Name: Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Natriumdynamiken in Dendriten und Dornenfortsätzen von Hippocampus-Neuronen mittels UV-induziertem Uncaging von Glutamat und Multiphotonen-Imaging. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Signalwege.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Ro2327 / 6-1), um CRR Die Autoren möchten Durry S. und C. Rodrigo für kompetente technische Unterstützung, und M. Dübbert (Elektronik-Labor, Zoologisches Institut danken unterstützt , Universität zu Köln, Deutschland) um Hilfe bei der Umsetzung der Pockels-Zelle-Controller und die HF-Schalter.

<ol><li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+Na%2B+imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflueg.+Arch.%2C+Eur.+J.+Phy%22%5BJournal%5D)">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li>
<li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+Na%2B+signals+in+spines+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li>
<li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+new+fluorescent+Na%2B+indicator+CoroNa+Green%3A+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li>
<li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li>
<li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Roy.+Soc.+B-Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li>
<li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li>
<li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mismatch+between+the+Na%2B+flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li>
<li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na%2B+influx+between+axon+and+soma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li>
<li>Denk, W., Piston, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenk%2C+W+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).</li>
<li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Ca%282%2B%29+and+Na%28%2B%29+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li>
<li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2FK+pump+current+and+%5BNa%5D%28i%29+in+rabbit+ventricular+myocytes%3A+Local+%5BNa%5D%28i%29+depletion+and+Na+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li>
<li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li>
<li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mobility+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li>
<li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li>
<li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm%3A+photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li>
<li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNikolenko%2C+V+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22">Cold Spring Harbor protocols</a>. , 1132-1141 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte. Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung ermöglicht Open Access-Veröffentlichung von Rapp OptoElektronik (Wedel, Deutschland), die ein Instrument in der Video-Artikel verwendet wird, erzeugt. Das Unternehmen war in den Experimenten noch in der Datenverarbeitung noch in der Handschrift weder schriftlich beteiligt.

Die vorliegende Studie zeigt, dass SBFI ist für Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in kleinen zellulären Kompartimenten gut geeignet. Es muss berücksichtigt werden, jedoch, dass die Quanteneffizienz der SBFI eher gering 15 und relative Veränderungen in der Natriumkonzentration ziemlich klein mit physiologischer Aktivität. So ist hochauflösenden Messung von Na +-Transienten in feinen Prozesse eine relativ langwierige Aufgabe, und Binning-oder Mittelwertbildung aus mehreren Studien notwendig sein, um zufrieden stellende Signale zu erhalten. Außerdem ist die Kinetik der Natrium Transienten raschend langsam, was es obligatorisch, für längere Zeitperioden aufzuzeichnen. Diese Beobachtung entspricht den in früheren Studien, in denen monoexponentiellen Natrium Transienten in neuronalen Dendriten und in Astrozyten durch große Zerfallszeitkonstanten im Bereich von 10 sec bei Raumtemperatur 1,2,6 gekennzeichnet. Natrium Transienten scheinen somit einen viel langsameren Zeit Co ausübenUrse und viel größer Abklingzeitkonstanten im Vergleich zu Kalzium-Transienten 16. Beiseite, diese Nachteile zu setzen, erweist sich Natrium-Bildgebung ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften der neuronalen Subdomains sein. So kann beispielsweise Natrium-Bildgebung dienen erregenden synaptischen Aktivität auf oder in der Nähe von aktiven Synapsen überwachen. Da Natrium im wesentlichen nicht gepuffert 8,17, sind Aktivität induzierte Natrium Transienten linear auf einer breiten Palette von synaptischen Glutamatfreisetzung bezogene oder exogen Glutamat. Sie repräsentieren somit direkten und unvoreingenommene Indikatoren neuronaler glutamatergen Aktivität. Außerdem Natriumindikatorfarbstoffe zeichnen sich durch hohe K d &#39;s (SBFI K d im Bereich von 25 mm 1). Selbst bei den verwendeten, um eine ausreichende Helligkeit zu erreichen relativ hohe intrazelluläre Farbstoffkonzentrationen (in der Regel 0,5 bis 1 mm), der hohe K d &#39;s bedeuten, daß die Farbstoffe selbst nicht als Puffer für S handelnOdium. Folglich haben sie nicht die Amplitude noch zeitliche Verlauf der Natrium-Transienten verzerren, das ist immer ein Problem, wenn Calcium-sensitiven Farbstoffe werden in die Zellen 18 eingeführt. