Name: Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie toxikologische Tests mit dem epigenetischen Medikament DZNep an Malariamücken. Diese Methode untersucht Entwicklung, Fruchtbarkeit und Überlebensraten von Anopheles gambiae für neue Vektorbekämpfungsstrategien.

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Wir danken Victor Marquez für die Bereitstellung von DZNep.HCl und Scotty Bolling für die Herstellung der Bluternähren. Die Mopti- und SUA2La-Stämme von An. gambiae wurden vom Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) bezogen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Fralin Life Science Institute und das Stipendium der National Institutes of Health 1R21AI094289 an Igor V. Sharakhov.

Anmerkung: Die drei Teile des Protokolls beschreiben die wässrige Belichtung des DZNep Medikament Larven Mücken, einem blutbasierten Belichtung DZNep an erwachsene Weibchen ihre Wirkung der Fruchtbarkeit zu untersuchen und SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep gemessen unter Verwendung eines einfachen kolorimetrischen Technik. Eine schematische Darstellung dieser Untersuchungen ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Unreife Mosquito Entwicklung und Hinterbliebenen Assays HINWEIS: Dieser Abschnitt erklärt die Verwendung eines wasserlöslichen Wirkstoff, der Mückenlarven Entwicklung und das Überleben beeinflusst. <ol><li> Hatch A. gambiae Eier bei 28 ° C in destilliertem Wasser (dH 2 O) und Rück sie 2. Larvenstadium. </li><li> Nehmen Sie ein Sechs-Well-DNase, RNase freie Zellkulturplatte und gießen Sie 10 ml dH 2 O in jede Vertiefung. </li><li> Wählen Mückenlarven an 2. Larvenstadium und fügen 15 Larven pro Vertiefung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium bis zum Teller, S.ut sie auf einem Papiertuch für 2-3 Sekunden, um überschüssiges Wasser zu entfernen. </li><li> Label-Brunnen mit farbcodierten Bänder Experiment zufällig. Beschriften Sie zwei Vertiefungen pro Testkonzentration auf jeder Platte (Abbildung 2). </li><li> Eine 1 mM DZNep chlorid (MW = 298,73) Stammlösung durch Auflösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O. Brühe Lösung DZNep.HCl kennzeichnungs Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 0,5 &amp; mgr; M und 5,0 &amp; mgr; M. HINWEIS: Die Stammlösung kann bei 4 gespeichert werden ° C für kurzfristige (1 Tag bis zu einem Monat) oder -20 ° C für die langfristige (länger als einen Monat). HINWEIS: Die Zugabe der Stammlösung zum vorgenannten Konzentrationen nicht das Volumen des Wassers in den Vertiefungen erheblich ändern. Jedoch im Falle von viel höheren Konzentrationen ist es ratsam, die Verbindung im Larvenmedium lösen, um eine unnötige Verdünnung der Verbindung zu vermeiden. </li><li> In gleicher Höhe Flocke Fischfutter in jede Vertiefung. Die Plattes und inkubieren Sie bei 28 ° C in einem Inkubator. </li><li> Notieren Sie sich die Sterblichkeit für die DZNep-behandelten und unbehandelten Larven Mücken nach einer 24-Stunden-Expositionszeit. Entfernen und entsorgen Sie keine toten Larven. Wiederholen Sie diesen Aufnahme jeden Tag, bis alle Larven sterben oder verpuppen und sich als Erwachsene. Nehmen die Größe Larven jeden zweiten Tag, das heißt Tag 0, 2, 4, 6, 8, bis sie Verpuppung. </li><li> Analysieren Sie die Entwicklung der Larven und Mortalitätsdaten mit einem geeigneten statistischen Analyse-Software. HINWEIS: Ein Balkendiagramm können die Mortalitätsdaten in Microsoft Excel darzustellen. Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) durchgeführt mit einer Software wie JMP oder SPSS wird zeigen, wenn verschiedene Dosen des Medikaments in signifikant das Überleben von Moskitolarven führen. </li></ol> 2. Fecundity Assay durch Verabreichung Drug durch künstliche Zufuhr an weiblichen Mücken HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Zugabe des Medikaments, um Blut einnd Verfütterung an erwachsenen weiblichen Moskitos mit einem künstlichen Feedersystem. <ol><li> Einrichtung für Erwachsene Moskitokäfige mit gleicher Anzahl von männlichen und weiblichen Mücken für Kontroll- und Testkäfig. Geben Sie 10% Zuckerlösung in Watte, sowohl den Käfigen, bis die Weibchen getränkt sind bereit für die Zuführung (3-5 Tage ist optimal für Anopheles gambiae). </li><li> 2 Stunden vor der blutsaugenden, entfernen Sie die Baumwollkugeln, um sicherzustellen, Weibchen sind hungrig. </li><li> Montieren Sie zwei künstliche Blut Anleger, die eines umgekehrten breiten unteren Glastrichter (Durchmesser = 50 mm, Länge = 70 mm) und einem umgebenden Kunststoff mit Industriekleber versiegelt bestehen. Befestigen Plastikröhrchen (Durchmesser = 7 mm), um zwei Zuführungen &#39;Auslässe (Durchmesser = 10 mm) über Anschlüsse für Zu- und Abfluss von Wasser. Beschriften Sie die zwei Zuführungen als &quot;Control&quot; und &quot;5 uM DZNep.&quot; </li><li> Mit einem handelsüblichen Heizelement, das Programm für die Fütterung eingestellt. In &quot;Menü&quot;, wählen Sie &quot;Einstellungen&quot;und wählen Sie &quot;Sollwerte&quot;; vorinstallierte Programme wird angezeigt. Wählen Sie &quot;SP1&quot; und stellen Sie die Temperatur für 37 ° C. HINWEIS: Der Heizkörper wird sichergestellt, daß das Blut verabreicht wird, bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Zusätzliche Programmeinstellungen können für verschiedene Moskito oder Insektenarten verwendet werden. </li><li> Füllen Sie einen Eimer mit Wasser und tauchen Sie das Heizelement in das Wasser. </li><li> Schneiden Sie ein Quadrat Stück Parafilm (50 mm x 50 mm), und ziehen Sie es, um eine dünne membranöse Film zu machen. Bedecken Sie den Boden der künstlichen Anleger, die mit dem Parafilm. Schneiden Sie ein Stück Parafilm (50 mm x 10 mm), ziehen Sie es und die Ränder der Anleger. </li><li> Bauen Sie das System, den Anschluss der Zuleitungen und Heizelement durch die Rohre. Einmal abgeschlossen, schalten Sie das System und wählen Sie &quot;SP1&quot;. Drücken Sie auf &quot;Enter&quot;, um das System zu starten. HINWEIS: Das Wasser wird auf 37 zu bekommen beheizt ° C und bei dieser Temperatur gehalten. </li><li> Überwachen the Temperatur des Wassers mit einem Thermometer in den Wassereimer. HINWEIS: Die Anschlüsse und Rohre zur Aufrechterhaltung eines konstanten Zirkulation des Wassers durch das System, so dass die Temperatur des Blutes bei 37 bleibt ° C. </li><li> Füllen Sie eine flache Bodenschale mit 10% Bleichmittel-Lösung, die verwendet werden, um irgendwelche Blutverschmutzungen dekontaminiert werden. </li><li> 2 ml defibrilliert Schafblut zu einem Reaktionsgefäß. Kennzeichnen Sie diese als &quot;Control&quot;. Wiederholen Sie den Vorgang für die Versuchsröhre als &quot;5 uM DZNep&quot; .Add 6 ul der DZNep Stammlösung (siehe Punkt 1.5) in die Versuchsröhre mit &quot;5 uM DZNep&quot; gekennzeichnet mischen Sie vorsichtig das Blut und Drogen durch Umdrehen es mehrmals. Das Röhrchen 10 min bei RT. </li><li> Mit einer Pipette 2 ml Kontroll- und Test Blut an die Spitze der entsprechend bezeichneten Anleger. Entsorgen Sie die Pipette in der Bleichlösung. Bedecken Sie den Käfig mit einem dunklen Tasche und atmen Luft am Käfig regelmäßig, um f fördernemales für die Fütterung. </li><li> Lassen Sie die Mücken ernähren ca. 30 min. Nach Zuführung abgeschlossen ist, schalten Sie das Heizelement, nehmen die Anleger aus und schneidet den Parafilm. Weichen Sie die Zuführung in Bleichlösung etwa 5 Minuten und spülen Sie gut in VE-Wasser. </li><li> Entfernen Sie die Feeder und legte Watte mit Zuckerwasser auf den Käfigen für 48 Stunden. Ein Eierspeise Wasser und Filterpapier, das in den Käfigen über Nacht auf die Eiablage zu erleichtern. Beschriften Sie jedes Eierspeise mit der jeweiligen Test- oder Kontroll Konzentration. </li><li> Entfernen Sie die Eierspeise nächsten Tag und untersuchen Sie die Anzahl und Struktur der Eier unter einem Stereomikroskop. Besorgen Sie Bilder mit der Q-colors5 Software. Die Anzahl der Eier. Analysieren Unterschied in der Anzahl von Eiern von Test- und Kontrollkäfigen erhalten. HINWEIS: Ein ungepaarter t-Test kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Zahl der Eier signifikant unterschiedlich (p ≤0.05) gestellt sind. </li></ol> 3. Biochemische Assay von Mosquito Enzyme Inhibitionvon Drug HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Enzym-Aktivitätstest unter Verwendung von DTNB als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. <ol><li> Vorbereiten einer 0,1 M Na 2 HPO 4 (dibasisches Natriumphosphat) Lösung durch Zugabe von 14,19 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O. Als nächstes bereiten eine 0,1 M NaH 2 PO 4 (Natriumdihydrogenphosphat) Lösung durch Zugabe von 13,79 g NaH 2 PO 4 zu 1 l dH 2 O. </li><li> Daraufhin wird die 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung mit 0,1 M NaH 2 PO 4 -Lösung auf pH 8,5. Hinweis: das wird die Arbeitsstammlösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) sein. </li><li> Vorbereiten einer Homogenisierung Lösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) durch Zugabe von 0,3% Triton X-100. HINWEIS: Die Homogenisierung Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Prepare ein 1,6 mM SAH (MW = 384,4) durch Auflösen von 6,15 mg von SAH in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Vorbereiten einer 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) durch Auflösen von 6,3 mg DTNB in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Halten Sie die frische DTNB-Lösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie eine 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) durch Lösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O Weiter verdünnt man das 1 mM DZNep Lösung in einer Reihe von Konzentrationen von 1,000 &amp; mgr; M bis 0,002 &amp; mgr; M in dH 2 O. </li><li> Um die SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep messen, bereiten eine Rohenzymextrakt Mücken: homogenisieren 10 Nicht-Blut-fed erwachsenen Mücken in 1 ml eiskaltem 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), das 0,3% Triton X- 100, mit einem Glas Gewebehomogenisator. Übertragen Sie das Homogenat zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren des Homogenats für 5 Minuten bei 10.000 × g bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden der Überstand als Enzymquelle für die SAH biochemischen Assays. </li><li> Für die Blindbehandlung (dh keine DZNep kein Enzym) werden 50 &amp; mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, und 100 &amp; mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) auf die einzelnen Vertiefungen einer 96-well, Flachboden-Mikrotiterplatte. </li><li> Für die Kontrolle (dh, kein DZNep) werden 50 &amp; mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 &amp; mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) und 50 ul Enzym (SAH Hydrolase aus Rohextrakt) erhaltenen Individuums Brunnen. </li><li> Für DZNep Behandlungen, fügen Sie 50 ul 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 ul Enzym und 50 ul ausgewählt DZNep Konzentration auf einzelne Vertiefungen. Bereiten Sie 4 Wiederholungen pro Behandlung und Kontrolle. </li><li> Lesen der optischen Dichte (OD) der SAH Enzymproben bei 405 nm für 5 Minuten bei 20 s Intervallen unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät. </li><li> Die OD des Leer OD von Steuer einnd Behandlung OD von jedem erhalten gut. Berechnen der verbleibenden SAH-Hydrolase-Aktivität unter Verwendung der folgenden Gleichung Prozent:% Restaktivität = (OD Behandlung / Kontrolle OD) × 100. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Es gibt mehrere Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Für die Larventest sollte darauf geachtet werden, um korrekt zu kennzeichnen und zu replizieren jede Testkonzentration werden. Randomisierung von Proben und das Hinzufügen der benannten Menge des Arzneimittels an die jeweiligen Testbrunnen ist ein wichtiger Teil dieser Versuchsanordnung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium von Moskitolarven in eine 96-Well-Mikroplatte, kann jede Larve auf einem Papiertuch für 2-3 sec gesetzt, um übersc...

