Name: Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Neuprogrammierung von Urin-abgeleiteten Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen bei Muskeldystrophie-Patienten mittels Sendai-Virus. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht transgenfreie iPSCs für die regenerative Medizin.

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Die Entwicklung dieses Protokolls wurde von Advancing a Healthier Wisconsin und dem National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, durch die Fördernummer 8UL1TR000055 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wieder.

HINWEIS: Die Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten sollten Einwilligung in einem Institutional Review Board teilzunehmen geben genehmigten Studie. 1. Puffer und Medien Vorbereitungen <ol><li> Waschpuffer: Zu 100 ml Waschpuffer vorbereiten, 1 ml der 100x Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin + 100 ug / ml Streptomycin) und 99 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Urinary Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium: Um UPC Medium herzustellen, mischen gleichen Volumina von Keratinozyten Serum Free (KSF) Medium + Vorläuferzellen Cell Medium. <ol><li> KSF Medium: Um Keratinozytenmedium vorzubereiten, fügen Sie 5 ng / ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), 50 ng / ml Rinder (BPE), 30 ng / ml von Choleratoxin und Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) versetzt, um 500 ml Medium KSF. </li><li> Vorläuferzellen Cell Medium: In drei Viertel der DMEM mit einem Viertel der Ham-F12-Medium und ergänzt mit 10% FBS, 0,4 ug / ml Hydrocortison, 0,1nM Choleratoxin, 5 ng / ml Insulin, 1,8 x 10 -4 M Adenin, 5 ug / ml Transferrin, 2 x 10 -9 M triiod Thyronin, 10 ng / ml EGF und Pen / Strep-Lösung. </li></ol></li><li> hES Medium: Fügen Sie 20% KO-Serumersatz (K-SR), 1x MEM nicht essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 100 uM β-Mercaptoethanol, 20 ng / ml bFGF und Pen / Strep zu 400 ml DMEM / F12-Medium. </li></ol> 2. Urinprobenentnahme <ol><li> Weisen Sie die Patienten, um Flüssigkeiten 30 Minuten vor dem Sammelurin trinken, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge (~ 30-40 ml) der Urin gesammelt werden können. </li><li> Geben Sie dem Patienten und / oder deren Erziehungsberechtigte eine Urinsammlung Kit mit folgendem Inhalt: (1) schriftliche Anweisungen zur Steril- oder Reinfangurinprobe zu erhalten, (2) feuchte antibakterielle Toiletten, und (3) eine 100 ml sterile Proben-Sammelbecher. Patienten sollen angewiesen Probe zu sammeln. </li><li> Sofort legen Sie die Urinproben auf Eis und Transfer zum laboratory in einem Kühler. Verarbeiten Sie die Urin zur Zellisolierung sofort. Wenn eine Verzögerung unvermeidlich, lagern die Probe auf Eis für bis zu 4 h bei minimalem Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol> 3. Isolierung und Expansion von Urin Cells HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank. <ol><li> Mit sterilen Pipetten, um den Transfer Urinproben 50-ml-Zentrifugenröhrchen steril. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei RT. </li><li> Saugen Sie den Überstand zu verlassen 1 ml in der Röhre; darauf achten, dass das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren und verbinden die Pellets aus einer Vielzahl von Röhren in 7 ml Waschpuffer und wiederholen Zentrifugation bei 400 × g für 10 min bei RT. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren, so dass die Zellpellet und ~ 0,2 bis 0,5 ml Überstand. Resuspendieren in 2-3 ml Urin-Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium und übertragen Sie die Suspension in 4-6 Vertiefungen einer unbeschichtete 24-Well-Platte. </li><li> Nach 72 Stunden, ergänzen die Kultur mit 0,5 ml frischem UPC Medium pro Vertiefung und ändern Medium alle 2-3 Tage nach der. Die Erythrozyten und Schuppenzellen, die nicht an der Platte zu befestigen müssen mit den Mediumwechsel entfernt werden. </li><li> Überwachen Kultur nach 4-6 Tagen. HINWEIS: Kleine 2-4 Zellkolonien beginnt zu erscheinen. Cells wird abgerundet oder verlängert, die Typ I oder Typ II Nierenepithelzellen (RE) Zellen jeweils 3 darzustellen. </li><li> Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage, da, sobald die Zellen erscheinen, werden sie einen kräftigen Wachstumsphase durchlaufen. </li><li> Sobald die Zellen Konfluenz von 80-90% zu erreichen, in der Umgebung von 9-15 Tagen nach der Plattierung zu dissoziieren und den Durchgang der Zellen (15,000-18,000 Zellen / cm 2) auf 2-4 Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen zur weiteren Expansion. Kennzeichnen Sie diese als Zellpassage 1 (P1). </li><li> Charakterisieren Urinzellen für Linie Spezifikationen durch Durchflusszytometrie, immunohistochemchemische Färbung oder durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). </li><li> Reprogram isoliert Urin Zellen (Abschnitt 4) oder frieren Sie sie in Freezing Medium (DMEM, ergänzt mit 10% Serum und 10% DMSO) für langfristige Kryolagerung. </li></ol> 4. Urin Zell Reprogrammierung Mit Sendai Virus HINWEIS: Der richtige Umgang mit und die Verwendung von PSA (persönliche Schutzausrüstung) wird empfohlen, während die Manipulation der Transfektion Mittel. Die folgenden Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank. Die ordnungsgemäße Entsorgung der Transfektion Mittel und / oder transfizierten Zellen wird empfohlen, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden. Für Urin Reprogrammierung, verwenden Sie ein Sendai Reprogrammierung Kit mit Änderungen an Feeder-abhängigen Protokoll des Herstellers wie unten beschrieben. <ol><li> Um einen hohen Wirkungsgrad Neuprogrammierung mit dem Sendai-Virus zu gewährleisten, verwenden Sie Gänge 1-5 von Urin-Zellen, die schnell sindly Division. Wenn die Zellen nicht gut replizieren oder werden seneszenten, verwerfen, da sie nicht effizient neu zu programmieren. </li><li> Seed 60.