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass die erfassten Signale stellen ein gutes Maß für die &quot;echten&quot; Änderungen der intrazellulären Natrium. Ihre langsame zeitliche Verlauf bedeutet dann, dass die Geschwindigkeit für die intrazelluläre Diffusions Natrium in Neuronen ist viel kleiner als bisher angenommen 19. Eine entscheidende Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung von Experimenten der Bewältigung der Eigenschaften von erregenden synaptischen Übertragung und Natrium-Influx Wege in Stacheln und Dendriten ist die Induktion einer schnellen und stark lokalisierte Aktivierung der postsynaptischen Strukturen. Dies kann durch schnelle und lokale Applikation von Glutamat oder Glutamat-Agonisten in der unmittelbaren Umgebung einer Wirbelsäule oder einem Dendriten durch den Blitz-Photolyse von caged Verbindungen erhalten werden. Blitzphotolyse nicht mechanisch damage das Gewebe, ist frei von Bewegungsartefakten und ist gut für die Untersuchung der damit verbundenen Fragen etabliert (zB lokale Calcium-Signal). Der Durchmesser des Uncaging Stelle betrug 1,5 um in der xy-Ebene. Uncaging fast eine stachelige Dendriten induzierte Natrium-Signale in beiden Stacheln und die Mutter Dendriten. Während die Signale eher größte in Stacheln am nächsten an der Uncaging Ort zu sein, waren die Amplituden in der übergeordneten Dendriten und Dornen weiter weg noch recht ähnlich zu denen in unmittelbarer Nähe des Uncaging Ort. Uncaging wurde für 300 ms, während der innere Ströme in Amplitude erhöht geführt. Uncaged Glutamat könnte im Gewebe während der gleichen Zeitperiode diffundiert sind, Aktivierung ionotropen Glutamat-Rezeptoren und Natrium-Influx auf dendritische Dornen Regionen und weiter weg von der Uncaging Ort. Eine intrinsische Problem, das bei der Verwendung eines UV-Laser für die Photolyse von caged Verbindungen durch die Zelle Badelösung verabreicht trittist &quot;innere Filter &#39;. Aufgrund der hohen Absorptionsrate des Käfigs wird UV-Licht stark entlang dem Weg von dem Ziel zu der Stimulationsstelle 20,21 gedämpft. Ein möglicher Weg, um dies zu vermeiden ist die lokale Perfusion mit dem Käfig, der nur an der Stimulationsstelle, die außerdem verringert die Menge der Caged Compound auf ein Minimum beschränkt ist erforderlich. Im Vergleich zu UV-Laser-Scanning-vermittelte Uncaging, nahen Infrarot-Zwei-Photonen-Uncaging 22 ist räumlich präzise, ​​vor allem, weil die Genauigkeit der Stimulation in der z-Achse erhöht. Auf der anderen Seite, aufgrund der kleinen Querschnitt von allgemein verwendeten Käfige für längere Wellenlängen wie bei der Zweiphotonenanregung verwendet wird, entweder eine hohe Konzentration des photoaktivierbaren Verbindung oder sehr hoch ist, potentiell phototoxischen Lichtintensitäten erforderlich sind. Auch Zwei-Photonen-Photofreisetzung erfordert eine viel höhere Investitionen in die Ausrüstung; unter anderem eine zusätzliche IR-Laser sowie die erforderlichen optischen Komponenten benötigt werden. Sowohl SBFI und MNI-Glutamat sind erregbar in der identischen Wellenlängenbereich. Dies kann zu einer ungewollten Wechselwirkungen von UV-Laser und Uncaging SBFI oder IR-Imaging und Laser-MNI-Glutamat führen, was in der Bleich SBFI vom Uncaging Flash und / oder einer kontinuierlichen Uncaging von Glutamat durch die IR-Strahl. Wie in 6C gezeigt, weder eine UV-Blitz selbst noch die Mehrphotonenabbildungs ​​verursacht jedoch solche Wechselwirkungen unter unseren experimentellen Bedingungen. UV-Blitzsysteme ähnlich dem hier beschriebenen werden routinemäßig in vielen Laboratorien und relativ einfach in bestehende Multi-Photonen-Imaging-Mikroskop aufgenommen werden. Es bietet den Vorteil, dass der Laserstrahl für die Photolyse frei im Blickfeld befinden. Darüber hinaus ermöglicht das System eine schnelle und automatische Neupositionierung des Laserstrahls und die Freisetzung Volumen bzw. in das Blickfeld während eines Experiments. Our Änderung vereinfacht und verbessert die genaue Positionierung des Uncaging Ort, so dass die Rahmen der Imaging-Software kann auf Bildgebung und Uncaging Rahmen deckungsgleich einstellen zu dienen. Zusammengenommen Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Natrium-Bildgebung in Dendriten und Dornen des zentralen Neuronen, verbunden mit einem modifizierten Verfahren für UV-Licht induzierte Photofreisetzung von Glutamat, eine zuverlässige und Brenn Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe. Es kann somit dazu dienen, die Eigenschaften der exzitatorischen synaptischen Transmission und postsynaptischer Natrium Signale in Neuronen im intakten Gewebe zu analysieren.

