Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion
21. September 2014
Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bestimmte Zellpopulationen aus dem sich entwickelnden Kleinhirn zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Kleinhirn von neugeborenen Mäusen geerntet werden, die fluoreszierende Proteine tragen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, lebende Gewebeschnitte mit einem Vibrato zu erhalten.
Der dritte Schritt besteht darin, die äußere Keimschicht des Kleinhirns unter einem Fluoreszenzmikroskop zu mikrodiszieren. Die letzten Schritte bestehen darin, das Gewebe in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren und die Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu sammeln. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Zellpopulationen aus dem Kleinhirn isoliert werden können.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Lasererfassung und Mikrodissektion besteht darin, dass die Zellen lebendig sind und kultiviert werden können. Für weitere Experimente Sterilisieren Sie bei diesem Verfahren die chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven. Holen Sie sich frische oder aufgewärmte 3%ige niedrigschmelzende Aromen, die in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad verwendet werden können.
Stellen Sie die erforderlichen Lösungen für die Papayan-basierte Zelldissoziation zusammen. Bereiten Sie frische NBB 27-Nährmedien vor. Anschließend filtrieren, sterilisieren und in einem Inkubator lagern.
Bereiten Sie den Faxpuffer vor und bereiten Sie die Poly de Lycine-Deckgläser vor. Erste Anstriche Autoklaven-Deckgläser mit 100 Mikrogramm Poly de Lycine pro Milliliter sterilem Wasser. Dann inkubieren Sie die Deckgläser zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Deckgläser später mit destilliertem Wasser und anschließend mit NBB 27-Medien, bevor Sie die Deckgläser verwenden. Trocknen Sie sie vollständig ab. Dies dauert mindestens eine Stunde, bevor es beginnt.
Bereiten Sie zuerst den Sezierbereich vor. Wischen Sie es mit 70% Ethanol sauber. Decken Sie es dann mit einem saugfähigen Pad ab.
Nehmen Sie zweitens die Werkzeuge aus dem Sterilisationsbeutel und positionieren Sie sie für den Gebrauch. Drittens, beladen Sie eine Schüssel mit eiskaltem, sterilem DPBS mit 1%Stiftstreifen und legen Sie sie auf Eis. Sezieren Sie das Gehirn eines P-4-Welpen, der fluoreszierende Marker exprimiert.
Übertragen Sie es dann in die vorbereitete Schüssel von DPBS. Trennen Sie das Kleinhirn mit einer Pinzette vorsichtig vom Rest des Gehirns. Diese Kleinhirn exprimieren die Marker math one, GFP und nisten in CFP, wobei das EGL GFP exprimiert und die molekulare Schicht positiv für CFP ist.
Füllen Sie anschließend eine zwei Zentimeter große gewürfelte Einbettungsform mit der Agro-Lösung. Achten Sie darauf, dass es nicht wärmer als 37 Grad Celsius ist. Nehmen Sie ein Kleinhirn mit einem perforierten Löffel und tupfen Sie es mit einem sanften Tupfen von Taschentuch trocken.
Setze sie dann mit einer Pinzette in die Form ein. Benutze eine Nadel, um das Kleinhirn in vertikale Stellungen zu bringen. Einmal sind etwa vier in die Form geladen.
Lege die Form auf Eis, damit sie sich schnell verfestigt Mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie den Block ab, um die Schnittzeit zu verkürzen. Kleben Sie dann den Block so auf die Platte, dass die Kleinhirn vertikal ausgerichtet sind.
Beladen Sie die Füllschale mit eiskaltem DPBS mit 1%-Gurtband und legen Sie Eis unter die Schale, damit es kalt bleibt. Teilt nun die Blöcke mit einem Vibrator ab. Schneiden und sammeln Sie 600-Mikron-Abschnitte.
Mit einem perforierten Löffel aus der Eisschale nehmen und in eine mit A-D-P-B-S gefüllte Form auf Eis geben. Unter dem Fluoreszenz-Präpariermikroskop. Untersuchen Sie die Scheiben so schnell wie möglich.
Trennen Sie die EGL vorsichtig vom Rest des Kleinhirns. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um zwischen der CFP-positiven Molekülschicht und der GFP-positiven EGL zu präparieren. Seien Sie bei der Mikrodissektion sehr konservativ, um eine Kontamination aus angrenzenden Regionen zu vermeiden.
Übertragen Sie das GFP-positive EGL-Gewebe in eine neue, mit DPBS gefüllte Schale auf Eis. Vermeiden Sie die Einbeziehung von Molekularschichtgewebe, da dies die Kultur mit Nesting-exprimierenden Bergman-Gliazellen kontaminiert. Entfernen Sie anschließend das Agros, das das isolierte EGL-Gewebe umgibt.
Die EGL kann nun mit einem Paan-basierten Protokoll für eine Einzelzellsuspension dissoziiert werden. Wenn dies abgeschlossen ist, werden die Zellen im Faxpuffer erneut suspendiert. Fahren Sie mit dem Sammeln der CFP-Zellen per Fax fort.
Sortieren Sie sie mit einem Hochgeschwindigkeitszytometer und einem CFP-Filter und ziehen Sie sie in einen eiskalten Faxpuffer. Etwa 100.000 NPS sollten pro P vier Kleinhirn erhalten werden. Zentrifugieren Sie dann die gepoolten Zellen fünf Minuten lang bei 300 g.
