Expression von fluoreszierenden Proteinen in Branchiostoma lanceolatum Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mRNA, die für ein fluoreszierendes Protein kodiert, in Bronchos-Stoma lancia latam Eizellen einzuführen, um in vivo eine fluoreszierende Bildgebung von sich entwickelnden Embryonen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst durch einen 24-stündigen Temperaturschock das Laichen von reifen Amfiais, Männchen und Weibchen induziert wird. Nach dem Temperaturschock werden Weibchen und Männchen in individuelle Laichbecher gelegt, so dass Eizellen bzw. Spermien entnommen werden können.

Sobald die Zyten in einer mit Polylysin beschichteten Schale aufgereiht sind, wird eine speziell vorbereitete Mikroinjektionsnadel verwendet, um die Lösung in den Kern des Zyten zu injizieren. Der letzte Schritt ist die Befruchtung des Zyten mit ein bis fünf Tropfen Spermien. Letztlich Zwei-Photonen-Laserscanning.

Die Mikroskopie wird verwendet, um die ubiquitäre Expression der fluoreszierenden Proteine zu zeigen, die aus der mikroinjizierten mRNA hergestellt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Mikroinjektionsschritte schwer zu erlernen sind, da die erforderlichen technischen Fähigkeiten nicht detailliert und gedruckt abgedeckt werden können. Bereiten Sie zunächst die mit Polylysin überzogenen Schalen vor, die zur Immobilisierung der Zyten während der Injektion verwendet werden.

Für jede 35-Millimeter-Zellkultur-Petrischale den Boden mit Polylysinlösung bedecken und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Füllen Sie dann die Polylysinlösung in eine andere Schüssel und inkubieren Sie sie erneut fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Lösung und lassen Sie die Petrischalen zwei Stunden lang kopfüber bei Raumtemperatur trocknen.

Lagern Sie das beschichtete Geschirr im trockenen Zustand in einer Plastikfolie bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche. Für die Zubereitung der mit Aros überzogenen Gerichte, die zur Kultivierung von injizierten Embryonen verwendet werden, wird künstliches Meerwasser und Umkehrosmosewasser hergestellt. Als nächstes löste sich Aros auf eine Konzentration von 1% in filtriertem Wasser auf und goss die warme Aros-Lösung schnell von einer Petrischalen in eine andere, um eine sehr dünne Aros-Beschichtung der Schale zu gewährleisten.

Wickeln Sie die beschichteten Schalen in Saran-Folie ein und lagern Sie sie bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst die Injektionsmischung in RNAs und DNA-freiem Wasserphenol vor. Rot färbt die Lösung und ermöglicht die Identifizierung erfolgreich injizierter Embryonen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Mischung, um die Kristalle zu pelletieren, und bewahren Sie sie bis zur Verwendung auf Eis auf. Wenn Sie fertig sind, befüllen Sie eine 10-Mikroliter-Pipette mit 0,5 Mikrolitern der Injektionsmischung und vermeiden Sie dabei den Boden des Röhrchens, wo die Kristalle pelletiert wurden. Füllen Sie die Injektionsnadel auf, indem Sie den 0,5-Mikroliter-Injektionstropfen pipettieren.

In die große Öffnung der Nadel mischen. Bereiten Sie zwei Nadeln vor, falls eine während der Injektion bricht. Bewahren Sie die Nadeln in einem Glas mit Wasser am Boden auf, um ein Verdunsten der Injektion zu verhindern.

Mischen und bei vier Grad Celsius erhitzen. Lassen Sie die Injektionsmischung mindestens eine Stunde lang langsam bis zur Spitze der Injektionsnadel wandern, um die Bildung von Blasen zu minimieren. Um mit der Eizellentnahme und der Spermienentnahme zu beginnen, werden Männchen und Weibchen 24 Stunden lang in einem SW geschockt und dann ein bis zwei Stunden vor dem Laichen in einzelne Becher umgefüllt.

Nach dem Laichen sofort Spermien und Zyten sammeln. Achten Sie darauf, die Erwachsenen beim Einsammeln nicht zu erschrecken. Zusätzliche Bewegung kann sich nach der Entnahme sowohl Spermien als auch Zyten auflösen und somit verdünnen.

Bewahren Sie die Spermien in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis auf und geben Sie die Zyten in gefiltertem SW in vorgespülte Petrischale. Übertragen Sie 100 bis 500 Zyten in eine weitere 35-Millimeter-Petrischale, um die Injektionen durchzuführen. Zum Schluss düngen Sie den Rest des Cyte-Clutches als Kontrolle für die Spermien- und Cytqualität oder für andere Experimente.

Um den Injektionsvorgang zu starten, installieren Sie die Nadel in einem Winkel von 50 Grad relativ zur horizontalen Ebene unter einem fluoreszierenden Präparierskop mit 25 Ex-Okularen, übertragen Sie 30 Zyten auf eine mit Polylysin beschichtete Schale und filtrieren Sie eine SW, um die Verfolgung der injizierten Zyten zu erleichtern. Legen Sie sie geordnet entlang einer Linie ab. Injizieren Sie immer kleine Mengen, um die Exposition zu minimieren.