Jüngste Verbesserungen in der lichtmikroskopischen Techniken wie Multi-Photonen-Mikroskopie wurden die Untersuchung der morphologischen und physiologischen Parametern von Hirnzellen in das intakte Gewebe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. In Kombination mit der Elektrophysiologie werden diese Techniken, die heute häufig verwendet, um leistungsbezogenen elektrischen Signale auf Neuronen sowie gleichzeitige Calciumsignale in kleinen Zellkompartimenten zu analysieren, und zwar in feinen Dendriten und Dendriten. Neben Calcium Transienten induziert synaptische Aktivität auch Natrium-Signale in Dendriten und Dornen, sind die Eigenschaften, die weitgehend unerforscht. Solche Signale können durch Zwei-Photonen-Bildgebung von intrazellulären Natrium ([Na +] i), die die Online-Messung von [Na +] i-Transienten über längere Zeiträume ohne nennenswerte Farbbleich-oder Foto-Beschädigung 1,2 können analysiert werden. Für die Bildgebung von [Na +] i </sub&gt;, sind nur ein paar chemische Indikatorfarbstoffe zur Verfügung, zB Corona Grün oder Grün Asante Natrium 3,4. Die am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Sonde für Na + Abbildungs ​​Natrium-bindenden benzofuran-isophthalat (SBFI). Es ist eine ratiometrische, UV-angeregten Farbstoff ähnlich dem bekannten Calcium-sensitiven Farbstoffs Fura-2 und hat für konventionelle Na +-Bildgebung in vielen Zelltypen eingesetzt worden (zB 5,6). Es gibt verschiedene Möglichkeiten der Anregung des Farbstoffs und das Sammeln ihrer Fluoreszenz. Wenn hohe zeitliche Auflösung (dh eine hohe Abbildungsbildrate) wird in Kombination mit räumlichen Informationen benötigt, kann SBFI aufgeregt mit einer Xenon-Bogenlampe oder einer Hochleistungsleuchtdiode (LED) Gerät und seine Emission mit einem High-Speed-Ladung festgestellt werden -gekoppelten Vorrichtung (CCD-Kamera) 7,8. Für maximale räumliche Auflösung tief im Gewebe, ist Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie die Methode der Wahl 9. Die relativ niedrige Quanten efficiency von SBFI erfordert relativ hohe Farbstoffkonzentrationen (0,5-2 mm) und Direktbeladung der Membran-undurchlässig Form SBFI über einen scharfen Mikroelektroden 10 oder Patch-Pipette 1. Mit SBFI, früheren Arbeiten in akuten Gewebeschnitten der Nagetier-Hippocampus durchgeführt demonstriert tätigkeitsbezogene Natrium Transienten in Dendriten und Stacheln von CA1 Pyramidenzellen, die vor allem durch Einstrom von Natrium durch ionotropen NMDA-Rezeptoren verursacht werden 1,2. Für die Untersuchung der Eigenschaften derartiger lokaler Natrium Signale genauer ist eine spezifische Aktivierung von postsynaptischen Rezeptoren durch Anwendung der Rezeptoragonisten eine gut geeignete Methode der Wahl. Um präsynaptischen Aktivität und Transmitterfreisetzung zu imitieren, sollte die Anwendung relativ kurz sein und konzentrierte sich auf lokale Stimulation ermöglichen. Dies erweist sich jedoch als ziemlich schwierig in der intakten Gewebe sein. Lokale Anwendung von Druck-Rezeptor-Agonisten mit einem spitzen Pipette ermöglicht eine sehr Brenn apdung, beherbergt aber das potenzielle Risiko für die Herstellung von Bewegung der Struktur von Interesse (zB wie einem Dendriten oder dendritischen Dornen) und damit behindert hochauflösende Bildgebung. Die Eignung der Iontophorese von neuroaktiven Substanzen hängt von ihrer elektrischen Eigenschaften und die hohe Stromamplituden zellulären Artefakte auch zu produzieren. Ein Weg, um diese Hindernisse zu umgehen ist der Einsatz von Photo-aktivierten Verbindungen und ihre Blitzphotolyse. Grundsätzlich werden zwei verschiedene Prinzipien für Foto-Aktivierung von caged Substanzen verwendet: I) Weitwinkel-Blitzphotolyse 11 und II) Brenn Uncaging Einsatz Scanmodule in Kombination mit Lasern 12. Während Weitfeld Blitzphotolyse wird verwendet, um größere Bereiche von Interesse zu aktivieren, zB eine gesamte Zelle, die Brenn Uncaging wird eingesetzt, um gezielt zu stimulieren kleinen zellulären Kompartimenten. In der vorliegenden Studie wurde ein Verfahren zur Ganzzell-Patch-Clamp-und Multi-p zeigen wir,hoton Natrium Bildgebung in Dendriten und Dornen des zentralen Neuronen, verbunden mit einem modifizierten Verfahren für UV-Licht induzierte Photofreisetzung von Glutamat, die zuverlässig und Brenn Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, Wandstärke 0,3 mm</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC kompatible Kamera</td></tr><tr><td>Dekonvolutionssoftware</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptisches Spektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Miniatur-Lichtleiterspektrometer</td></tr><tr><td>Filterrohre</td><td>VWR</td><td></td><td>Zenrifugalfilter, 0,2 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Imaging-Software</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>IR-Strahlleistungsregler</td><td>Speziell