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen. Markieren Sie diese als Tag -2. Einzustellen Zellsaat Dichte (5 x Oktober 4-9 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) wie erforderlich, um 80-90% Konfluenz von Tag 0 zu erreichen. </li><li> Am Tag 0 (48 h nach dem Ausplattieren der Zellen), bereiten die Sendai Umprogrammierung Vektoren (SeV), die jede der vier OSKM Faktoren. In jeder der Vektoren zu 1 ml vorgewärmten UPC Medium. Verwenden Sie eine MOI von 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), die ausreicht, um eine Anpassung Urinzellen ist. Saugen Sie das Medium und langsam 1 ml UPC + SeV zu einer Vertiefung der Urin Zellen hinzuzufügen. Verwenden Sie die zweite sowie die Weiterleitung Negativkontrolle. </li><li> Am Tag 1, ersetzen Sie die UPC + SeV Medium durch frisches Medium UPC. Einige Zelltod nach 24 h durch virale Zytotoxizität gesehen. </li><li> Je nach Effizienz der umprogrammiert clonE-Formationen und die kompakte Morphologie, halten Wechsel des Mediums täglich bis Tag 6 oder 7. </li><li> Einen Tag vor der Dissoziation von transduzierten Zellen (Tag 5 oder 6), vorzubereiten MEF Nährplatten durch Plattieren Mitomycin-C (10 ug / ml für 3 Stunden) behandelt-MEFs bei einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / cm 2 auf 0,1 % Gelatine beschichtete 100 mm 2 Kulturschalen. </li><li> Am nächsten Tag (Tag 6 oder 7), dissoziieren die Zellen mit 0,25% Trypsin, Resuspendieren der Zellen in Medium und UPC Platte 5 × 10 4 - 2 x 10 5 Zellen / 100 mm 2 MEF Zuführplatte. </li><li> Am folgenden Tag zu hES Medium wechseln und das Medium jeden Tag. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um transformierte Zellen zu überwachen. HINWEIS: Die Zellen klonale Aggregaten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie und mit höheren Zellkern zu Plasma-Relation (12-18 Tage nach der Weiterleitung) zu bilden. </li><li> Innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Transduktion abholen Kolonien und Übertragung auf neue Platten für clonal Expansion. </li><li> Führen Lebendzellfärbung zum Auswählen iPSC Klone durch Inkubieren von Zellen mit TRA-1-81-Antikörper für 1 h bei 37 ° C im CO 2 -Inkubator nach Gegenfärbung mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoff konjugierten sekundären Antikörper, gefolgt für 1 h bei 37 ° C im CO 2 -Inkubator. </li><li> Verwenden Sie eine 26 G 1½ Zoll Nadel Quer schlüpfen die größeren TRA-1-81 positive iPSC Klone in kleine gleichgroße Stücke (4-6 Stück pro Klon). </li><li> Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze zu holen und den Transfer 10-20 schraffierte Stücke aus mehreren Klonen in jede Vertiefung der Matrigel (10 ug / cm 2) beschichtete 24-Well-Platte mit hES-Medium. HINWEIS: Stücke von einem einzigen Klon einzeln in einer einzigen Vertiefung plattiert nicht erweitern oder pflegen Pluripotenz. </li><li> Ändern von hES zu iPSC Medium 24-48 Stunden nach der Umprogrammierung Klone werden auf die Matrigel Oberfläche befestigt. </li><li> Während der Wartung auf Matrigel-beschichteten Platten, manuell scrape-off alle differenzierten Zellen oder verunreinigen MEF Feeder-Zellen mit einer Pipette-Spitze bis zur voll reprogrammiert und pluripotent dystrophischen iPSC (MD-iPS) Klone anzureichern. </li><li> Nachdem einzelne Klone wurden ~ 100 &amp; mgr; m Größe erreicht, erweitern die Klone durch Dissoziieren mit 0,48 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Lösung für 3 min und Beschichtung kleine Zellaggregate von MD-iPSCs in iPSC Medium (ergänzt mit 5 uM Y27632, Rho-Kinase-Inhibitor ) auf frischen Matrigel (10 ug / cm 2) beschichtete 12-Well-Platte. Ändern iPSC Medium täglich. </li><li> Voll Umprogrammierung jedes Klons kann sowohl durch Genexpressionsanalyse OSKM Gene und immunhistochemische Färbung von Pluripotenzmarker (Oct3 / 4 und TRA-1-81) bestimmt werden. Eine rigorose Bewertung der Pluripotenz Potenzial sollte eingesetzt werden, um zu bestätigen vollständig umprogrammiert iPSC Linien lassen sich in drei Keimblätter differenzieren. Dies kann entweder durch Embryoidkörper (EB) die Bildung und Differenzierung Assay oder einem ter erreicht werdenatoma Bildungstest. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Modellierung von Herzkreislauferkrankungen mit iPS-Zellen entwickelt sich zu einem gemeinsamen Ansatz für den genetischen Beitrag 4-6 zu verstehen. Einige unerwartete Schwierigkeiten, die einem Zellproben von Patienten, insbesondere junge Kinder, können, indem sie die Möglichkeit einer nichtinvasiven Ansatz wie einer Urinsammlung vermieden werden. In diesem jungen Patientengruppe ist es oft schwierig, eine Urinvolumen ausreichend zu sammeln, um genügend Zellen zur Reprogrammierung Urin ergeben. Coaching der j...