Malaria ist für die höchste Anzahl von Insekten verursachten Todesfälle in der Welt verantwortlich. Schätzungsweise 219 Millionen Fälle treten jährlich weltweit, was zu etwa 660.000 Todesfällen, vor allem in Afrika ein. Trotz aller gemeinsamen Bemühungen, Malaria Programme mehrere Herausforderungen. Während insektizide behandelten Moskitonetzen und Innenrest Spritzen bilden wichtige Komponenten des Programms, Resistenz gegen Insektizide in der lokalen Bevölkerung behindern diese Bemühungen 2. Die rasche Zunahme der Insektizide resistent Mückenpopulationen weitgehend auf die Fähigkeit der Malariamücken, schnell auf Veränderungen in ihrer Umgebung anpassen und nutzen unterschiedliche Nischen 3,4,5 zugeschrieben. Um die bestehenden Mechanismen der Insektizid-Resistenz zu überwinden, ist die Erforschung von neuartigen Insektizid Ziele und nächste Generation Verbindungen gewährleistet. Eine einfache, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bestimmung der Wirksamkeit von experimentellen Insektizide auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Malaria-mosquitoes erheblich verbessern würde diese Bemühungen. Pharmakologische Untersuchungen der Wirkung von Medikamenten auf Zelllinien und Tiermodellen haben die Verwendung von epigenetischen Medikamenten als ein nützliches Werkzeug zur Modulation der Genetik und Physiologie von Zellen und Organismen hergestellt. DNA-Methylierung und Histon-Modifikation gibt zwei epigenetische Mechanismen, die die Genexpression in vielzelligen Organismen beeinflussen, ohne die zugrunde liegenden DNA-Sequenz 6. Post-translationale Modifikationen wie Methylierung spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und Genexpression und kann einige grundlegende Prozesse 7,8,9 beeinflussen. Forschung in einigen Insektenarten haben die Bedeutung der Epigenetik in Verfahren, die Oogenese hervorgehoben und Erhaltung von Stammzellen 10 sowie Dosiskompensation 11. Jedoch werden solche Aspekte der Krankheitsvektoren noch erforscht werden. Verwendung einer Verbindung, dieses System in Mücken modulieren, können Sie uns mit in liefernSehenswürdigkeiten in der neuen Insektizid Zielpfade. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) ist eine bekannte Histonmethylierung Inhibitor, der Auswirkungen auf die verschiedenen Arten von Krebs wurden untersucht 12,13,14,15,16. DZNep ist ein stabiles wasserlösliches Arzneimittel, das epigenetische indirekt hemmt Histon Lysin N-methyltransferase (EZH2), eine Komponente der Polycomb repressive Komplex 2 (PRC2) in Säugerzellen. PRC2 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Stammzellen in multizellulären Organismen und Histon-Methylierung ist ein Schlüsselaspekt der PRC2 vermittelte Gen-Silencing. Bei immungeschwächten Mäusen Zellen mit DZNep vorbehandelt wurde gezeigt, dass weniger tumorerzeugende 17 zu sein. Dieses Medikament wird immer für die Untersuchung anderer Krankheiten, wie zum Beispiel nicht-alkoholische Fettleber, in der EZH2 beteiligt ist 18 verwendet. DZNep ist ein etablierter S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) Hydrolaseinhibitors 19, 20. Die Hemmung der SAH-Hydrolase-Ergebnisse in eineAkkumulation von SAH und wiederum führt zur Hemmung der Methyltransferase-Aktivität durch die Begrenzung des verfügbaren methyl Donorgruppen. SAH ein Aminosäurederivat durch Organismen wie Insekten, in ihren Stoffwechselwege verwendet. Eine neue Studie hat gezeigt, dass DZNep in niedrigen Dosen können Diapause beeinflussen und verzögern die Entwicklung von Insekten 21 gezeigt. Hier wird ein robustes Verfahren, um die Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung von verschiedenen Lebensstadien von Moskitos zu untersuchen wird entwickelt. Die drei Teile des Protokolls enthalten Anweisungen für die Prüfung der Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung auf unreifen Moskitos, Erwachsenen Blut-Fütterung Frauen, und die Enzymaktivität der erwachsenen männlichen und weiblichen Mücken. Zuerst wird DZNep in Wasser gelöst, um unreifen Moskitos Entwicklung und das Überleben zu studieren. Dies wird in zwei Konzentrationen durchgeführt, um alle Unterschiede, die sich aus 10-fachen Anstieg der Wirkstoffexposition zu vergleichen. Um die Wirkung des Medikaments auf erwachsene weibliche Mücken, DZNep erkundenauf defibrilliert Schafblut hinzugefügt und das Blut künstlich zu Frauen geleitet. Anschließend wird das Ergebnis des Medikaments auf Fruchtbarkeit sucht. Schließlich wird ein Test der enzymatischen Aktivität unter Verwendung von 5,5&#39;-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. Während dieses Protokoll mit einem Malaria-Mücke, Anopheles gambiae entwickelt, kann es leicht zur Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen der Zinsen auf Stechmückenarten oder andere Insekten angepasst werden. Die in diesem Protokoll aufgeführten Techniken können nicht effizient auf ein Arzneimittel mit begrenzter oder keiner Löslichkeit in Wasser oder wäßrigen Medien angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Mikroplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatte</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>Es kann eine andere Zentrifuge verwendet werden</td></tr><tr><td>Farbige Bandrollen</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Eierschalenbecher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapiere</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Feeder</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgewebe-Homogenisator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizelement</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Percival wissenschaftliche</td><td>I36VLC8</td><td>Es kann ein anderer Inkubator verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 2&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät&nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>Store at -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