angefertigte</td><td></td><td>Steuerung der Laserstrahlintensität + schnelle Umschaltung auf Null beim Flyback über Pockels-Zellen-IR-Laser</td></tr><tr><td></td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-gepulster Ti:Sa-abstimmbarer Laser (710 - 990 nm); VORSICHT</td></tr><tr><td>IR-Leistungsmonitor</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop/Bildgebungssystem</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Sowohl das Mikroskop als auch die Bildgebungssysteme wurden stark modifiziert</td></tr><tr><td>ND-Filterrad</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>UV-Quarzglas, optische Dichte 0,05 - 2,0</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Narishige</td><td>Modell PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatisches Medikamentenabwurfsystem</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Pockels-Zelle</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, wird als Schnellschalter und zur Leistungseinstellung</td></tr><tr><td>verwendet Pockels-Zelle Treiber</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>Hochspannungs-Differenzverstärker</td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF2beschichtete BeCu-Blades</td></tr><tr><td>Shutter-Controller</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shutter-Treiber</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Entdeckungssoftware</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV-Laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; VORSICHT</td></tr><tr><td>UV-Laserscanning-System</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Galvanometrisches Scansystem</td></tr><tr><td>Name der Verbindung</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>><Kommentare/ Beschreibung</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA-Rezeptor-Antagonist; VORSICHT</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA-Rezeptor-Antagonist; VORSICHT</td></tr><tr><td>SBFI K+ Salz</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor spannungsabhängiger Na+ Kanäle; VORSICHT</td></tr><tr><td>NMI-Cage-L-Glutamat</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Käfig-Glutamat wird bei UV-Absobtion freigesetzt</td></tr></tbody></table>

multi-photonen-intrazelluläre sodium imaging kombination mit uv-vermittelten brenn uncaging von glutamat in ca1 pyramidenzellen

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie wurde die Analyse von morphologischen und physiologischen Parametern von Hirnzellen in das intakte Gewebe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. In Kombination mit der Elektrophysiologie, wird häufig verwendet, um aktivitätsbezogenen Calciumsignale in kleinen subzellulären Kompartimente wie Dendriten und dendritischen Dornen studieren. Neben Calcium Transienten induziert synaptische Aktivität auch postsynaptische Natriumsignale, deren Eigenschaften nur unwesentlich verstanden. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die kombinierte Ganzzell-Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Natrium-Bildgebung in der zellulären Mikrodomänen von zentralen Neuronen. Darüber hinaus führen wir eine modifizierte Verfahren für ultra-violetten (UV)-light-induzierte Uncaging von Glutamat, die eine zuverlässige und Schwer Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe ermöglicht. Zu diesem Zweck wurden Ganzzell-Aufzeichnungen auf Ammonshorn Teilung 1 (CA1) Pyramidenzellen bei akuter Gewebeschnitt der durchgeführtenMaus Hippocampus. Neuronen wurden mit Natrium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff SBFI durch die Patch-Pipette gefüllt ist, und Multi-Photonen-Anregung von SBFI aktiviert die Visualisierung von Dendriten und benachbarten Dornen. Um die UV-induzierte Brenn Uncaging zu schaffen, wurden mehrere Parameter, einschließlich der Lichtintensität, Volumen durch die UV-Strahlen Uncaging betroffen, Positionierung des Strahls sowie Konzentration der Käfigverbindung getestet und optimiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die lokale Perfusion mit geschütztem Glutamat (MNI-Glutamat) und ihre Brenn UV-Uncaging Ergebnis in Einwärtsströme und Natrium Transienten in Dendriten und Dornen. Zeitverlauf und die Amplitude der beiden Ströme nach innen und Natrium Signale korreliert mit der Dauer des Impulses Uncaging. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die intrazelluläre Natrium Signale werden in Gegenwart Blocker ionotropen Glutamat-Rezeptoren blockiert, was zeigt, dass sie von Natrium-Influx obwohl dieser Weg vermittelt. Zusammenfassend stellt unser Verfahren ein zuverlässiges Werkzeug für dieUntersuchung der intrazellulären Natrium-Signale durch fokale Rezeptor-Aktivierung in intakten Hirngewebe induziert.

