, Aktin und Menton auf.

R-T-P-C-R der isolierten Zellen liefert Hinweise auf eine gemischte Population von Zellen in den Kulturen. Dabei gibt es eine schwache Expression von Cytokeratin, sieben und UIN eins, A- und drei a-Markern von Euro-Epithelzellen. Die Urinzellen verwandeln sich am vierten Tag der Reprogrammierung von länglichen Typ-2-Zellen in ein Kopfsteinpflastermuster.

Am 12. Tag werden typische pluripotente Klone beobachtet, die in der Lage sind, ihre pluripotente Morphologie unter futterfreien Bedingungen beizubehalten. Die Lebendzellfärbung für TRA 180 1 kann verwendet werden, um die reprogrammierten Klone zu identifizieren. Um die Erzeugung von vektor- und transgenen, freien pluripotenten Klonen zu bestätigen, kann R-T-P-C-R unter Verwendung von Primern gegen das Sendai-Virus-Genom und jeden der exogenen OSKM-Faktoren durchgeführt werden.

Die exogene Genexpression ist ab Passage 13 nicht mehr nachweisbar, aber die Hochregulierung endogener Faktoren kann beobachtet werden. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigt die Expression von pluripotenten Markern auf den IPCs, nicht aber auf den Urinzellen. Die Expression des Dystrophin-Proteins und -Gens kann dann durch weitere Immunfluoreszenzfärbung, Western Blot bzw. R-T-P-C-R verifiziert werden, wie diese repräsentativen Bilder aus einer Wildtyp-Kontrolle und dystrophischen Zelllinien zeigen.

Nach der Beherrschung kann diese Technik eingesetzt werden, um eine ene-freie Reprogrammierung von ucs zu erreichen. Innerhalb weniger Wochen Nach diesem Verfahren können wir die IPCs in Kardiomyozyten oder Skelettmyozyten differenzieren, um die Mechanismen hinter der Muskeldystrophie zu verstehen.