toxikologische tests zur prüfung auswirkungen eines epigenetische drug für entwicklung, fruchtbarkeit und hinterbliebenen von malariamücken

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insektizidresistenz stellt ein großes Problem für die Malariakontrollprogrammen. Mücken Anpassung an eine Vielzahl von Veränderungen in der Umwelt schnell, so dass die Malaria unter Kontrolle eine allgegenwärtige Problem in tropischen Ländern. Die Entstehung von resistenten Populationen Insektizid garantiert die Erforschung von neuartigen Arzneimittelziel Wege und Verbindungen für Vektor-Moskito-Kontrolle. Epigenetische Medikamente werden auch in der Krebsforschung etabliert, aber nicht viel über deren Auswirkungen auf Insekten bekannt. Diese Studie liefert ein einfaches Protokoll für die Prüfung der toxikologischen Wirkungen von 3-Deazaneplanocin A (DZNep), eine experimentelle zugelassene epigenetische Arzneimittel zur Krebstherapie, in der Malaria-Vektor, Anopheles gambiae. Eine konzentrationsabhängigen Anstieg der Sterblichkeit und Abnahme der Größe wurde in unreifen Moskitos zu DZNep ausgesetzt beobachtet, während die Verbindung reduziert die Fruchtbarkeit der erwachsenen Mücken in Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Darüber hinaus gab es eine drogenabhängige Abnahme der S -Adenosylhomocystein (SAH) Hydrolaseaktivität in Mücken nach Exposition gegenüber DZNep Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Diese Protokolle stellen die Forscher mit einer einfachen, Schritt-für-Schritt-Verfahren, um mehrere toxikologische Endpunkte für ein experimentelles Medikament zu beurteilen und wiederum zeigen eine einzigartige mehrgliedrige Ansatz für Ausflüge in die toxikologischen Wirkungen von wasserlöslichen epigenetische Arzneimittel oder Verbindungen Interesse gegen vector Mücken und andere Insekten.

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Assays; es die verschiedenen Schritte des in diesem Artikel genannten Verfahren beschreibt. Da das Protokoll auf die verschiedenen Lebensstadien Mücken basiert, gibt es keine besondere Reihenfolge für die Experimente detailliert hier folgen. Der Benutzer kann wählen, einen oder mehrere Assays gleichzeitig durchzuführen, je nach Proben Verfügbarkeit. Abbildung 2 zeigt die für den unreifen Moskitos Entwicklu...

Es wird ein Protokoll entwickelt, um die Auswirkungen eines epigenetischen Medikaments DZNep auf die Entwicklung, Fruchtbarkeit und Überlebensfähigkeit von Mücken zu untersuchen. In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren für die wässrige Exposition von DZNep gegenüber unreifen Mücken und eine blutbasierte Exposition von DZNep gegenüber adulten Mücken zusätzlich zur Messung der SAH-Hydrolase-Hemmung.