In der vorliegenden Studie zeigen wir, ein Verfahren für die Multi-Photonen-Mikroskopie von zellulären Natrium Dynamik mit den natriumabhängigen Fluoreszenzfarbstoff SBFI in CA1-Pyramidenneuronen des Hippocampus der Maus akuten Gewebeschnitten. Darüber hinaus zeigen wir, wie man diese bildgebenden Verfahren mit Laser-Scanning-basierte Uncaging neuroaktiven Verbindungen (zB geschütztes Glutamat) und die präzisen Targeting, um zelluläre Mikrodomänen kombinieren. Laden Neuronen mit SBFI durch die Patch-Pipette aktiviert die Visualisierung der gesamten Zelle mit feinen Dendriten und benachbarten Stacheln durch Verwendung Multi-Photonen-Anregung (6A, B, D und 7A). <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> Abbildung 6. Sodium Signale und synaptische Ströme durch Flash-Photolyse von caged Glutamat induziert. (A) Maximal Projektionsbild eines CA1 Pyramidenzelle über die Patch-Pipette (PP) mit SBFI geladen. Der Kasten zeigt das gezeigte in B. LP vergrößert Bereich zeigt die Position und Orientierung der Pipette für die lokale Durchblutung geschütztes Glutamat. (B) Hochleistungsmaximum Projektion von einem Stapel von optischen Schnitten eines Dendriten mit angrenzenden dendritischen Dornen. Die Stapel optischer Schnitte unter z-Ausrichtung und Entfaltung. Das rote Kreuz zeigt die Zielregion des Uncaging Strahl. Die orange gepunktete Linie umreißt den Bereich von Interesse, von dem die Fluoreszenzemission aufgezeichnet. Die Box gibt den dargestellten Bereich in D. (C) vergrößert Links: Sodium-Signal (obere Reihe) und somatische innen Strom (untere Reihe) durch Flash-Photolyse von caged Glutamat (von gelber Blitz gekennzeichnet) induziert. Die rote Linie stellt eine Anpassung der experimentellen Daten. Der graue Bereich stellt die Periode, in der die Uncaging Blitz (300msec) behindert die Abbildung der Fluoreszenz SBFI. Rechts: Ohne Vor-Perfusion mit geschütztem Glutamat, das gleiche UV-Blitz weder evozierte eine Änderung in SBFI Emissions, noch einen nach innen gerichteten Strom (D) Links:. Hohe Leistungs Bild des Dendriten und den angrenzenden Stacheln wie in B abgegrenzt Daneben das gleiche Bild mit umgekehrten Grauwerte. Die gepunkteten Linien zeigen die Bereiche von Interesse, bei denen die Fluoreszenzemission aufgezeichnet. Das rote Kreuz zeigt die Lokalisierung der Uncaging Strahl. Rechts: Sodium Transienten, die durch UV-Flash-Photolyse von caged Glutamat induziert. Blaue Kurve: Natrium-Signale in Dendriten; rote Spur: Mittelwert der Reaktion von drei Stacheln neben dem Uncaging Ort; grüne Spur: Mittelwert der Reaktion von drei entfernten Stacheln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> Nach lokalen Perfusion mit CagedGlutamat, Aufbringen eines UV-Blitzes in der Nähe eines Dendriten in Folge einer vorübergehenden Abnahme der Fluoreszenzemission von SBFI, was eine Zunahme der intrazellulären Natriumkonzentration (6C, D und 7B). Zur gleichen Zeit wurde ein Einstrom im Soma (6C und 7B) aufgezeichnet. Erhöhen der Dauer der UV-Blitz Folge zunehmenden Amplituden sowohl der nach innen hervorgerufenen Ströme und die Natriumsignale (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass das System gut innerhalb seines Dynamikbereichs und weder Uncaging oder zellulären Reaktionen wurden gesättigt. Aufbringen einer UV-Blitz gleicher oder längerer Dauer, um Scheiben, die nicht mit geschütztem Glutamat vorge perfundiert waren, nie ausgelöst Änderungen SBFI Fluoreszenz noch Einwärtsströme, was anzeigt, daß diese Signale durch die Demaskierung Glutamat (Figur 6c). Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass keine gegenseitige Abhängigkeit der Patientenlagerungs- und Uncaging Komponenten u beobachtetnder unseren experimentellen Bedingungen. Natrium-Signale auch in dendritischen Dornen (6D) detektiert werden. Während wir nicht versuchen, der Stimulation eines einzelnen Wirbelsäule nur mit Glutamat Uncaging erreichen, tendenziell Spitzenamplituden zu sein in der Nähe der Stacheln Uncaging Stelle etwas höher, während weiter entfernt Stacheln zeigten nahezu identische Fluoreszenzänderungen als Mutter Dendriten (6D). Schließlich untersuchten wir den Weg für Natrium-Einstrom in Dendriten und Dornen in Reaktion auf Uncaging von Glutamat. Zu diesem Zweck verwendeten wir CNQX und APV, die selektive Blocker für die