Nutzen Sie die Zellen sofort, um sie wiederzubeleben. Hängen Sie sie in vorwarmes NBB 27-Medium ein. Laden Sie diese dann auf die mit Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläser.
Zell-Bella-Schnitte wurden aus P vier math einem GFP-Nest in CFP-Mäusen hergestellt. Zerebelläre EGL enthielt hauptsächlich GFP-exprimierende GMPs und konnte leicht von der molekularen Schicht getrennt werden, die mit CFP-exprimierenden Gliazellen angereichert war. Die Analyse zeigte, dass mehr als 85% der Zellen in der EGL konventionelle GNPs waren. NEPs wurden aus den tiefen Teilen der EGL durch Mikrodissektion isoliert, gefolgt von Fakten.
Diese Zellen machten etwa 5% der Zellen in der EGL vier Tage nach der Kultivierung aus. Die isolierten Fakten NPS führten zu Beta-Tubulin-exprimierenden Neuronen. Dies ist charakteristisch für linienbeschränkte neuronale Vorläuferzellen.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten und das Gewebe so weit wie möglich auf Eis zu halten.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert eine Methode zur Isolierung von nestin-exprimierenden Vorläuferzellen aus dem sich entwickelnden Kleinhirn neugeborener Mäuse. Die Technik kombiniert Mikrodissektion und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, um diese Vorläuferzellen für weitere Untersuchungen zu reinigen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Nestin-exprimierende Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population im Kleinhirn.
- Das Verständnis dieser Vorläuferzellen kann Einblicke in die neuronale Entwicklung liefern.
- Bestehende Methoden zur Zellisolierung führen oft zu Kontaminationen.
- Diese Studie zielt darauf ab, die Reinheit der isolierten Zellpopulationen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Isolierung spezifischer neuronaler Vorläuferpopulationen aus dem Kleinhirn.
- Ermöglichung weiterer Experimente und Analysen dieser Zellen.
- Demonstration einer Technik, die die Zelllebensfähigkeit für die Kultur aufrechterhält.
Verwendete Methoden
- Ernte von Kleinhirnen aus neugeborenen Mäusen mit fluoreszierenden Markern.
- Mikrodissektion der äußeren Keimschicht unter einem Fluoreszenzmikroskop.
- Dissoziierung des Gewebes zu einer Einzelzellsuspension.
- Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zum Sammeln spezifischer Zellpopulationen.
Hauptergebnisse
- Spezifische Zellpopulationen wurden erfolgreich aus dem Kleinhirn isoliert.
- Mehr als 85% der isolierten Zellen wurden als konventionelle GNPs bestätigt.
- NEPs wurden isoliert und machten etwa 5% der EGL-Zellen aus.
- Isolierte Vorläuferzellen führten zu beta-Tubulin-exprimierenden Neuronen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht die Isolierung lebender neuronaler Vorläuferzellen.
- Diese Technik kann die Untersuchung der Kleinhirnentwicklung verbessern.
- Die Aufrechterhaltung der Gewebelebensfähigkeit ist entscheidend für eine erfolgreiche Zellkultur.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from heterogeneous tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. This microdissection-FACS workflow enables the recovery of live, contamination-free progenitors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neuronal lineage studies. The ability to culture isolated cells bridges discovery biology with translational biomarker exploration in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Nestin-expressing progenitors as a distinct therapeutic hypothesis in cerebellar development.
- Operational Value: Provides a purified cell population free from contaminating granule neuron precursors and Bergman glia for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports lineage-restricted progenitor validation through beta-tubulin+ neuronal differentiation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a live, single-cell suspension suitable for downstream fluorescent-activated sorting and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through vibratome sectioning and microdissection under fluorescence guidance for reproducible EGL isolation.
- Assay Readiness: Yields approximately 100,000 viable progenitors per P4 cerebellum, enabling scalable compound testing in culture.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Isolated Nestin-expressing progenitors maintain viability for at least four days in culture, supporting preclinical phenotypic analysis.
- Biomarker Alignment: Beta-tubulin expression serves as a measurable readout for neuronal differentiation, aligning with translational biomarker strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Pure progenitor isolation reduces mechanistic ambiguity in de-risking neuronal differentiation pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven isolation of rare cell populations prior to functional screening and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of progenitor identity and spatial localization within the external germinal layer.
- Screening: Produces a standardized, live cell suspension compatible with FACS-based sorting and compound exposure assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of progenitor frequency (~5% of EGL) and differentiation outcomes via beta-tubulin expression.
- Translational Research: Connects isolated progenitors to preclinical validation through sustained culture and lineage-specific marker expression.
- Enterprise Reuse: The microdissection-FACS workflow is adaptable to other fluorescently labeled tissues, supporting platform-level application across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating live Nestin-expressing progenitors free from adjacent cellular contamination.
- Operational Value: Standardizes tissue viability preservation through ice-cold handling and rapid processing, enabling consistent culture initiation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in neuronal progenitor studies by providing purified, functional cell inputs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of cerebellar development targets through reliable, contamination-free cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent tissue dissection and microdissection under stereomicroscopy to maintain spatial precision.
- Dependent on cryostat-compatible embedding media (low-melting agarose) and vibratome sectioning at 600-micron thickness.
- Necessitates standardized FACS setup with CFP and GFP filters for parallel isolation of molecular layer and EGL populations.
- Requires poly-D-lysine coating and NBB 27 media preparation for adherent progenitor culture and differentiation assays.
- Practical limitation: Tissue must be processed rapidly on ice to prevent viability loss, restricting batch size without coordinated workflow.