Kardiomyopathie ist die zweithäufigste Todesursache bei Patienten mit Duchenne und Becker-Muskeldystrophie (MD). Obwohl Mutationen in dem X-verknüpften Dystrophin-Gen in 1 auftreten: 3,500 männlichen Neugeborenen, ist sehr wenig über die molekularen und zellulären Ereignisse, die zum fortschreitenden Herzmuskelschäden bekannt. Menschen induzierte pluripotente Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten stammen, wurden als neuartige Instrument, um die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen zu studieren und für Wirkstoff-Screening 1,2 verwenden entstanden. Die erwartete Beschwerden von Hautbiopsien oder Blutproben kann jungen Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten davon abzubringen, die Einwilligung zur Studienteilnahme zu geben. Urinproben ein nicht-invasives Quelle somatischer Zellen, abänderbar Neuprogrammierung Methoden. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Urin Zellen von Muskeldystrophie Patienten gesammelt wurden, können kultiviert werden und effizient in iPSCs Hilfe retroviraler Transduktion mit den Yamanaka Faktoren (umprogrammiertOCT3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc; OSKM) 1. Der Nachteil der retroviralen Gentransfer ist die zufällige Integration der Umprogrammierung Gene in die Wirtschromosomen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir das nicht-integrierenden Sendaivirus zur Urin Reprogrammierung verwendet. Dieses Protokoll beschreibt die Sendai-Virus Reprogrammierung von Zellen aus Urin isoliert Muskeldystrophie-Patienten, die dann in Herzmuskelzellen oder anderen Zelltypen für eine weitere Studie unterschieden werden können. Dieses Protokoll kann auch für andere Patienten spezifischen Krankheiten angepasst werden.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materialien</strong</td></tr><tr><td>>4 Oz. Probenbecher mit Deckel</td><td>STL Medical Supply</td><td>M9AMSAS340</td><td>für die Urinprobenentnahme</td></tr><tr><td>15 ml BD-Falcon Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD-Falcon Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Runde Glasdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai Reprogrammierungskit</td><td>Life Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep ohne Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Warm bei 37 Grad C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>B-27 Supplement mit Insulin (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>B-27 Supplement ohne Insulin (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Versene, 1:5.000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>bFGF (10 & Mikro; g)</td><td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Cell Counter Cartridges</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum (500&nbsp; ml Flasche)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Warm in 37 &Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Schinken's F-12 Nährstoffmischung&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Warm in 37 ° C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>EGF Rekombinantes humanes Protein, flüssige Form</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Insulin, human rekombinant, Zink Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>hESC Qualified Matrix, LVED Free</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthesekit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS-qualifiziert</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Adenin Bioreagenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Cholera Toxin aus Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Holo-Transferrin vom Menschen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>Warm in 37 &deg; C Wasserbad vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount Aquous Einbettmedium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Antikörper</td></tr><tr><td>Maus anti CD44 - markiert mit FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti CD146 - markiert mit PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti CD73 - markiert mit PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti-&alpha;-glatte Muskulatur Aktin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti-Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti Oct 3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti Dystrophin</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von induzierten pluripotenten stammzellen von muskeldystrophie-patienten: effiziente integration freie neuprogrammierung der urin-abgeleiteten zellen