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen eines epigenetischen Medikaments auf verschiedene Lebensstadien von Malariamücken zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem das Medikament im Lebensraum der unreifen Mücken aufgelöst wird, um seine Auswirkungen auf die Larven, die Überlebensrate und die Körpergröße zu bestimmen. Das Medikament wird auch dem Blut von Säugetieren zugesetzt und an erwachsene weibliche Mücken verfüttert, wodurch die Wirkung des Arzneimittels auf die Fortpflanzung getestet wird.Schließlich wird ein Enzymassay durchgeführt, um die Hemmung des Mückenenzyms durch das Medikament zu testen. Die Ergebnisse zeigen die Auswirkungen epigenetischer Veränderungen auf die Überlebensrate von Malariamücken und für Conti auf der Grundlage von Bioassay-Analysen. Wir hatten zuerst die Idee für dieses Protokoll. Wenn wir erfahren, dass Din als vielversprechendes epigenetisches Medikament gegen Krebs entwickelt wird, induziert dieses Medikament den apoptotischen Tod in menschlichen Krebszellen, da ein Mechanismus für die histo-Modifikation konservierte Hormontiere sind, schmecken wir sozusagen als eine Wirkungs-App auf der Malariamücke.Wählen Sie zunächst die Larven der Novelis Gambi-Mücken an zweiter Stelle des Sterns aus und legen Sie sie zwei bis drei Sekunden lang auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Fügen Sie dann vorsichtig 15 Larven pro Vertiefung einer nukleasefreien Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen hinzu, die 10 Villaliter destilliertes Wasser pro Vertiefung enthält. Beschriften Sie die Vertiefungen mit farbcodierten Bändern, um das Experiment zu randomisieren.Beschriften Sie dann zwei Vertiefungen pro Testkonzentration auf jeder Platte. Als nächstes bereiten Sie eine einmillimolare Deasy NEP-Hydrochlorid-Stammlösung vor, indem Sie 0,3 Milligramm Deasy Nep auflösen. In einem Milliliter destilliertem Wasser wird die Stammlösung von Z NEP-Hydrochlorid in die markierten Vertiefungen gegeben, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikromolar und 5,0 Mikromolar zu erreichen.Die Zugabe der Stammlösung für die oben genannten Konzentrationen verändert das Volumen des Wassers im Brunnen nicht wesentlich. Bei wesentlich höheren Konzentrationen ist es jedoch ratsam, die Verbindung im Larvenmedium aufzulösen, um eine unnötige Verdünnung der Verbindung zu vermeiden. Nach Zugabe des Mischfutters die Larven 24 Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren.Erfassen Sie dann die Mortalität für die DZ NEP behandelten und unbehandelten Mückenlarven. Wiederholen Sie diese Aufzeichnung jeden Tag, bis alle Larven absterben oder sich verpuppen und schlüpfen. Als Erwachsene sollten Sie jeden Tag alle toten Larven entfernen und entsorgen.Erfassen Sie außerdem jeden zweiten Tag die Größe der Larven, bis sie pasteten, um den Fruchtbarkeitstest durchzuführen. Montieren Sie zunächst das künstliche Zuführsystem, das die Futterautomaten und das Heizelement über die Rohre verbindet. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie das System ein und wählen Sie SP eins.Drücken Sie die Eingabetaste, um das System zu starten. Überwachen Sie die Wassertemperatur mit einem digitalen Thermometer in der Heizungsanlage. Die Anschlüsse und Schläuche tragen dazu bei, eine konstante Wasserzirkulation durch das System aufrechtzuerhalten, so dass die Temperatur des Blutes erhalten bleibt.Bei 37 Grad Celsius. Füllen Sie eine Schale mit flachem Boden mit 10%iger Bleichlösung, die zur Dekontamination von verschüttetem Blut verwendet wird. Geben Sie anschließend zwei Milliliter defibrilliertes Schafsblut in ein Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie es als Kontrolle.Wiederholen Sie den Vorgang für das Versuchsröhrchen, das als fünf mikromolare DZ nep gekennzeichnet ist. Geben Sie dann sechs Mikroliter DZ NEP-Stammlösung in das Versuchsröhrchen mit der Bezeichnung fünf mikromolare DZ nep. Mischen Sie das Blut und das Medikament vorsichtig, indem Sie es mehrmals umdrehen, bevor Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.Geben Sie mit einer Pipette zwei Milliliter Kontrolle hinzu und testen Sie das Blut auf die Oberseite der entsprechend gekennzeichneten Futtertröge. Entsorgen Sie die Pipette in der Bleichlösung. Atmen Sie regelmäßig Luft in den Käfig, um die Weibchen zum Fressen zu ermutigen.Decken Sie den Käfig mit einem dunklen Beutel ab. Lassen Sie die Mücken etwa 30 Minuten lang fressen. Ist die Fütterung abgeschlossen, schalten Sie das Heizelement aus.Nehmen Sie die Feeder heraus und entfernen Sie die Para-Folie, nachdem Sie den Feeder und die Bleichlösung fünf Minuten lang eingeweicht haben. Gut in entionisiertem Wasser abspülen. Legen