Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Natriumdynamik in kleinen zellulären Kompartimenten, wie Stacheln und Dendriten zentraler Neuronen im intakten Gewebe, zu evozieren und zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein akuter Hippocampusschnitt der Maus präpariert, ein pyramidales Neuron mit dem natriumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff SBFI durch eine Patch-Pipette beladen und die zelluläre Morphologie mittels Multiphotonenanregung sichtbar gemacht wird. Die nächsten Schritte bestehen darin, einen stacheligen Dendriten für das Experiment auszuwählen und eine photoaktivierte Verbindung wie Glutamat im Käfig in die Nähe dieses Dendriten zu injizieren.

Anschließend wird ein UV-Blitz auf Foley Uncaaged Glutamat angewendet, wobei ein UV-Laser verwendet wird, der genau positioniert wurde, um ein kleines Volumen in der Nähe des gewünschten Dendriten zu erreichen. Der letzte Schritt besteht darin, die resultierenden Änderungen der SBFI-Fluoreszenz im Dendriten und die daraus resultierenden Änderungen des Natriums in den angrenzenden Dornen zu überwachen. Auch die begleitenden Membranströme werden erfasst.

Letztendlich wird die Verwendung geeigneter pharmakologischer Werkzeuge wie Rezeptorblocker die Untersuchung der Mechanismen ermöglichen, die die evozierten intrazellulären Natriumsignale erzeugen. Diese Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug für die Untersuchung intrazellulärer Natriumsignale in kleinen zellulären Kompartimenten und in intaktem Hirngewebe. Hier kombinieren wir Ganzzell-Patch-Clamp und Multiphotonen-Natrium-Bildgebung mit einem modifizierten Verfahren zur UV-Licht-induzierten Entkäfigung.

Es ermöglicht uns, zelluläre Reaktionen bei präzisen und gezielten Anwendungen von neuroaktiven Verbindungen zu überwachen. Das Verfahren wird von Karl KA und Kaan Kleinhans, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Um mit der Dissektion des Gewebes zu beginnen, legen Sie das Gehirn sofort in eine Petrischale mit eiskalter Dissektion, künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit oder A CSF und präparieren Sie eine Hemisphäre, indem Sie einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie durchführen.

Führen Sie einen zweiten Schnitt in der gewünschten Ausrichtung als Blockierfläche durch. Befestigen Sie diesen dann mit Sekundenkleber an der Schnittstufe eines Vibrams. Nachdem Sie die Schneidkammer und das Kühlelement des Vibrams aus dem Gefrierschrank genommen haben, platzieren Sie den Schneidtisch mit dem Gehirnteil in der Kammer.

Legen Sie dann das Kühlelement in die Kammer und tauchen Sie das Gewebe in eiskalte Dissektion A CSF. Schneiden Sie anschließend 250 Mikrometer dick auf. Para sagittale Schnitte des Hippocampus mit einem Viom.

Stellen Sie sicher, dass eine CS-Flüssigkeit jederzeit Blasen abgibt. Nach dem Schneiden das Gewebe auf einem Netz in einem Becherglas mit normalem A-Liquor aufbewahren und 30 Minuten bei 34 Grad Celsius inkubieren. Halten Sie das Gewebe nach der Inkubation bei Raumtemperatur.

Dieses Experiment sollte in einer dunklen Umgebung durchgeführt werden, wird hier aber zu Filmzwecken unter schummrigen Lichtverhältnissen gezeigt. Um die Hardware vorzubereiten, schalten Sie zunächst die Komponenten des Multiphotonensystems ein und stellen Sie die Ausrichtung des Infrarot-Laserstrahls ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Passen Sie dann die Wellenlänge und die Strahlintensität des Multiphotonenlasers an, indem Sie die Einstellungen der PCAL-Zelle und der Photomultiplier ändern.