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophischen Kardiomyopathie ist eine schlecht verstanden Folge der Muskeldystrophie. Generieren von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten mit Muskeldystrophie ist eine unschätzbare Quelle für zelluläre in vitro Krankheitsmodellsysteme und für Wirkstoff-Screening-Studien verwendet werden. Patienten stammenden Urinzellen in erfolgreiche Reprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen, um dystrophischen Kardiomyopathie Muster 1 verwendet. Adressieren der Sicherheitsbedenken von integrierenden Vektor-Systeme, unter Verwendung eines nicht-integrierenden Sendai-Virus-Vektors für die Transduktion von Yamanaka Faktoren in den Urin-Zellen von Patienten mit Muskeldystrophie gesammelt präsentieren wir ein Protokoll. Dieses Protokoll erzeugt vollständig neu programmiert Klone innerhalb von 2-3 Wochen. Die pluripotenten Zellen sind vektorfreien Durchgang durch-13. Diese dystrophischen iPS-Zellen lassen sich in Herzmuskelzellen differenziert und entweder verwendet werden, um Krankheitsmechanismen und für Wirkstoff-Screening zu untersuchen.

Meist Progenitorzellen aus menschlichem Urin isoliert sind positiv für uroepithelial Vorläufer und Perizyten Marker wie CD44, CD73 und CD146 (97,37%, 97,09% und 97,3% jeweils, Figur 1A und 1B). Diese Zellen exprimierten auch andere mesenchymalen Marker wie alpha-Aktin der glatten Muskulatur und Vimentin (1B). RT-PCR-Analyse zeugt von einer gemischten Population von Zellen in den Kulturen, daß es eine schwache Expression von Cytokeratin-7 (CK-7) und Uroplakin (UP) -Ia &a...