Natrium-permeable, ionotropen Glutamat-Rezeptoren des AMPA- und NMDA-Subtyps bzw. sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Glutamat-induzierte intrazelluläre Natriumsignale und die hervorgerufene Körperströme wurden in der Gegenwart dieser Blocker (7B) weggelassen. Nach Auswaschen der Blocker, werden die Signale wieder. Dies zeigt, that Uncaging von Glutamat aktiviert ionotropen Glutamat-Rezeptoren auf CA1-Pyramidenneuronen, die den Einstrom von Natrium in Dendriten und Dornen zu vermitteln, was in der intrazellulären Natrium-Transienten und Einwärtsströme. <img alt="Figur 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> Abbildung 7. pharmakologische Profil von Natrium evozierte Signale und Einwärtsströme. (A) SBFI gefüllten CA1 Pyramidenzelle mit Patch-Pipette (PP) mit dem Soma befestigt (B) Links:. Sodium vorübergehend und somatischen Strom, der durch Photoaktivierung von geschütztem Glutamat in einem Dendriten induziert und befestigt Stacheln Center:. Perfusion mit der ionotropen Glutamatrezeptorblocker CNQX und APV hemmt sowohl die Natrium-Signal und die nach innen gerichteten Strom von Photofreisetzung induzierten. Rechts: Nach dem Auswaschen der Blocker die Signale wiederhergestellt werden. Die rote Linie repräsents eine Anpassung der experimentellen Daten. Der graue Bereich stellt die Periode, in der die Uncaging Blitz (300 ms) behindert die Abbildung SBFI Fluoreszenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben die Kombination von Brenn UV-induzierten Photoaktivierung von neuro-Wirkstoffe mit Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in Dendriten und Dornen von Neuronen im Hippocampus bei akuten Gewebeschnitten von Mausgehirn.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Natriumdynamik in kleinen zellulären Kompartimenten, wie Stacheln und Dendriten zentraler Neuronen im intakten Gewebe, zu evozieren und zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein akuter Hippocampusschnitt der Maus präpariert, ein pyramidales Neuron mit dem natriumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff SBFI durch eine Patch-Pipette beladen und die zelluläre Morphologie mittels Multiphotonenanregung sichtbar gemacht wird. Die nächsten Schritte bestehen darin, einen stacheligen Dendriten für das Experiment auszuwählen und eine photoaktivierte Verbindung wie Glutamat im Käfig in die Nähe dieses Dendriten zu injizieren.Anschließend wird ein UV-Blitz auf Foley Uncaaged Glutamat angewendet, wobei ein UV-Laser verwendet wird, der genau positioniert wurde, um ein kleines Volumen in der Nähe des gewünschten Dendriten zu erreichen. Der letzte Schritt besteht darin, die resultierenden Änderungen der SBFI-Fluoreszenz im Dendriten und die daraus resultierenden Änderungen des Natriums in den angrenzenden Dornen zu überwachen. Auch die begleitenden Membranströme werden erfasst.Letztendlich wird die Verwendung geeigneter pharmakologischer Werkzeuge wie Rezeptorblocker die Untersuchung der Mechanismen ermöglichen, die die evozierten intrazellulären Natriumsignale erzeugen. Diese Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug für die Untersuchung intrazellulärer Natriumsignale in kleinen zellulären Kompartimenten und in intaktem Hirngewebe. Hier kombinieren wir Ganzzell-Patch-Clamp und Multiphotonen-Natrium-Bildgebung mit einem modifizierten Verfahren zur UV-Licht-induzierten Entkäfigung.Es ermöglicht uns, zelluläre Reaktionen bei präzisen und gezielten Anwendungen von neuroaktiven Verbindungen zu überwachen. Das Verfahren wird von Karl KA und Kaan Kleinhans, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Um mit der Dissektion des Gewebes zu beginnen, legen Sie das Gehirn sofort in eine Petrischale mit eiskalter Dissektion, künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit oder A CSF und präparieren Sie eine Hemisphäre, indem Sie einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie durchführen.Führen Sie einen zweiten Schnitt in der gewünschten Ausrichtung als Blockierfläche durch. Befestigen Sie diesen dann mit Sekundenkleber an der Schnittstufe eines Vibrams. Nachdem Sie die Schneidkammer und das Kühlelement des Vibrams aus dem Gefrierschrank genommen haben, platzieren Sie den Schneidtisch mit dem Gehirnteil in der Kammer.Legen Sie dann das Kühlelement in die Kammer und tauchen