Schalten Sie als Nächstes das Entladungssystem ein und kalibrieren Sie es, indem Sie einen fluoreszierenden Probenobjektträger unter die Objektivlinse legen. Starten Sie die Kalibrierungsroutine der Steuerungssoftware für die Entdeckungseinheit. Stellen Sie den UV-Laser auf mehrere Punkte innerhalb seines Scanbereichs ein, während die Fluoreszenz mit einer CCD-Kamera erfasst wird, indem Sie auf den UV-Laserspot klicken.

Passen Sie an jedem Punkt die Positionierung der galvanischen Scanspiegel so an, dass sie einer bestimmten Koordinate in der Software entspricht. Die genaue Positionierung des Auskäfigungsspots wird durch den Import eines Bildes des Bildgebungssystems über eine Netzwerkverbindung zwischen Auskäfig- und Bildgebungsrechnern erreicht. Mit Hilfe einer Screengrabber-Software lesen Sie kontinuierlich die Frames der Imaging-Software aus und passen die Bildgebung an.

Und dann exportieren die Caging-Frames kongruent jedes 10. Bild aus der Bildgebungssoftware als Referenzbild in das Blitzgerät, um eine korrekte Anpassung während des gesamten Experiments zu gewährleisten. Schalten Sie als Nächstes die elektrophysiologischen Komponenten der Mikromanipulatoren und das Druckanwendetor ein, um die eingesperrte Verbindung in die Zielregion zu bringen. Ziehen Sie Pipetten für die Ganzzell-Patch-Klemme und lokale Fülle mit feuerpolierten Kapillaren aus Boro-Silikatglas.

Legen Sie dann die Scheibe in das Versuchsbad und um sie mit einem Gitter zu fixieren, stellen Sie das Bad auf den Mikroskoptisch und perfundieren Sie die Scheibe dauerhaft mit A CSF. Beginnen Sie mit der Klemmung des Ganzzellpflasters, indem Sie die Patch-Pipette mit intrazellulärer Lösung oder ICS bestücken, die SBFI enthält, und beladen Sie dann die lokale Perfusionspipette mit einer Käfigverbindung. Befestigen Sie die Pipetten an den entsprechenden Mikromanipulatoren und legen Sie die Referenzelektrode in das Bad.

Wählen Sie eine CA-Pyramidenzelle mit einem Soma, das sich 30 bis 70 Mikrometer unter der Oberfläche der Scheibe befindet, um eine intakte Zellmorphologie sowie eine geringe Streuung und Abschwächung des Entriegelungsstrahls zu gewährleisten. Nähern Sie sich dieser Zelle mit einer Patch-Pipette unter Verwendung der IR-DIC-Videomikroskopie. Sanft saugen, bis eine Giga-Versiegelung erreicht ist.

Kompensieren Sie schnelle Kapazitäten. Brechen Sie dann die Membran auf und öffnen Sie die Zelle, um die Zellkonfiguration zu erhalten. Beurteilen Sie abschließend die Lebensfähigkeit der Zellen im Strom-Clamp-Modus.

Injizieren Sie einen depolarisierenden Strom und prüfen Sie, ob die daraus resultierende Spike-Aktivität vorhanden ist, um Bildgebung und Stimulation durchzuführen. Zuerst wird tetro DOIND zu A CSF hinzugefügt, um die Aktivierung spannungsgesteuerter Natriumkanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen zu verhindern. Visualisieren Sie die zelluläre Morphologie durch Multiphotonenanregung und die daraus resultierende SBFI-Fluoreszenz.

Wählen Sie einen stacheligen Dendriten für das Experiment. Vergrößern Sie die Ansicht, um Bilder mit einer höheren Auflösung anzuzeigen, und platzieren Sie einen Cliprahmen um den Dendriten. Platzieren Sie dann die Pipette mit der eingesperrten Verbindung in der Nähe des Dendriten.

Positionieren Sie die Pipette so, dass eine effiziente lokale Perfusion des Dendriten Ihrer Wahl möglich ist. Passen Sie den Entriegelungslaser so an, dass der Entriegelungspunkt in der Nähe der gewünschten Struktur positioniert wird. Legen Sie als Nächstes mit Hilfe einer Bildgebungssoftware die interessierenden Regionen auf dem ausgewählten Dendriten und den angrenzenden Stacheln fest.