Dieses Protokoll beinhaltet detaillierte Verfahren zur Isolierung von Urinzellen von Muskeldystrophie-Patienten; ihre effiziente und schnelle Reprogrammierung durch Sendai-Virus-Transduktion.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die effiziente Generierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) von Patienten mit Muskeldystrophie, beginnend mit Urinzellkulturen und einer integrationsfreien Reprogrammierungsmethode. Dies wird erreicht, indem zunächst Urinproben von Patienten mit Muskeldystrophie entnommen werden. In einem zweiten Schritt werden die Urinzellen isoliert und in aus dem Urin gewonnene Zellkulturen expandiert.Als nächstes werden die aus dem Urin gewonnenen Zellen mit dem Sendai-Virus transduziert, das Yamanaka-Faktoren enthält, und nach 12 Tagen entstehen typische pluripotente Kolonien. Letztendlich kann durch Passage 13 der transgene freie Zustand der pluripotenten Stammzellen durch R-T-P-C-R-Analyse bestätigt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Reprogrammierung isolierter Hautfibroblasten mit lentiviralen Vektoren besteht darin, dass mit dieser Technik die somatischen Zellen nicht-invasiv von Patienten gewonnen und zur effizienten Erzeugung der IPCs unter Verwendung einer Zero-Footprint-Methode der viralen Reprogrammierung verwendet werden können.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Muskeldystrophie zu beantworten, z. B. wie diese Bedingungen in vitro modelliert werden können, ohne dass Sicherheitsbedenken für die Anwendung beim Menschen bestehen. Mohammad Zishan Al, ein Postdoktorand, Courtney Guesting, eine Technikerin, und Melanie Ryder, Doktorandin, alle drei aus meinem Labor, werden die Verfahren demonstrieren. Um eine Urinprobe zu entnehmen, raten Sie dem Patienten zunächst, 30 Minuten vor der Entnahme Flüssigkeit zu trinken, um sicherzustellen, dass etwa 30 bis 40 Milliliter Urin gesammelt werden können. Wenn der Patient bereit ist, geben Sie ihm ein Urinsammelset mit den folgenden Artikeln, schriftlichen Anweisungen zum Erhalt steriler oder sauberer, griffigerer und feuchter antibakterieller Toiletten und einem sterilen 100-Milliliter-Probenentnahmebecher.Wenn die Probe entnommen wurde, stellen Sie den Auffangbecher sofort auf Eis und bringen Sie die Probe in einem Kühler ins Labor. Verwenden Sie dann sterile Pipetten, um die Urinprobe in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen, und drehen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400-fachem G. Als nächstes wird in einer BSL eine biologische Sicherheitswerkbank bis auf den letzten Milliliter des Überstands abgesaugt, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird.Anschließend waschen Sie die Zellen in sieben Millilitern Waschpuffer und schleudern die Zellen wieder herunter. Diesmal werden bis auf die letzten etwa 0,2 bis 0,5 Milliliter des Überstands abgesaugt. Verwenden Sie nun das Pellet in zwei bis drei Millilitern Urinvorläuferzelle oder UPC-Medium wieder und überführen Sie die Suspension nach 72 Stunden in vier bis sechs Vertiefungen einer unbeschichteten 24-Well-Platte, ergänzen Sie die Kultur mit 0,5 Millilitern frischem UPC-Medium pro Well.Überwachen Sie die Kultur zwischen vier und sechs Tagen nach der Inkubation. Es sollten beginnen, kleine zwei- bis vierzellige Kolonien von abgerundeten oder länglichen Zellen zu erscheinen, die Nierenepithelzellen vom Typ 1 bzw. vom Typ zwei darstellen. Wechseln Sie das Medium weiterhin alle zwei bis drei Tage.Da die Kolonien nach etwa neun bis 15 Tagen Kultur eine schnelle Expansionsphase durchlaufen, sollten die Zellen zu diesem Zeitpunkt zu 80 bis 90 % konfluent sein, teilen Sie die Zellen für die weitere Expansion auf zwei bis vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte auf. Wenn diese Kultur als Zellpassage eins markiert wird, können die Urinzellen dann durch durchflusszytometrische Analyse, immunhistochemische Färbung oder durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion auf linienspezifische Marker charakterisiert werden, um eine hocheffiziente Reprogrammierung auf Tage vor dem Transduktionskeim, 60.000 Zellen pro Well, zu gewährleisten. Von einer Passage eins bis fünf Kultur in zwei Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen am Tag Null.Bereiten Sie den Sendai-Reprogrammierungsvektor vor, indem Sie jeden der vier OSKM-Faktoren an einem geeigneten MLI für die Reprogrammierung zu einem Milliliter vorwarmem UPC-Medium hinzufügen, das Suspense-Medium aspirieren und die Virussuspension für die nächsten sechs Tage langsam in eine Vertiefung der Urinzellen geben. Ersetzen Sie den Überstand täglich durch frisches UPC-Medium, am fünften Tag wird mit Mitomycin-Samen behandeltes MES auf gelatinebeschichtete 100-Millimeter-Quadratkulturschalen am sechsten Tag aufgebracht. Dissoziieren Sie die Urinzellen