Zeit bis Polylysin, das dazu neigt, sich entwickelnde Embryonen zu deformieren. Verwenden Sie die Dunkelfeldbeleuchtung, um die Zyten so durchscheinend wie möglich zu machen. Bringen Sie dann die Injektionsnadel mit dem groben Bewegungsknopf in die Nähe eines Zylinders mit feiner Pinzette. Schneiden.

Öffnen Sie die Nadel in der Höhe, auf der sich die Spitze durch Pulsieren mit dem Injektor zu krümmen beginnt. Vergewissern Sie sich, dass die rote Injektionsmischung bei 200-facher Vergrößerung aus der Nadel fließt. Und bewegen Sie mit dem feinen Bewegungsknopf die Injektionsnadel vorsichtig in den Kern des Cyten.

Wenn die injizierte Lösung zwei oberflächlich eingeführt wird, verbleibt sie nicht in der UO-Stelle. Wenn sie zu weit eingefügt wird, wird die UO-Site zerstört. Injizieren Sie mit ein bis drei Impulsen.

Wenn die Nadel fein genug ist, injizieren Sie mit kontinuierlichem Durchfluss bei konstantem Druck. Es ist sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen einem Fünftel bis einem Drittel des Volumens einer einzelnen Eizelle nach der Injektion entspricht. Ziehen Sie die Nadel schnell heraus, um ein Auslaufen zu vermeiden.

Vergewissern Sie sich, dass die injizierte Lösung im Zyten verbleibt und dass sich die injizierte Lösung nach einigen Sekunden im Zyten verteilt. Fahren Sie mit dem nächsten Cyten in der Reihe fort. Bewahren Sie einige nicht injizierte Embryonen jeder Serie als Negativkontrollen auf, um die Hintergrundfluoreszenz beim Scannen nach injizierten Embryonen abzuschätzen, und befruchten Sie die Eizellen, sobald die Serie injiziert wurde.

Da die Qualität der Eizellen mit der Zeit abnimmt, injizieren und befruchten Sie die Zyten innerhalb einer Stunde. Nach dem Laichen. Je nach Spermienkonzentration gibst du ein bis fünf Tropfen Sperma in die UY und schwenkst die Schale.

Die Befruchtungshülle sollte an den Embryonen sichtbar werden. Lassen Sie die Embryonen nach etwa einer Minute von der mit Polylysin überzogenen Schale lösen, während Sie eine weitere Reihe von Eizellen injizieren. Sobald sie abgenommen sind, übertragen Sie die Embryonen in eine mit Aros beschichtete Petrischale.

Nehmen Sie die Embryonen aus der mit Polylysin beschichteten Schale, wenn dies möglich ist. Vor dem Zwei-Zell-Stadium. Im Zweizell- bis Vierzellstadium selektieren Sie erfolgreich injizierte Embryonen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Präparierzielfernrohrs.

Mit einem DSR-Filter wird eine erfolgreiche Injektion durch eine normale Morphologie angezeigt, die ein von Phenolrot abgeleitetes rotes Fluoreszenzsignal aufweist. Bewahren Sie die Embryonen auf und filtrieren Sie sie in agros beschichteten Petrischalen bei 19 Grad Celsius bis zum gewünschten Stadium für die In-vivo-Bildgebung. Diese repräsentativen Bilder von Bronchos stoma lancia lato Embryonen wurden nach Mikroinjektion von mRNAs und Beschichtung fluoreszierender Proteine aufgenommen. Dieses erste Bild zeigt, dass die Expression von nukleärem EGFP, das durch Mikroinjektion eines H zwei B-E-G-F-P-Konstrukts gewonnen wurde, in Embryonen bereits im 16-Zellstadium nachgewiesen werden kann.

Dieser Embryo im Gastrostadium ist ein Beispiel für die ubiquitäre Co-Expression von Kern-M-Kirsche und membran-gerichtetem EGFP. Das Kernsignal resultiert aus der Mikroinjektion eines H-zwei-BM-Kirschkonstrukts, während die Fluoreszenz an den Zellmembranen durch Mikroinjektion eines EEG FP CAAX-Box-Konstrukts erhalten wird. Ein optischer Schnitt dieses Embryos im Gastrostadium zeigt, wie Zellkerne und Zellumrisse durch nukleäres mCherry bzw. membranassoziiertes EGFP hervorgehoben werden.

Die visuelle Demonstration dieser Mikroinjektionstechnik wird Forscher in der evolutionären Entwicklung der Biologie dabei unterstützen, bestehende und neuartige Ansätze für die individuelle Bildgebung, genspezifische Manipulation und Stabilität in AFI, einem wichtigen Modell zum Verständnis der Evolution von Tieren, zu verbessern und zu entwickeln.