Sie anschließend Wattebällchen mit Zuckerwasser für 48 Stunden auf die Käfige.Eierspeisen, die mit der jeweiligen Test- oder Kontrollkonzentration beschriftet sind und Wasser und Filterpapier enthalten, über Nacht in die Käfige stellen. Um die Eiablage zu erleichtern, nehmen Sie die Eierschale am nächsten Tag heraus und untersuchen Sie die Anzahl und Struktur der Eier unter einem Stereomikroskop. Erfassen von Bildern, Zählen der Anzahl der Eier und Analysieren des Unterschieds in der Anzahl der Eier aus Test- und Kontrollkäfigen.Dieser Teil des Videos zeigt einen Enzymaktivitätsassay mit DTNB als Indikator, um die Wirkung von dz NEP auf die Hemmung von SAH Hydro Lace bei erwachsenen Mücken zu bestimmen. Um die Hemmung von SAH Hydro Lace durch DZ nep zu messen, bereiten Sie einen angefallenen Enzymextrakt aus Mücken vor, der homogenisiert wurde von 10 nicht mit Blut gefütterten erwachsenen Mücken in einem Milliliter eiskaltem 0,1 molaren monobasischem Natriumphosphat, das 0,3 % Tritton X 100 enthält. Übertragen Sie das Homogenat mit einem Homogenisator aus Glasgewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Nachdem Sie das Homogenat fünf Minuten lang bei 10.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert haben, überführen Sie das Supinat in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie das Supinat als Enzymquelle für den biochemischen SAH-Assay. Für den Rohling fügen Sie 50 Mikroliter SAH, 50 Mikroliter DTNB und 100 Mikroliter Diba-Natriumphosphat hinzu, um einen Mastermix zu erhalten, und geben Sie es in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden.Als nächstes werden für die Kontrolle 50 Mikroliter SAH, 50 Mikroliter DTNB, 50 Mikroliter Diba-Natriumphosphat und 50 Mikroliter SAH-Hydrolace-Enzym in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Geben Sie schließlich für DZ NEP-Behandlungen 50 Mikroliter SAH, 50 Mikroliter DTNB, 50 Mikroliter Enzym und 50 Mikroliter der ausgewählten DZ NEP-Konzentration in die einzelnen Vertiefungen. Bereiten Sie sich auf Replikationen pro Behandlung und Kontrolle vor.Lesen Sie die optische Dichte oder OD der SAH-Enzymproben bei 405 Nanometern fünf Minuten lang im 22. Intervall mit einem 96-Well-Mikroplatten-Reader ab. Subtrahieren Sie schließlich die Blind-OD von der Kontroll- und Behandlungs-OD, die aus jeder Vertiefung erhalten wurde, und berechnen Sie die prozentuale verbleibende SAH-Hydro-Lace-Aktivität. Unter Verwendung der Gleichung im Textprotokoll zeigen diese Ergebnisse, dass das epigenetische Medikament DZ NEP das Wachstum und die Entwicklung unterdrückt und die Mortalität bei unreifen Mücken induziert. Die Mehrheit der Mücken, die 0,5 Mikromolaren ausgesetzt waren, starb bis zum 10. Tag des Experiments, während eine große Anzahl von Mücken, die fünf Mikromolaren ausgesetzt waren, bis zum achten Tag starb.Im Gegensatz dazu blieb die Mortalität der Mücken in der Kontrollbehandlung unbeeinflusst und mehrere gingen am achten Tag des Experiments als Erwachsene hervor. Die Wirkung von DZ NEP auf die Fruchtbarkeit von Mücken wird hier veranschaulicht. Erwachsene weibliche Mücken, die mit DZ NEP enthaltendem Blut gefüttert wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Verringerung der Anzahl lebensfähiger Eier.Eine große Anzahl von Eiern aus dem Testkäfig hatte eine dunklere Farbe und es fehlten Schwimmer und rosettenartige Anordnungen im Vergleich zu Eiern, die von normalen, mit Blut gefütterten weiblichen Mücken gewonnen wurden. Das Fehlen von Schwimmern zusammen mit dunkler gefärbten Eiern deutet auf eine mögliche Rolle der Epigenetik bei der Bildung von Exo-Korionen hin. Hier wird die Wirkung von DZ NEP auf die SAH-Hydrolace-Aktivität bei erwachsenen männlichen und weiblichen Malariamücken demonstriert.Eine DZ NEP-abhängige Abnahme der OD wird bei jeder medikamentösen Behandlung im Vergleich zur Kontrollbehandlung beobachtet, was darauf hindeutet, dass dz NP die SAH-Hydrolace-Aktivität nach seiner Entwicklung hemmt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Vektorbiologie den Weg, um die Auswirkungen epigenetischer Medikamente auf die Malariamücke zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Interview, konzentriert sich George Dimopoulos auf die physiologischen Mechanismen von Mücken verwendet werden, um Plasmodium falciparum und Dengue-Virus-Infektionen zu bekämpfen. Erklärung dafür, wie Schlüssel feuerfesten Gene gegeben ist, sind die Gene, die Resistenz gegen Pathogene Vektor, in der Mücke identifiziert und wie dieses Wissen genutzt, um transgene Moskitos, die nicht in der Lage, die Malaria-Parasiten oder Dengue-Virus in sich tragen sind zu generieren.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