mit Trypsin, resuspendieren Sie sie in UPC-Medium und plättieren Sie sie mit fünfmal 10 der vierten bis zweimal 10 der fünften Zellen pro Meth-Feeder-Platte.Ersetzen Sie am nächsten Tag das UPC-Medium durch das humane Embryonalstadium oder HES-Medium und überwachen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um die transformierten Zellen etwa 12 bis 18 Tage lang zu beobachten. Nach der Transduktion sollten die Zellen klonale Aggregate mit einer charakteristischen Kopfsteinpflastermorphologie und einem höheren Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma bilden. Um die reprogrammierten IPSC-Klone zu identifizieren, führen Sie eine Lebendzellfärbung für einen TRA 180 1-Antikörper durch.Verwenden Sie dann eine 26-Gauge-Half-Inch-Nadel, um die positiven klonalen Aggregate TRA 180 1 in vier bis sechs kleine gleich große Stücke pro Klon zu schraffieren. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pipettenspitze, um 10 bis 20 schraffierte Stücke von mehreren Klonen zu entnehmen und in jede Vertiefung zu übertragen. Eine mit HESC beschichtete Matrigelplatte mit 24 Vertiefungen. Mittel, 24 bis 48 Stunden, nachdem die neu programmierten Klone auf die Matrigeloberfläche plattiert wurden.Ersetzen Sie das Medium durch das IPSC-Medium. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um differenzierte Zellen oder kontaminierende Meth-Feeder-Zellen manuell abzukratzen, um die Reinigung der vollständig neu programmierten und pluripotenten dystrophischen IPSC-Klone zu unterstützen. Nachdem die Klone eine Größe von etwa 100 Mikrometern erreicht haben, dissoziieren Sie die Zellen drei Minuten lang mit EDTA und plattieren dann kleine Zellaggregate des reprogrammierten dystrophischen IPSC, suspendiert in IPSC-Medium, das mit einem RO-Kinase-Inhibitor ergänzt ist, auf eine frische Matrigel-beschichtete 12-Folienplatte.Bestätigen Sie schließlich die Pluripotenz jedes Klons sowohl durch Genexpressionsanalyse als auch durch immunhistochemische Färbung. Für pluripotente Marker sind die meisten Zellen, die aus menschlichem Urin isoliert wurden, positiv für Vorläufer- und Stammzellmarker wie CD 44, CD 73 und CD 1 46. Die Zellen weisen auch mesenchymale Marker wie Alpha, glatte Muskulatur, Aktin und Menton auf.R-T-P-C-R der isolierten Zellen liefert Hinweise auf eine gemischte Population von Zellen in den Kulturen. Dabei gibt es eine schwache Expression von Cytokeratin, sieben und UIN eins, A- und drei a-Markern von Euro-Epithelzellen. Die Urinzellen verwandeln sich am vierten Tag der Reprogrammierung von länglichen Typ-2-Zellen in ein Kopfsteinpflastermuster.Am 12. Tag werden typische pluripotente Klone beobachtet, die in der Lage sind, ihre pluripotente Morphologie unter futterfreien Bedingungen beizubehalten. Die Lebendzellfärbung für TRA 180 1 kann verwendet werden, um die reprogrammierten Klone zu identifizieren. Um die Erzeugung von vektor- und transgenen, freien pluripotenten Klonen zu bestätigen, kann R-T-P-C-R unter Verwendung von Primern gegen das Sendai-Virus-Genom und jeden der exogenen OSKM-Faktoren durchgeführt werden.Die exogene Genexpression ist ab Passage 13 nicht mehr nachweisbar, aber die Hochregulierung endogener Faktoren kann beobachtet werden. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigt die Expression von pluripotenten Markern auf den IPCs, nicht aber auf den Urinzellen. Die Expression des Dystrophin-Proteins und -Gens kann dann durch weitere Immunfluoreszenzfärbung, Western Blot bzw. R-T-P-C-R verifiziert werden, wie diese repräsentativen Bilder aus einer Wildtyp-Kontrolle und dystrophischen Zelllinien zeigen.Nach der Beherrschung kann diese Technik eingesetzt werden, um eine ene-freie Reprogrammierung von ucs zu erreichen. Innerhalb weniger Wochen Nach diesem Verfahren können wir die IPCs in Kardiomyozyten oder Skelettmyozyten differenzieren, um die Mechanismen hinter der Muskeldystrophie zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur effizienten Modellierung des Duchenne-Muskeldystrophie-Muskels mit MYOD1-konvertiertenUrin-abgeleiteten Zellen, um die Wiederherstellung von Dystrophin mRNA und Proteinspiegel nach Exon-Skipping zu bewerten.

Exon Springt in direkt umprogrammierten Myotubes aus menschlichen Urin-abgeleiteten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.

Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin

Erfahren Sie die effiziente Neuprogrammierung von Urin-abgeleiteten Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen bei Muskeldystrophie-Patienten mittels Sendai-Virus. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht transgenfreie iPSCs für die regenerative Medizin.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen (Video) | JoVE Journal

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

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