Sie das Gewebe in eiskalte Dissektion A CSF. Schneiden Sie anschließend 250 Mikrometer dick auf. Para sagittale Schnitte des Hippocampus mit einem Viom.Stellen Sie sicher, dass eine CS-Flüssigkeit jederzeit Blasen abgibt. Nach dem Schneiden das Gewebe auf einem Netz in einem Becherglas mit normalem A-Liquor aufbewahren und 30 Minuten bei 34 Grad Celsius inkubieren. Halten Sie das Gewebe nach der Inkubation bei Raumtemperatur.Dieses Experiment sollte in einer dunklen Umgebung durchgeführt werden, wird hier aber zu Filmzwecken unter schummrigen Lichtverhältnissen gezeigt. Um die Hardware vorzubereiten, schalten Sie zunächst die Komponenten des Multiphotonensystems ein und stellen Sie die Ausrichtung des Infrarot-Laserstrahls ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Passen Sie dann die Wellenlänge und die Strahlintensität des Multiphotonenlasers an, indem Sie die Einstellungen der PCAL-Zelle und der Photomultiplier ändern.Schalten Sie als Nächstes das Entladungssystem ein und kalibrieren Sie es, indem Sie einen fluoreszierenden Probenobjektträger unter die Objektivlinse legen. Starten Sie die Kalibrierungsroutine der Steuerungssoftware für die Entdeckungseinheit. Stellen Sie den UV-Laser auf mehrere Punkte innerhalb seines Scanbereichs ein, während die Fluoreszenz mit einer CCD-Kamera erfasst wird, indem Sie auf den UV-Laserspot klicken.Passen Sie an jedem Punkt die Positionierung der galvanischen Scanspiegel so an, dass sie einer bestimmten Koordinate in der Software entspricht. Die genaue Positionierung des Auskäfigungsspots wird durch den Import eines Bildes des Bildgebungssystems über eine Netzwerkverbindung zwischen Auskäfig- und Bildgebungsrechnern erreicht. Mit Hilfe einer Screengrabber-Software lesen Sie kontinuierlich die Frames der Imaging-Software aus und passen die Bildgebung an.Und dann exportieren die Caging-Frames kongruent jedes 10. Bild aus der Bildgebungssoftware als Referenzbild in das Blitzgerät, um eine korrekte Anpassung während des gesamten Experiments zu gewährleisten. Schalten Sie als Nächstes die elektrophysiologischen Komponenten der Mikromanipulatoren und das Druckanwendetor ein, um die eingesperrte Verbindung in die Zielregion zu bringen. Ziehen Sie Pipetten für die Ganzzell-Patch-Klemme und lokale Fülle mit feuerpolierten Kapillaren aus Boro-Silikatglas.Legen Sie dann die Scheibe in das Versuchsbad und um sie mit einem Gitter zu fixieren, stellen Sie das Bad auf den Mikroskoptisch und perfundieren Sie die Scheibe dauerhaft mit A CSF. Beginnen Sie mit der Klemmung des Ganzzellpflasters, indem Sie die Patch-Pipette mit intrazellulärer Lösung oder ICS bestücken, die SBFI enthält, und beladen Sie dann die lokale Perfusionspipette mit einer Käfigverbindung. Befestigen Sie die Pipetten an den entsprechenden Mikromanipulatoren und legen Sie die Referenzelektrode in das Bad.Wählen Sie eine CA-Pyramidenzelle mit einem Soma, das sich 30 bis 70 Mikrometer unter der Oberfläche der Scheibe befindet, um eine intakte Zellmorphologie sowie eine geringe Streuung und Abschwächung des Entriegelungsstrahls zu gewährleisten. Nähern Sie sich dieser Zelle mit einer Patch-Pipette unter Verwendung der IR-DIC-Videomikroskopie. Sanft saugen, bis eine Giga-Versiegelung erreicht ist.Kompensieren Sie schnelle Kapazitäten. Brechen Sie dann die Membran auf und öffnen Sie die Zelle, um die Zellkonfiguration zu erhalten. Beurteilen Sie abschließend die Lebensfähigkeit der Zellen im Strom-Clamp-Modus.Injizieren Sie einen depolarisierenden Strom und prüfen Sie, ob die daraus resultierende Spike-Aktivität vorhanden ist, um Bildgebung und Stimulation durchzuführen. Zuerst wird tetro DOIND zu A CSF hinzugefügt, um die Aktivierung spannungsgesteuerter Natriumkanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen zu verhindern. Visualisieren Sie die zelluläre Morphologie durch Multiphotonenanregung und die daraus resultierende SBFI-Fluoreszenz.Wählen Sie einen stacheligen Dendriten für das Experiment. Vergrößern Sie die Ansicht, um Bilder mit einer höheren Auflösung anzuzeigen, und platzieren Sie einen Cliprahmen um den Dendriten. Platzieren Sie dann die Pipette mit der eingesperrten Verbindung in der Nähe des Dendriten.Positionieren Sie die Pipette so, dass eine effiziente lokale Perfusion des Dendriten Ihrer Wahl möglich