In diesem Video demonstrieren wir den topischen Test-Assay, um die Toxizität eines potenziellen Insektizids auf erwachsene weibliche Mücken zu bestimmen. Unter Verwendung eines Dopaminrezeptor-Antagonisten, der eine tödliche Hemmung der Neurotransmission bei Mücken bewirkt, beschreibt diese Methode eine Möglichkeit, die toxischen Wirkungen von Insektiziden bei topischer Anwendung zu bewerten.

Topischer Test-Assay: Eine Technik zur Bewertung des insektiziden Potenzials von Dopaminrezeptor-Antagonisten bei erwachsenen weiblichen Mücken durch topische Anwendung

Dieses Video zeigt einen Blutfütterungsassay zur Bewertung der Mortalität und Fruchtbarkeit von Testverbindungen mit neuartigen Wirkungsweisen an weiblichen Mücken. Diese Technik hilft beim Screening neuer Klassen von Insektiziden, um die resistente Population von Mücken abzutöten und die Ausbreitung der Krankheit zu kontrollieren.

Mückenfütterungstest: Eine Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Testverbindungen auf die Mortalität und Fruchtbarkeit erwachsener weiblicher Mücken

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Protokolle sind für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien zu unreif und Erwachsene Mücken für Entwicklung als neue Klassen von Larviziden, Adulticides und Endectocides beschrieben. Die Protokolle ermöglichen Hochdurchsatz-Prüfung von mehreren Chemikalien bei Einzelpunkt-Dosis und anschließende Auswertung über Dosis-Antwort-Assay Toxizität auf Kontakt zu bestimmen oder Verschlucken.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

Beschrieben wird eine zeit- und platzsparende Methode zur Zählung von Eiern und zur Bestimmung der Brutraten einzelner Mücken anhand von 24 Brunnengewebekulturplatten, die den Umfang und die Geschwindigkeit von Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests erheblich erhöhen können.

Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Wir beschreiben die Methodik und Bedeutung des topischen Anwendungsbioassays zur Messung der Insektizidempfindlichkeit bei Moskitos und Fruchtfliegen. Der vorgestellte Assay ist ein hoher Durchsatz, verwendet Insektenmasse - so dass eine massenrelativierte tödliche Dosis anstelle der Konzentration berechnet werden kann - und hat wahrscheinlich eine geringere Variabilität als andere ähnliche Methoden.

Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

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Aufgrund ihrer einfachen Anatomie bieten Anopheles-Hoden ein gutes zytologisches Modell für die Untersuchung der Spermatogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung , eine Technik, die zur Untersuchung dieses biologischen Prozesses verwendet wird, sowie den Phänotyp transgener Stämme, die Mutationen in den Genen aufweisen, die an der Spermienproduktion beteiligt sind.

Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Untersuchung der Spermatogenese in der Anopheles-Mücke

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Die sexuelle Entwicklung des Plasmodiums findet im Mitteldarm der Mücke statt. Die sexuellen Stadien des Parasiten ins Visier zu nehmen, ist eine vielversprechende Strategie, um die Übertragung zu blockieren. Wir haben Ookluc entwickelt, eine transgene P. berghei, die nach der Zygotenbildung Nanoluziferase exprimiert und ein Hochdurchsatz-Screening von transmissionsblockierenden Verbindungen ermöglicht. In diesem Artikel werden die Methoden für das Screening mit Ookluc beschrieben.

Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

Erfahren Sie toxikologische Tests mit dem epigenetischen Medikament DZNep an Malariamücken. Diese Methode untersucht Entwicklung, Fruchtbarkeit und Überlebensraten von Anopheles gambiae für neue Vektorbekämpfungsstrategien.

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken (Video) | JoVE Journal

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

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