Nähern Sie sich der Region of Interest und injizieren Sie die eingesperrte Verbindung für einige Sekunden mit Niederdruck-Start-, Patch-, Clamp- und Fluoreszenzaufzeichnungen über das Triggersignal. Während der lokalen Üppigkeit der Käfigverbindung wird der Anregungsstrahl vollständig gedimmt, um ein Ausbleichen zu verhindern. Stoppen Sie als nächstes die lokale Überfluss des Käfiggemisches.

Erhöhen Sie dann die Intensität des Zwei-Photonen-Lasers, um eine effiziente Anregung von SBFI zu ermöglichen, und wenden Sie einen UV-Blitz an, um beim Caging zu initialisieren, Monitoränderungen der SBFI-Fluoreszenz sowie des somatischen Stroms fahren fort, um die Aufzeichnung zu stoppen, nachdem sich die SBFI-Fluoreszenz wieder auf den Ausgangswert erholt hat. Um die Morphologie zu erhalten, zeichnen Sie einen XY- und Z-Stapel des Clipbox-Bereichs auf, der für die durchgeführten Messungen festgelegt wurde. Stellen Sie sicher, dass dieser Stack räumlich überabgetastet wird, um eine optimale Bildentfaltung zu ermöglichen und die Bildqualität und -auflösung zu erhöhen.

Das Beladen von Neuronen mit SBFI durch die Patch-Pipette ermöglichte die Visualisierung der gesamten Zelle, einschließlich feiner Dendriten und benachbarter Stacheln, durch den Einsatz von Multiphotonenanregung nach lokaler Perfusion mit eingesperrtem Glutamat. Die Anwendung eines UV-Blitzes in der Nähe eines Dendriten führte zu einer vorübergehenden Abnahme der Fluoreszenzemission von SBFI, was einen Anstieg der intrazellulären Natriumkonzentration widerspiegelt. Gleichzeitig wurde bei der SOMA-Anwendung eines UV-Blitzes auf Scheiben ein Einströmstrom aufgezeichnet, der nicht mit Glutamat im Käfig vorperfundiert worden war.

Es wurden nie Veränderungen der SBFI-Fluoreszenz oder der nach innen gerichteten Ströme hervorgerufen, was darauf hindeutet, dass diese Signale auf das Lösen von Glutamat zurückzuführen sind. Die Spitzenamplituden waren in den Stacheln in der Nähe des Ausscheidepunktes etwas höher, während die Muster für weitere Dornen dem Elterndendriten ähnelten. Der Weg für den Natriumeinstrom in Dendriten und Stacheln als Reaktion auf das Lösen von Glutamat wurde unter Verwendung selektiver Blocker für die natriumdurchlässigen ionotropen Glutamatrezeptoren untersucht, Glutamat-induzierte intrazelluläre Natriumsignale und die ausgelösten somatischen Ströme wurden in Gegenwart dieser Blocker weggelassen.

Nach dem Auswaschen der Blocker werden die Signale wiedergewonnen, was zeigt, dass das Lösen von Glutamat zytotrope Glutamatrezeptoren auf ca. 1 pyramidalen Neuronen aktiviert, was zu intrazellulären Natriumtransienten und nach innen gerichteten Strömen führt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die niedrigstmögliche Intensität für den Infrarotlaser zu wählen, um Schäden an der Vorbereitung zu minimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die kritischen Schritte unseres experimentellen Ansatzes zur Untersuchung der Natriumsignalübertragung in zellulären Mikroüberresten haben. Sobald diese Technik beherrscht wird, ermöglicht sie eine hochauflösende Bildgebung von aktivitätsevozierten intrazellulären Ionensignalen im intakten Gewebe, das frei von Bewegungsartefakten ist, wie sie durch andere Techniken eingeführt wurden.