ist. Passen Sie den Entriegelungslaser so an, dass der Entriegelungspunkt in der Nähe der gewünschten Struktur positioniert wird. Legen Sie als Nächstes mit Hilfe einer Bildgebungssoftware die interessierenden Regionen auf dem ausgewählten Dendriten und den angrenzenden Stacheln fest.Nähern Sie sich der Region of Interest und injizieren Sie die eingesperrte Verbindung für einige Sekunden mit Niederdruck-Start-, Patch-, Clamp- und Fluoreszenzaufzeichnungen über das Triggersignal. Während der lokalen Üppigkeit der Käfigverbindung wird der Anregungsstrahl vollständig gedimmt, um ein Ausbleichen zu verhindern. Stoppen Sie als nächstes die lokale Überfluss des Käfiggemisches.Erhöhen Sie dann die Intensität des Zwei-Photonen-Lasers, um eine effiziente Anregung von SBFI zu ermöglichen, und wenden Sie einen UV-Blitz an, um beim Caging zu initialisieren, Monitoränderungen der SBFI-Fluoreszenz sowie des somatischen Stroms fahren fort, um die Aufzeichnung zu stoppen, nachdem sich die SBFI-Fluoreszenz wieder auf den Ausgangswert erholt hat. Um die Morphologie zu erhalten, zeichnen Sie einen XY- und Z-Stapel des Clipbox-Bereichs auf, der für die durchgeführten Messungen festgelegt wurde. Stellen Sie sicher, dass dieser Stack räumlich überabgetastet wird, um eine optimale Bildentfaltung zu ermöglichen und die Bildqualität und -auflösung zu erhöhen.Das Beladen von Neuronen mit SBFI durch die Patch-Pipette ermöglichte die Visualisierung der gesamten Zelle, einschließlich feiner Dendriten und benachbarter Stacheln, durch den Einsatz von Multiphotonenanregung nach lokaler Perfusion mit eingesperrtem Glutamat. Die Anwendung eines UV-Blitzes in der Nähe eines Dendriten führte zu einer vorübergehenden Abnahme der Fluoreszenzemission von SBFI, was einen Anstieg der intrazellulären Natriumkonzentration widerspiegelt. Gleichzeitig wurde bei der SOMA-Anwendung eines UV-Blitzes auf Scheiben ein Einströmstrom aufgezeichnet, der nicht mit Glutamat im Käfig vorperfundiert worden war.Es wurden nie Veränderungen der SBFI-Fluoreszenz oder der nach innen gerichteten Ströme hervorgerufen, was darauf hindeutet, dass diese Signale auf das Lösen von Glutamat zurückzuführen sind. Die Spitzenamplituden waren in den Stacheln in der Nähe des Ausscheidepunktes etwas höher, während die Muster für weitere Dornen dem Elterndendriten ähnelten. Der Weg für den Natriumeinstrom in Dendriten und Stacheln als Reaktion auf das Lösen von Glutamat wurde unter Verwendung selektiver Blocker für die natriumdurchlässigen ionotropen Glutamatrezeptoren untersucht, Glutamat-induzierte intrazelluläre Natriumsignale und die ausgelösten somatischen Ströme wurden in Gegenwart dieser Blocker weggelassen.Nach dem Auswaschen der Blocker werden die Signale wiedergewonnen, was zeigt, dass das Lösen von Glutamat zytotrope Glutamatrezeptoren auf ca. 1 pyramidalen Neuronen aktiviert, was zu intrazellulären Natriumtransienten und nach innen gerichteten Strömen führt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die niedrigstmögliche Intensität für den Infrarotlaser zu wählen, um Schäden an der Vorbereitung zu minimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die kritischen Schritte unseres experimentellen Ansatzes zur Untersuchung der Natriumsignalübertragung in zellulären Mikroüberresten haben. Sobald diese Technik beherrscht wird, ermöglicht sie eine hochauflösende Bildgebung von aktivitätsevozierten intrazellulären Ionensignalen im intakten Gewebe, das frei von Bewegungsartefakten ist, wie sie durch andere Techniken eingeführt wurden.

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung von in vitro Ca2+ Flussflüssen in Midbrain-Neuronen und deren nachgelagerten Auswirkungen auf Caspase-3 unter Verwendung primärer Maus-Midbrain-Kulturen vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit abnormalen Ca2+ Aktivität in Midbrain Neuronen zu studieren, und um neue Therapeutika für anti-apoptotische Eigenschaften zu überprüfen.

Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Lernen Sie die Analyse von Natriumdynamiken in Dendriten und Dornenfortsätzen von Hippocampus-Neuronen mittels UV-induziertem Uncaging von Glutamat und Multiphotonen-Imaging. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Signalwege.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Weitere Videos entdecken